在基因水平诊断疾病课件

GeneDiagnosisfanh@1nucleusGeneDiagnosis

transcriptiontranslationFourtypesofdiagnosisClinicalmanifestationBiologicalDiagnosis

SerumDiagnosis

ClinicalDiagnosis

基因诊断的基本概念nucleusGeneDiagnosis

transcriptiontranslationFourtypesofdiagnosisClinicalmanifestationBiologicalDiagnosis

SerumDiagnosis

ClinicalDiagnosis

定义：应用分子生物学技术,

在DNA或RNA水平，通过检测致病基因（内源或外源）的存在、基因结构缺陷或表达异常，对人体状态和疾病作出诊断的方法。2第一节基因诊断的基础

一、概念

与传统诊断的区别：直接以病理基因（致病基因、疾病相关基因和外源性病原生物基因等）为分析对象，即对待诊生物材料某一（些）特定基因进行分析判断。3基因诊断的特点

1．属于“病因诊断”，针对性和特异性强。

2．特异性和灵敏度高，微量标本即可进行诊断。

3．检测标本适应性广。

4．诊断感染性疾病早期、快速第一节基因诊断的基础4DNA或RNA水平变化：相关基因序列的有无受累基因表达的高低病毒基因及其转录产物在体内从无到有癌基因表达水平从低到高等；基因结构变化即突变：点突变引起基因失活、染色体转位引起基因异常激活或灭活。第一节基因诊断的基础目标序列的识别和定性定量分析是基因诊断的基础51.DirectlyDetection:knownabnormalgenedotmutationdeletioninsertion

2.IndirectlyDetection:unknownabnormalgeneDNAmarker

DNApolymorphismLinkageanalysisGeneDiagnosis6核酸分子杂交和PCR扩增是基因诊断的基本技术核酸分子杂交可进行基因的特异的特异识别和分析。PCR可进行已知序列或已知部分序列基因的检测。二、基因诊断的常用技术第一节基因诊断的基础7第一节基因诊断的基础二、基因诊断的常用技术（一）核酸杂交81.制备合适的探针是核酸杂交用于基因诊断的关键

Whatisaprobe?

标记的已知序列核酸片段，包括DNA,cDNA,RNA,Oligonucleotide第一节基因诊断的基础二、基因诊断的常用技术

针对具体情况选择合适的探针序列是基因诊断准确、特异、简便、可靠的基础。（一）核酸杂交91.制备合适的探针选择探针的原则：致病微生物核酸中最保守、最特异的序列突变基因中含突变位点或突变区的序列待测基因编码的mRNA序列等第一节基因诊断的基础二、基因诊断的常用技术

针对具体情况选择合适的探针序列是基因诊断准确、特异、简便、可靠的基础。102.不同形式的核酸分子杂交

Southernblot

Northernblot

dothybridization

reversedothybridizationFISH:fluorescenceinsituhybridization第一节基因诊断的基础二、基因诊断的常用技术11SouthernblotNorthernblotDotblotInsituhybridization检测对象DNARNADNA/RNADNA/RNA优点特异DNA片段，测定分子量基因突变分析定性、定量分析定性、定量分析定位定性定量缺点不能定量不能定位不能确定分子量，特异性不好2.不同形式的核酸分子杂交12第一节基因诊断的基础二、基因诊断的常用技术（二）PCR技术是基因诊断的一种基础技术。

PCR在基因诊断中的作用从极少样品即可扩增出肉眼可见的产物。放大待诊信号，提高检测灵敏度

13

为适应DNA诊断的需要，除上述常规PCR外，又逐步发展了不同目的特殊类型的PCR技术：（1）

长片段PCR（longfragmentPCR）（2）

锚定PCR（anchoredPCR）（3）

嵌套式PCR（nestingPCR）（4）

多重PCR（multiplexPCR）（5）多重等位基因PCR（multiplexallelePCR）（6）

不对称PCR（asymmertricPCR）（7）

反向PCR（inversePCR）（8）

原位PCR（insituPCR）（9）

定量PCR（quantitativePCR）

(10)逆转录PCR（reversetranscriptionPCR，RT-PCR）聚合酶链式反应14（二）

PCR技术

PCR及其衍生技术直接运用PCR扩增：异常缺失与存在PCR产物的限制性酶谱分析（PCR-RE)和限制性片段长度多态性分析（PCR-RFLP)RFLP:RestrictionFragmentLengthPolymorphism

15（二）

PCR技术

PCR及其衍生技术

PCR－RFLP：通过PCR将包含待测位点的DNA片段扩增后，用识别相应位点的限制性核酸内切酶水解，根据所产生限制性片段的数量和长度作出诊断。用于已知突变位点的验证性诊断

16（二）

PCR技术

PCR及其衍生技术3.PCR-等位基因特异性寡核苷酸探针斑点杂交(PCR-ASO，PCR-DB)

ASO:AlleleSpecificOligonucleotide1).wildprobevsmutantprobe2).已知突变的验证性检测

3).可区分纯合子和杂合子

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PCR及其衍生技术4.PCR-单链构象多态性分析（PCR-SSCP)

将PCR产物变性为单链后进行非变性（中性）聚丙烯酰胺凝胶电泳，单个核苷酸的改变即可造成DNA单链构象的改变，进而导致电泳速率变化，从而检测出基因突变。1）单链核酸碱基-构象-电泳速率2）中性聚丙烯酰胺凝胶电泳

（二）

PCR技术18PCR-SSCP分析原理示意19

PCR及其衍生技术

5.PCR-变性梯度凝胶电泳分析（PCR-DGGE）DenaturingGradientGelElectrophoresis（二）

PCR技术20

PCR及其衍生技术7.甲基化特异性PCR

MethylationspecificPCR,MS-PCR模板甲基化处理：Na2SO3C-U需设计特异性甲基化引物G:C/A:U（二）

PCR技术21

3’GGACGTAGA5’非甲基化引物5’---CCTGCATCT-------GCGCTAGGC----3’3’---GGACGTAGA-------CGCGATCCG---5’5’GCGCATGGC3’

3’AAACATAAA5’甲基化引物5’---UUTGUATUT-------GCGCTAGGC----3’3’---GGACGTAGA-------AUGUGATUU---5’5’TACACATAA3’223’GGACGTAGA5’5’---CCTGCmATCT-------GCGCTAGGC----3’3’---GGACGTAGA-------CGCGATCmCmG---5’5’GCGCATGGC3’3’AAACATAAA5’5’---UUTGCmATUT-------GCGCTAGGC----3’3’---GGACGTAGA-------UGUGATCmCmG--5’5’ACACATAAC3’若存在甲基化位点

23

PCR及其衍生技术8.靶核酸的定量分析

Q-PCR,QuantitativePCR

基本原理：PCR指数扩增规律

N=N0(1+E）n

（二）

PCR技术24

PCR及其衍生技术8.靶核酸的定量分析

（1）测定PCR产物量：

梯度（系列）稀释法：先对已知量的靶

DNA进行梯度稀释（类似于比色）灰度扫描法

（二）

PCR技术25

PCR及其衍生技术8.靶核酸的定量分析

（2）极限稀释法基本依据：PCR扩增的有效起始模板分子数为104～106个

（二）

PCR技术26

PCR及其衍生技术8.靶核酸的定量分析（3）非竞争性对照法基本依据：同时扩增靶序列和内标序列（扩增效率相似）如看家基因（housekeeper)用于RT-PCR进行表达分析

（二）

PCR技术27

PCR及其衍生技术8.靶核酸的定量分析

（4）竞争抑制法需制备标准参照核酸

（二）

PCR技术28

PCR及其衍生技术8.靶核酸的定量分析（5）荧光标记探针法分析：安全、简便快捷、多重检测

荧光定量PCR

实时(realtime)PCR

29（三）DNA序列测定是最直接、最准确的基因诊断技术第一节基因诊断的基础二、基因诊断的常用技术30（四）DNA芯片技术是应用前景广阔的基因诊断技术（DNAchips)第一节基因诊断的基础二、基因诊断的常用技术生物芯片（biochip&bioarray)技术：根据生物分子间特异性相互作用，将生化分析过程集成于芯片表面，从而实现对DNA、RNA、多肽、蛋白质等各种生物成分的高通量快速检测分析。疾病诊断芯片个性化用药芯片31四、基因芯片（genechip）

生物芯片(biochip)

应用微电子工业加工工艺，在玻璃、塑料、硅片等材料上加工出用于生物样品分离、反应或分析的微细结构。

目前主要有两大类：

1.生物活性微阵列(bioactivemicroarray)2.基因芯片(genechip),DNA微阵列(DNAmicroarray)

包括多肽、蛋白质、病毒、细胞等。蛋白质芯片可直接从体液中检测生物分子（免疫芯片只需少量样品可一次完成对成千上万种抗原或抗体等致病因素或生物样品的检测分析)。为最重要的生物芯片，广泛用于基因表达谱分析、新基因发现、基因突变及多态性分析、疾病诊断、药物筛选、基因测序等。32DNAmicroarray33三.基因诊断有其独特的优点高特异性：诊断目标高灵敏度：分子生物学方法结果稳定可靠：核酸的化学本质早期诊断性：分子遗传学规律应用广泛性：疾病与非疾病检查第一节基因诊断的基础34基因诊断技术途径：①直接分析致病基因分子结构及表达是否异常的直接诊断途径；②利用多态性遗传标志与致病基因进行连锁分析的间接诊断途径。第四节遗传病的基因诊断35直接诊断：检测已知致病基因必要条件①被检基因的突变类型与疾病发病有直接的因果关系：②被检基因的正常分子结构已被确定；③被检基因突变位点固定而且已知。第四节遗传病的基因诊断36

检测是否存在已知的突变。适用于对发病具有直接因果关系的致病基因已明确，对致病基因的序列结构已完全或部分了解，分子机制已完全或部分清楚者。

常用方法：

1.限制性酶切片段分析法

适用于基因内的较大片段或位于酶切位点上的点突变

2.寡核苷酸探针斑点印迹杂交分析法。适用于检测各种点突变，特别是不在酶切位点上的点突变。

（一）基因突变的直接检测371、限制性酶切图谱直接分析法

导致某一限制酶识别位点移位的大片段缺失或插入，

导致某一限制酶识别位点丧失或获得的点突变，均可引起相应限制性片段的长度和数量发生变化。分析限制性酶切图，即可诊断出此类突变。38镰状细胞贫血：b-珠蛋白基因第六密码子

GAG(Glu)→GTG(Val)MstIICCTNAGGbA

CCTGAGGAG1.15kb0.2

bS

CCTGTGGAG

1.35kb

1.15kb1.35kbbA/

bSbAbS（1）导致某一限制性位点丧失或获得的点突变39

b-地中海贫血：b-珠蛋白基因3'末端缺失0.6kb||

BgIIIBgIII5.2kb||

BgIIIBgIII4.6kb

HomoHeteroNormal5.2kb4.6kb（2）导致某一限制性位点移位的大片段缺失或插入40

如果特定的限制酶识别位点周围的DNA序列已知，即可应用PCR简便地检测出这些限制酶识别位点的存在或丢失以及相应限制性片段的长度和数量发生变化，称为PCR-RFLP分析法。

H-ras基因第12密码子点突变：GGC-->GTC

CCGGCCCGTC

HpaII

38bp100bpx138bp

411.点突变：（2）无限制性酶切位点改变直接诊断：检测已知致病基因

PCR-ASO斑点杂交或反向斑点杂交及等位基因特异PCR（allelespecificPCR，AS-PCR）或称为等位基因特异性扩增（ASA）等技术。

PCR-ASO斑点杂交或反向斑点杂交技术可快速、简易地检测已知突变。

42寡核苷酸探针斑点印迹杂交分析法受检者基因组DNA或含突变位点的PCR扩增产物与标记的ASO探针杂交主要适用于检测已知点突变ASO1ASO2NormalHeteroHomo43镰状细胞贫血：

b-珠蛋白基因点突变

GAG(Glu)-->GTG(Val)

bA

probeACTCCTGAGGAGAAGTCTGCC

bSprobeACTCCTGTGGAGAAGTCTGCC

HeterobA

probebSprobeHomoNormal44ASOPKU，ARNormalprobeMutationprobe？45间接诊断：检测与致病基因连锁的遗传标志DNA多态性：指群体中的DNA分子存在至少两种不同的类型，即个体间同一染色体的相同位置上DNA核苷酸序列存在一定的差异或变异。第四节遗传病的基因诊断46多态性在人群中出现的频率应大于1%（如小于1%常认为是异常突变）。在生物进化过程中形成的，它本身并不致病或于遗传病有直接联系，故称为“中性突变”。人类的23对染色体中，每一条上都带有许多遗传多态性位点，其中一些位点在染色体上的位置与致病基因靠的很近，甚至连锁在一起遗传，并且呈孟德尔式遗传。因此，可利用这一多态性位点作为遗传指示标记。

第四节遗传病的基因诊断47

同一染色体上两个或以上基因或位点，位置上互相靠近并且共分离的现象称为遗传连锁。将与致病基因连锁的某种多态性标志作为遗传标志，在同一个家系成员中探查是否存在致病基因的方法即为基因连锁分析法（Linkageanalysis）。

（二）基因连锁分析48间接诊断：检测与致病基因连锁的遗传标志三代遗传标志：

1.RFLP2.STR(shorttandemrepeats),

VNTR(variablenumberoftandemrepeats)3.SNP(singlenucleotidepolymorphism)第四节遗传病的基因诊断49DNApolymorphismmarksystem:1.RestrictionFragmentLengthPolymorphysm(RFLP)

MostofRFLPsdonotrepresentamutationbutalinkagemark

EcoR1SiteSouthernblot

threedifferentmoleculargenotypespolymorphicsite*(About100,000RFLPsinhumangenome)第四节遗传病的基因诊断502.Microsatellitemarkers

VariableNumberofTandemRepeats(VNTRs)

2~4bpShortTandemRepeats(STR)

threedifferentmoleculargenotypespolymorphicsequencesPCRproducts(Atleast650,000RFLPsinhumangenome)第四节遗传病的基因诊断51DNA指纹分析用于个体鉴定

52ATGGTAAGCCTGAGCTGACTTAGCGT-ATATGGTAAACCTGAGTTGACTTAGCGTCAT

SNPSNPinsert3.Singlenucleotide

polymorphysms(SNPs)

Singlebase-pairdifferencesbetweenindividualsareprettycommonandeasytofindincontrasttoRFLPsandVNTRs(thereare1,400,000SNPsinhumangenome,about1in1000bp)第四节遗传病的基因诊断53第五节肿瘤的基因诊断肿瘤基因诊断的内容基础：肿瘤发病分子机制深入探索临床：早期及预警诊断易感性评估及监测肿瘤的鉴别、分级、分期及预后辅助治疗方案确定疗效监测及评估54

95%慢性髓细胞性白血病患者存在异常的Ph染色体，其成因是染色体易位使9号染色体上的原癌基因abl易位至22号染色体的bcr基因附近，产生bcr-abl融合基因； 几乎100%急性早幼粒性白血病，表现为15号染色体上的PML基因与17号染色体上的维甲酸受体（RARa）基因连接，形成

PML-RARa融合基因。融合基因检测方法：一般采用PCR技术

例如,用分别位于bcr和abl基因的一对特异引物作PCR，只有当abl基因易位至bcr基因附近时才能获得扩增产物。策略一：易位染色体和融合基因检测55Ph1染色体酪氨酸蛋白激酶活性56第五节肿瘤的基因诊断策略二：癌基因和抑癌基因检测

如原癌基因K-ras第12、13和61位密码子点突变：GGT-TGT/GTT/GAT/GCT；抑癌基因p53密码子130～290之间的基因突变

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