固相膜免疫测定详解演示文稿

固相膜免疫测定详解演示文稿第一页，共四十二页。（优选）固相膜免疫测定第二页，共四十二页。随着免疫学技术和相关生物化学技术的发展，检测方法上派生出了多种类型的固相膜免疫快速检测试验。该类试验的最大特点是不需要大型设备，对检测人员稍加培训即能掌握操作要求和判定标准。第三页，共四十二页。第一节概述标记免疫测定放射免疫测定1960’酶免疫测定1970’荧光免疫测定1980’－1990’化学发光免疫测定1990’－膜固相免疫测定1990’－第四页，共四十二页。一、免疫测定分类免疫浊度测定Ag+AbAgAb+Ab标记免疫测定Ag+Ab*AgAb*+Ab*（B）（F）第五页，共四十二页。二、免疫测定原理利用抗原抗体反应检测标本中微量物质抗原+抗体抗原抗体复合物Ag+AbAg*Ab第六页，共四十二页。三、固相免疫测定B与F分离

Ab*Ab*Ag+Ag+Ab*AbAb第七页，共四十二页。四、固相膜的特点多孔性

毛细管作用非共价键高度吸附抗体或抗原

高度敏感性易于漂洗

操作简便第八页，共四十二页。五、常用的固相膜玻璃纤维素(fiberglass)膜尼龙(nylon)膜聚偏氟乙稀(polyvinylidenefluoride，PVDF)膜硝酸纤维素（nitrocellulose，NC）膜第九页，共四十二页。六、固相膜的技术要求孔径：0.2~0.6μm流速：以ml/cm2/min表示蛋白质结合力：吸附力很强，以μg/cm2表示均一性第十页，共四十二页。固相NC膜第十一页，共四十二页。第十二页，共四十二页。第十三页，共四十二页。第二节免疫金标记技术

免疫金标记技术(Immunogoldlabellingtechique)

主要利用了金颗粒具有高电子密度的特性，在金标蛋白结合处，在显微镜下可见黑褐色颗粒，当这些标记物在相应的配体处大量聚集时，肉眼可见红色或粉红色斑点，因而用于定性或半定量的快速免疫检测。这一反应也可以通过银颗粒的沉积被放大，称之为免疫金银染色（immunogoldsilverstaining，IGSS）。第十四页，共四十二页。一、胶体金制备

胶体金（colloidalgold）的制备一般采用还原法，常用的还原剂有柠檬酸钠、鞣酸、抗坏血酸、白磷、硼氢化钠等。向一定浓度的金溶液内加入一定量的还原剂使金离子还原成金原子，形成金颗粒悬液，也称金溶胶（goldsolution）。第十五页，共四十二页。胶体金的制备及特性胶体金粒径1%柠檬酸钠加入量胶体金特性（nm)（ml)*呈色lmax(nm)162.00橙色51824.51.50橙红色522411.00红色52571.50.70紫色535*还原100ml0.01%HAuCl4所需量第十六页，共四十二页。胶体金（ColloidalGold）

15~60nm优质劣质第十七页，共四十二页。胶体金结合物（Conjugate）第十八页，共四十二页。膜固相免疫测定的特点第三节膜载体免疫测定的种类与原理优点不足之处简便，快速敏感度略低，价格略高（与ELISA比）单份测定精密度较差，质控困难保存期长（优质试剂）稳定性较差（普通试剂）可测定物范围广（主要为定性试验）不易制备定量、半定量试剂感染性疾病的诊断妊娠、排卵的诊断肿瘤标志心肌标志滥用药物第十九页，共四十二页。固相微孔膜测定种类斑点金免疫渗滤试验(dotimmunogoldfiltrationassay,DIGFA)免疫层析试验（immunochromatographyassay,ICA）斑点ELISA

(dotenzymelinkedimmunosorbentassay,Dot-ELISA)酶联免疫斑点试验(enzymelinkedimmunospot,ELISPOT)

免疫印迹法(immunoblottingtest,IBT)

放射免疫沉淀试验(radioimmunoprecipitationassay,RIPA)

第二十页，共四十二页。一、免疫渗滤测定(IFA)第二十一页，共四十二页。IFA——双抗体夹心法测抗原AB第二十二页，共四十二页。IFA——结果判断第二十三页，共四十二页。二、免疫层析测定（ICA）第二十四页，共四十二页。ICA试剂条样品垫结合物垫NC膜吸水垫第二十五页，共四十二页。ICA——双抗体夹心法测抗原第二十六页，共四十二页。ICA——间接法测抗体第二十七页，共四十二页。ICA结果观察

阳性阴性无效第二十八页，共四十二页。IFA与ICA的比较IFAICA试剂形式渗滤装置及附加试剂试剂条试剂保存4~8℃6个月室温一年操作步骤3~51观察时间3min3~20min阳性反应颜色浓度操作结束颜色不变颜色逐渐加深第二十九页，共四十二页。IFA穿流（FLOWTHROUGH）ICA横流（LATERALFLOW）第三十页，共四十二页。GIFA技术的发展（间接法测抗体）阳性阴性固相膜固相抗原待测抗体金标记抗人IgG抗体人IgG固相抗人IgG抗体快速检测（渗滤法）原理图第三十一页，共四十二页。GIFA技术的发展第一代1988HIVCHEK（DuPont）单点，5~10分钟，血清，金标试剂瓶装冻干品改进抗原HIV1+2，提高敏感度和特异性，缩短反应时间，减少步骤，样品多样化。第八代INSTANTCHEKHIV1+22点（测试+控制）金标试剂：单人份、液体样品：血清、血浆、全血、尿液第九~十二代研制中单一试剂第三十二页，共四十二页。ICA技术的发展1990年ABBOTT公司胶体硒标记ICAUnipath公司CLEARVIEW立明衣原体彩色胶乳标记ICAROCHECardiacReaderTnT定量0.1~3ng/ml合成TnT质控点第三十三页，共四十二页。IFA肌红蛋白双孔法

S：测定孔C：定量质控100μg/LIFA微量白蛋白单孔法

T：测定孔C1：定量质控30mg/LC2：定量质控200mg/L结果判定：（-）<30（+）30~100、（++）100～200（+++）>200mg/LICA甲胎蛋白（AFP）参考值：30μg/L肝癌诊断值：>400μg/L结果判定：（-）<30（+）30~200（++）200~400（+++）>400μg/LSCTC2C1测定线对照线半定量测定第三十四页，共四十二页。三、斑点酶免疫吸附试验

——Dot-ELISA第三十五页，共四十二页。四、酶联免疫斑点试验

——ELISPOT20世纪80年代，国外的科研工作者根据ELISA技术的基本原理，建立了体外检测特异性抗体分泌B细胞和细胞因子分泌T细胞的酶联免疫斑点试验(enzymelinkedimmunospot,ELISPOT)。第三十六页，共四十二页。ELISPOT检测原理

细胞受到刺激后局部产生细胞因子，此细胞因子被特异单克隆抗体捕获。细胞分解后，被捕获的细胞因子与生物素标记的二抗结合，其后再与碱性磷酸酶标记的亲和素结合。BCIP/NBT底物孵育后，PVDF孔板出现“紫色”的斑点表明细胞产生了细胞因子，通过CTL公司生产的ELISPOT酶联斑点分析系统对斑点的分析后得出结果。第三十七页，共四十二页。第三十八页，共四十二页。ELISPOT分析仪解决以下问题哪些斑点是抗原特异性T细胞产生的（此斑点具有进一步分析价值），哪些是无关细胞产生的（此斑点