出口食品霍乱弧菌的检验方法

出口食品霍乱弧菌的检验方法1．仪器和设备1．1恒温培养箱： 36±1℃1．2恒温水浴箱： 45±1℃1．3高压灭菌锅1．4拍打式均质器1．5菌落计数器1．6试管:18×150mm12mm×100mm1．7锥形瓶:500ml250ml1．8平皿：直径为 90mm1．9灭菌盒和枪头1．10灭菌袋1．11酒精棉1．12天平:感量0.1g1.13冰箱：0-4℃和-15～-20℃2．培养基的制备2．1碱性蛋白胨水称取15g干粉于1000.0ml蒸馏水中，加热溶解，分装，121℃10min高压灭菌。2．2硫代硫酸钠、柠檬酸钠、胆盐、蔗糖琼脂（TCBS）称取89.1g溶于1000.0ml蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，冷至55℃倾注平板备用。2．3三糖铁（TSI）称取65g于1升蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，分装试管12mm×100mm，每管约2～4ml，115℃15分钟高压灭菌，制成高层斜面备用，桔红色。2．4霍乱双糖铁琼脂（KIA）称取64.5g溶于1000.0ml蒸馏水中，加热溶解，分装。121℃15分钟高压灭菌，制成高层斜面备用。2．5TN琼脂11称取35g溶于1000.0ml蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，121℃15分钟高压灭菌。倾注平板备用。在上项成分中改变氯化钠的含量，去除琼脂可制成T1N0和T1N3肉汤。2．6精氨酸葡萄糖斜面琼脂（AGS）称取58g溶于1000.0ml蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，分装，121℃15分钟高压灭菌，制成高层斜面备用。2．7O/F实验用培养基（HLGB）称取45.5g溶于1000.0ml蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，分装，每管3ml（有的加矿物油覆盖）121℃15分钟高压灭菌备用。2．8赖氨酸脱羧酶肉汤生化管2．9MR-VP肉汤生化管3.1样品的分离培养和初步鉴定:以无菌操作取25g样放入装有225ml生理均质1分30秒，制用灭菌枪头吸取1ml品盐水的无菌袋内，成1：10的样品匀液均质好的样液放入9ml碱性蛋白胨36±1℃培养18~24h接种TCBS琼脂,36划线接种于TN琼脂11水中±1℃培养12~18h36±1℃培养12~18h以无菌白色滤纸沾滴加氧化酶试剂进用接种环取氧化酶0.5％去氧胆酸钠液T1N1琼脂表面培养物行氧化酶试验阳性培养物滴中进行粘丝试验以接种针取氧化和粘丝试验阳性物

酶

接种 TSIAGS，

、KIA

和

穿刺底层并划线面

斜

在取氧化酶和粘试验阳性培养物

丝接种

T1N0

和

T1N3肉

将

TSI

、KIA、AGS、

于 36±

1℃培养汤

T1N0、T1N3肉汤

18~24h注：霍乱弧菌菌落特征形状大，光滑，黄色，稍平，具有不透明中心和半透明的边缘。霍乱弧菌初步鉴定试验中的反应KIATSITNTN斜面底层斜面底层斜面底层1013霍乱弧A(K少见)AAa＋＋菌注：K-碱性；A-酸性；a-微酸性。霍乱菌属细菌在 TSI、KIA、AGS中不产H2S，也不产气。一些气单胞菌属菌株可能产气。3．2确认试验以接种环取初步鉴定试验符合霍乱弧菌反应的 T1N3培养物，分别接种到以下培养基：Hugh-Leifson 葡萄糖肉汤（ HLGB），36±1℃培养18~24h。ONPG胨水，36±1℃培养1h～3h或24h。赖氨酸脱羧酶肉汤， 36±1℃培养24~96h。阿拉伯糖肉汤， 36±1℃培养24h。O/129试验用培养基，36±1℃培养18~24h。霍乱弧菌的生化反应表生化项目生化性状生化项目生化性状TCBSYD-甘露糖＋AGSKa氧化酶ONPG＋Nacl0％＋V-Pv3％＋精氨酸双水解酶－6％－赖氨酸脱羧酶＋8％－鸟氨酸脱羧酶＋10％－抑菌试验42℃生长＋10ugO/129S蔗糖－150ugO/129SD-纤维二糖－明胶酶＋乳糖－尿素酶－阿拉伯糖－注：Y-黄色；K-碱性；＋-80％或更多的菌株阳性；－-80％或更多的菌株阴性；v-依据种或菌株的可变反应；S-敏感；AGS-精氨酸-葡萄糖斜面。所有试验均不产H2S和气体。4．血清学凝集试验4．1自分离培养基上挑取可疑菌落与O1群霍乱弧菌诊断血清做玻片凝集试验。如可疑菌落在诊断血清中很快（一般在10s）出现肉眼可见的明显凝集，在生理盐水中不凝集者判为阳性。5报告结果霍乱弧菌的检出，可依据以下性状报告：革兰氏染色阴性，无芽孢或弯曲杆菌；TSI：斜面产酸/底层产酸，不产气，不产H2S；Hugh-Leifson试验：葡萄糖发酵阳性；氧化酶：阳性；精氨酸脱羧酶试验：阴性；赖氨酸脱羧酶试验：阳性；42℃生长：阳性；嗜盐性试验：0％Nacl＋(有的非O1群霍乱弧菌不生长 )3％Nacl＋6％Nacl－蔗糖发酵：阳性