植物的组织培养菊花

一、配制培养基二、无菌操作三、无菌培养四、观察记录

※上交实验报告时间：第15周

实验安排本周六下午2：30；3：30。本周（第九周）（11.5－11.9）第11、12、13、14周每周进行观察（11.19－12.14）第一页，共二十九页。

（1）深刻理解植物组织培养的基本概念和理论依据。（2）训练利用实验室的条件来合理设计和完成实验的基本技能。实验目的第二页，共二十九页。

植物组织培养就是将植物离体的生活部分（如器官、组织、细胞甚至原生质体等）通过无菌操作接种在适宜的培养基上，在人工控制的条件（如温度、光照、湿度等）下进行培养的技术。

理论依据：植物细胞的全能性。植物体的每一个细胞都携带着一套完整的基因组，并具有发育成完整植株的潜在能力。实验原理第三页，共二十九页。完整植株脱分化再分化外植体愈伤组织芽、根实验设计的依据依据一分化第四页，共二十九页。植物组织培养的过程接种脱分化再分化愈伤组织外植体再分化冲洗表面消毒第五页，共二十九页。

培养基中植物生长物质的种类和浓度在脱分化和再分化中起重要作用，尤其是生长素和细胞分裂素类的比例。实验设计的依据依据二生长素类/细胞分裂素类高诱导根的分化中愈伤组织生长不分化低诱导芽的分化第六页，共二十九页。①MS培养基的大量元素；②MS培养基的微量元素；③MS培养基的铁盐；④有机附加成分；⑤2,4-D、NAA、6-BA；⑥蔗糖、冷凝脂；⑦0.1mol/LNaOH和0.1mol/LHCl。条件一：实验药品实验条件第七页，共二十九页。条件二：实验仪器及设备

①烧杯、移液器、量筒、精密电子天平、三角瓶、pH试纸、封口膜等；②高压灭菌锅；③无菌操作间、超净工作台；④能够控制光照和温度条件的培养室。实验条件第八页，共二十九页。要求

1.以菊花无菌苗为材料进行以下培养基的设计。（1）诱导菊花无菌苗叶片形成愈伤组织（2）诱导菊花无菌苗茎段形成苗实验设计第九页，共二十九页。菊花无菌苗实验材料第十页，共二十九页。具体做法全班分成小组，根据设计要求结合实验原理、设计依据及已提供的实验条件，在查阅资料的基础上，合理设计实验（主要对培养基进行设计）。设计出初步方案后，每组推选一名代表向全班汇报设计的原理、方案和预期的结果；再经全班讨论确定最后的设计方案。第十一页，共二十九页。

全班分成6个小组，按照要求经查阅资料、代表汇报和全班讨论，最后确定设计的培养基如下（MS为基本培养基）：

1.诱导菊花无菌苗叶片形成愈伤组织（1）MS+6-BA1+NAA0（1组，7人）（2）MS+6-BA1+NAA2（2组，7人）（3）MS+6-BA1+NAA4（3组，7人）

2.诱导菊花无菌苗茎段形成芽（4）MS+6-BA0+NAA0.2（4组，7人）

（5）MS+6-BA0.2+NAA0.2（5组，7人）（6）MS+6-BA2+NAA0.2（6组，7人）

根据设计的培养基，利用提供的实验条件，我们将按照下列步骤完成实验。第十二页，共二十九页。

一、配制培养基二、无菌操作三、无菌培养四、观察记录实验步骤第十三页，共二十九页。一、配制培养基

1.配制母液实验步骤①MS培养基的大量元素母液（20×）；②MS培养基的微量元素母液（100×）；③有机附加成分母液（100×）；④肌醇母液（100×）；⑤MS培养基的铁盐母液（200×）；⑥6-BA、2,4-D、NAA母液(0.5mg/mL)。第十四页，共二十九页。2.配制培养基

各个小组根据自己的设计方案进行。

要求：每一种培养基400mL，分装10瓶，每瓶40mL，每瓶做好标记，如：1，2，……。（1）加溶液。顺序为：大量元素→微量元素→附加成分→肌醇→铁盐→植物生长调节剂→蔗糖→冷凝脂（2）搅拌混匀;

（3）定容至400mL；（4）调pH值至5.8~6.2；（5）分装、封口。

3.培养基灭菌高压灭菌(压力1.1kg/cm2,

121℃,20min

)。湿热灭菌第十五页，共二十九页。各物质加入量：

400mL①大量元素母液（10×）100mL/L--40mL;

②微量元素母液（100×）10mL/L--4mL；③有机附加成分母液（100×）10mL/L--4mL

；④蔗糖(30g/L)、冷凝脂(6g/L)12g、2.4g;⑤肌醇母液（100×）10mL/L--4mL；⑥铁盐母液（200×）5mL/L--2mL；⑦6-BA、2,4-D、NAA母液(0.5mg/mL)第十六页，共二十九页。编号培养基组成（mg/L）各物质加入量（mL/400mL）6-BANAA1MS+6-BA1+NAA00.802MS+6-BA1+NAA20.81.63MS+6-BA1+NAA40.83.24MS+6-BA0+NAA0.200.165MS+6-BA0.2+NAA0.20.160.166MS+6-BA2+NAA0.21.60.16表培养基中植物生长调节剂加入量第十七页，共二十九页。第十八页，共二十九页。二、无菌操作

1.接种前的准备（1）空间灭菌(30min)。无菌操作间和超净工作台。开紫外灯→开鼓风机→关紫外灯→10min后→开日光灯。（2）操作人员的准备剪指甲→用肥皂彻底洗手3~5次→自然风干→进操作间→用70~75%酒精反复檫手(图)。（3）器具灭菌实验器械的消毒灭菌（图）。第十九页，共二十九页。2.接种（1）切取材料左手持镊，右手持刀→切取材料→叶片：0.5cm×0.5cm，茎段带一个腋芽。第二十页，共二十九页。

（2）接种取三角瓶→打开封口膜→接种叶块：正接，每瓶3块茎段：形态学下端插入培养基，每瓶3个

（3）重新封口（4）做标记班级，日期第二十一页，共二十九页。三、无菌培养将接种好的三角瓶置于培养室进行培养。培养条件：光/暗=14h/10h；

T=25℃；

RH(relativehumitidy)=70~80%四、观察记录

第二十二页，共二十九页。

在培养过程中，每周定时观察记录实验结果1次。内容：（1）污染率污染率(%)=(污染的瓶数/接种瓶数)×100%

（2）愈伤组织形成的时间、部位、颜色、大小、形状，计算出愈率。出愈率(%)=(产生愈伤组织的叶块数/接种的叶块数)×100%

（3）芽形成的时间、芽数、叶数、丛生芽数，计算出芽率。出芽率(%)=(出芽的茎段数/接种的茎段数)×100%第二十三页，共二十九页。（1）比较不同的培养基对愈伤组织形成的影响；（2）比较不同的培养基对芽形成的影响。结果分析与讨论第二十四页，共二十九页。※你认为组织培养获得成功的关键因素有哪些？思考题第二十五页，共二十九页。

本次实验历时6周，在此过程中大家经历了大量查阅资料，精心设计方案，认真动手操作，仔细观察记录，全面总结分析等各个环节。通过该过程，培养了科学态度和团队合作精神，提高了设计实验、实际动手操作和分析解决问题的能力。因此，本实验达到了预期的目的。总结第二十六页，共二十九页。序号培养基接种数/个污染率/%愈伤组织诱导率/%苗诱导率/%愈伤组织或苗的生长情况123456

植物生长调节剂对菊花愈伤组织及苗诱导的影响（d）第二十七页，共二十九页。第二十八页，共二十九页。内容总结