胚胎植入前遗传学诊断课件

胚胎植入前遗传学诊断胚胎植入前遗传学诊断内容概要植入前遗传学诊断（PGD）的概念PGD检测流程及关键技术FISH-PGD全基因组扩增基于全染色体筛查的PGD/PGS单基因病-PGDPGD的产前诊断管理植入前遗传学诊断(PGD

)的概念植入前遗传学诊断的临床应用植入前遗传学诊断的管理内容概要植入前遗传学诊断（PGD）的概念PGD的产前诊断管理一、植入前遗传学诊断的概念一、植入前遗传学诊断的概念遗传病的生殖干预：健康孩子不孕症ART助孕/其它治疗遗传性出生缺陷产前诊断/植入前诊断/供精/供卵/抱养/其它治疗遗传检测没有异常有异常自然流产遗传病的生殖干预：健康孩子不孕症ART助孕/其它治疗遗传性出（1）定义PGD胚胎植入前遗传学诊断

(Preimplantation

Genetic

Diagnosis)，又称为孕前遗传学诊断(preconception

genetic

diagnosis)。指在胚胎植入前，利用DNA分析技术对显微活检的胚胎细胞进行染色体异常或遗传性疾病进行诊断，选择正常的胚胎植入。PGS胚胎植入前遗传学筛查(PreimplantationGenetic

Screening)。指胚胎植入着床之前，对早期胚胎进行染色体数目和结构异常的检测，当前指通过一次性检测胚胎23对染色体的非整倍体，挑选正常的胚胎植入子宫，提高患者正常的临床妊娠率，降低流产率，降低多胎妊娠率。（一） PGD/PGS的概念（1）定义（一） PGD/PGS的概念高风险PGD(Preimplantationgeneticdiagnosis，PGD)低风险PGD(preimplanta-tiongeneticscreening，PGS)PGD

分类高风险PGD(PreimplantationgenPGD/PGS逐渐被PGT取代PGT

(Preimplantation

Genetic

testing)：是一个广义的术语，指在胚胎植入前，利用显微技术和DNA分析技术对胚胎的染色体异常进行检测，选择正常的胚胎植入。包括针对基因异常和染色体异常进行的植入前遗传学诊断（PAT-M

和

PGT-SR）和植入前遗传学筛查（

PGT-A）。BrezinaPR,BrezinaDS,Kearns

WG.Preimplantationgenetictesting.

2012，BMJPGD/PGS逐渐被PGT取代PGT(PreimplantPGT

的分类和适应症有已知单基因遗传病⽣育史或家族史的夫妇；HLA配型选择；有明确的遗传性肿瘤易感基因突变的携带者或患者；夫妻双⽅或之⼀携带有染⾊体异常；包括染⾊体的结构异常和数⺫异常，常⻅的包括平衡易位携带者，罗⽒易位携带者等⾼龄孕妇(年龄≥35岁)，反复⾃然流产史(⾃然流产≥3次)，反复胚胎种植失败(失败≥3次)，PGT的分类和适应症有已知单基因遗传病⽣育史或家族史的夫妇预防遗传性出生缺陷的积极性优生策略克服宫内产前诊断所带来的选择性流产；减少遗传性出生缺陷；提高正常妊♘率，降低自然流产率。

（2）意义 植入前诊断传统的产前诊断预防遗传性出生缺陷的积极性优生策略 （2）意义 植入前诊断（3）期望解决的问题染色体异常罗氏易位相互易位倒位非整倍体筛查（高龄、反复植入失败、反复自然流产，特别是染色体异常导致的自然流产）单基因病各种类型的单基因病HLA配型（3）期望解决的问题染色体异常（二） PGD/PGS的流程与相关技术（二） PGD/PGS的流程与相关技术关键技术正常胚胎移植ICSI技术囊胚培养③囊胚活检囊胚冷冻固定、FISH

检测全基因组扩增微量细胞遗传学检测①极体活检②单卵裂球活检关键技术正常胚胎移植ICSI技术囊胚培养③囊胚活检囊胚冷冻固关键技术①：胚胎活检技术极体活检单卵裂球活检囊胚活检关键技术①：胚胎活检技术极体活检单卵裂球活检囊胚活检极体活检活检第一极体和第二极体，检测母源性的染色体结构异常或基因突变，以及减数分裂异常造成的染色体非整倍体。•优点：对卵母细胞的发育没有影响。缺点：只能检测母源性的染色体异常；不能检测受精后发生的染色体异常；可检测细胞数少，易发生检测失败。极体活检活检第一极体和第二极体，检测母源性的染色体结构异常卵裂球活检在D3胚胎发育到6-10细胞时活检出1-2个卵裂球，进行遗传学诊断。•优点：最成熟最常用的活检方法。缺点：活检出卵裂球后降低了胚胎的发育潜能；细胞数少，容易发生检测失败(细胞固定及杂交失败，扩增失败，ADO等)。卵裂球活检在D3胚胎发育到6-10细胞时活检出1-2个卵裂球囊胚活检D5-6天胚胎发育到囊胚阶段后，活检囊胚滋养层细胞进行遗传学检测。优点：不影响将要发育成胎儿的内细胞团的发育；可检测细胞数较多，检测失败概率降低；对SNP-array而言，能大大减低费用。缺点：大部分情况下（除非可以在24小时之内出结果）需将活检后的囊胚冷冻保存。囊胚活检D5-6天胚胎发育到囊胚阶段后，活检囊胚滋养层细胞进讨论：极体活检vs囊胚活检？讨论：极体活检vs囊胚活检？冷冻胚胎库关键技术②：囊胚玻璃化冷冻冷冻胚胎库关键技术②：囊胚玻璃化冷冻活检细胞移入EP管全基因组扩增关键技术③：

单细胞全基因组扩增技术全基因组扩增产物活检细胞移入EP管全基因组扩增关键技术③：单细胞全基因组扩关键技术④：

对全基因组扩增产物的全基因组测序关键技术④：对全基因组扩增产物的全基因组测序

关键技术⑤：

SNP芯片技术 关键技术⑤：SNP芯片技术 二、植入前遗传学诊断和筛查的临床应用二、植入前遗传学诊断和筛查的临床应用2017年8月，《自然》杂志以《中国积极推进更好的宝宝》为题，指出中国在通过积极实施孕前诊断技术帮助阻断遗传性疾病已经后来居上，处于全球领先地位2016年中信湘雅进行了41000个IVF周期，约占美国总数的1/4。植入前检测的数量在两年内增长了277%，从2014年的876例增加了2016年的2429例，其中700例为单基因病。诞生了中国首例“无癌宝宝”CHINA’SPUS

HBYDAVIDCYRANOSK

IFO

RBETTERBABIE

SA

campaign

to

increase

preimplantation

geneticdiagnosiscouldputthecountryonthepathtowards

eliminating

certain

diseases.2017年8月，《自然》杂志以《中国积极推进更好的宝宝》为题技术流程（一）荧光原位杂交（FISH-PGD）技术流程（一）荧光原位杂交（FISH-PGD）normalbalanceddisomy

21disomy

21nullisomy

21Nullisomy

14罗氏易位产生6种配子类型，包括1中正常，1中平衡易位型，其余4种不平衡分离配子，这类不平衡配子往往导致流产。探针选择策略：理论上，每条染色体选1个探针即可以区分4种异常胚胎和平衡的胚胎罗氏易位的遗传风险normalbalanceddisomy21disomy2婚后6年不孕，我院检查时发现丈夫患有少、弱、畸精症，核型为13和14号染色体的罗氏易位携带者。活检了17枚胚胎，经诊断后有7枚平衡胚胎(正常或携带)，移植2枚胚胎，均获得了妊♘。产前诊断染色体正常。出生了一对发育良好的孩子。首例FISH-PGD（2003年）：罗氏易位绿色代表13号染色体，红色代表14号染色体A和D有两个绿色信号和两个红色信号，提示13号染色体和14号染色体均正常，可以移植。其它胚胎为13号染色体或14号染色体的非整倍体，不能移植。ADFB CE2婚后6年不孕，我院检查时发现丈夫患有少、弱、畸精症，核型为ACD四射体相互易位(reciprocaltranslocation)：相互易位的染色体，在进行减数分裂形成配子时，可形成四射体，四射体通过交互分离、上下分离、左右分离、3：1分离、断裂位点之间的互换等分离方式，可形成至少18种不同类型的配子，其中交互分离形成的配子是平衡的，包括一种正常，一种携带者，其它16种均为不平衡的配子。B18种不同配子类型：交互分离（2种）

：AB，CD（正常）和AD，CB（携带者）上下分离（2种）

：AB，CB和AD，CD左右分离（2种）

：AB，AD和CB，CD经过交换后进行的分离（4种）：

AB，AB；

CD，CDCB，CB；

AD，AD3：1分离（8种）：AB

和AD，CB，CD

AD

和AB，CB，CD

CB

和

CD，AD，AB

CD

和

AD，AB，CB相互易位的遗传风险ACD四射体相互易位(reciprocaltransloc理论上，任选3个胚胎即可以区分非平衡的胚胎和平衡的胚胎探针选择策略：理论上，任选3个胚胎即可以区分非平衡的胚胎和平衡的胚胎探一例相互易位携带者PGD，核型为：

46,XY,t(6;10)(q13;

p15)，活检2枚胚胎，对单卵裂球进行FISH检测，发现1枚信号正常，移植1枚，妊♘单胎，产前诊断为正常核型，出生了正常婴儿。FISH-PGD举例：平衡易位携带者FISH-PGD检测结果：a胚胎细胞核中每个探针均为2个杂交信号，表示易位相关的染色体组成为正常或平衡易位。b胚胎核中均为1红、3绿和2白，表示该胚胎为临近-1分离形成的6q13→6qter单体和10p15→10pter三体不平衡产物。临近-1分离模式图一例相互易位携带者PGD，核型为：46,XY,t(6;10单卵裂球FISH几种风险可能导致没有准确结果杂交背景干扰太强的情况杂交杂质信号干扰的情况杂交失败未见信号的情况固定或重杂交细胞核丢失的情况囊胚FISH相对卵裂期FISH更有优势？活检细胞数的增多有利于信号的判定；直观方便检出胚胎嵌合体。单卵裂球FISH几种风险可能导致没有准确结果杂交背景干扰太强胚胎序号Tel

7p信号数Tel

8q信号数CEP8结果提示11[6]3[6]2[6]异常21[7]3[7]2[7]异常31[5]3[5]2[5]异常42[7]2[7]2[7]正常或平衡易位51[4]3[4]2[4]异常62[7]2[7]2[7]正常或平衡易位71[7]3[7]2[7]异常81[4]3[4]2[]异常91[6]3[6]2[6]异常102[4]3[2]2[4]2[2]2[4]2[2]异常113[2]1[2]2[2]异常囊胚FISH-PGD举例：平衡易位Tel7p信号数Tel8q11[6]3[6]2[6]异FISH-PGD优点：①

安全、快速、灵敏度高；②

探针能较长时间保存；③

多色标记，简单直观；④

既可用于中期染色体又可用于间期细胞的分析FISH-PGD局限性：①

探针颜色有限，仅能检测少数染色体：②

仅能反映探针靶片段：③

特定染色体片段重排需设计特定探针。FISH-PGD优点：FISH-PGD局限性：（二）全基因组扩增技术PGD-CCS,

PGD

with

Comperhansive

Chromosome

Screening，避免了FISH仅能检测少数染色体的限制，采用全染色体筛查的方式对易位或倒位携带者进行PGD诊断，同时排除其它染色体非整倍体异常。（二）全基因组扩增技术PGD-CCS,PGDwithCWGA技术是一种对全部基因组序列进行非选择性扩增的技术，在相对没有序列倾向性的前提下大幅增加DNA拷贝。① PEP:

引物延伸预扩增(prime

extensionpreamplification，1992年)② DOP-PCR:

变性寡核苷酸引物PCR(degenerateoligonucleotide

primed

PCR，1992年)③ MDA: 环状滚动扩增原理的多重置换扩增法 (multipledisplacementamplification，1998年)④ MALBAC:

多重退火环状循环扩增（multiple

annealing

andlooping-basedamplification

cycles,

2012年)1、全基因组扩增(wholegenomeamplification,WGA)的概念WGA技术是一种对全部基因组序列进行非选择性扩增的技术，在三类全基因组扩增方法的比较三类全基因组扩增方法的比较1、CMA(Chromosome

microarray)-PGD/PGS技术CMA(Chromosome

microarray)芯片包括aCGH和SNP

arrayArrayCGHBlueGenome公司24sure芯片SNP芯片Affymetrix

公司250K，cyto

750K,cyto

HD芯片（三）基于全基因组扩增的PGD/PGS1、CMA(Chromosomemicroarray)-P易位携带者的SNP-PGD临床情况总结1.

囊胚+SNP活检分析增加PGD诊断的准确性2.

基于SNP的PGD-CCS可以检测出除易位染色体外其他染色体的异常，减少流产易位携带者的SNP-PGD临床情况总结1.囊胚+SNP活检易位携带者SNP-PGD的临床结局总结易位携带者SNP-PGD的临床结局总结举例，相互易位的SNP分析。患者核型46,XY,t(8;18)(p11;q21)，活检4枚囊胚，第2枚胚胎正常，移植后成功妊♘单胎，产前诊断为正常核型。NO.SNParray结果移植1del(8)(pter-p12),dup(18)(q22-qter).NO2未见染色体重复缺失YES3del(9)(pter-p11)NO4dup(8)(pter-p12),del(18)(pter-p11).NOSNP芯片分析结果胎儿羊水产前诊断结果举例，相互易位的SNP分析。患者核型46,XY,t(8;18总结了2011年10月至2012年8月间169名罗氏易位和相互易位携带者共773枚囊胚的SNP芯片结果及临床妊♘情况。52名罗氏易位，36名接受冻胚移植，妊♘25例，临床妊♘率69.4%；127名相互易位，61名接受冻胚移植，妊♘45例，临床妊♘率73.8%。通过较大样本数据比较，发现与FISH相比，SNP用于易位携带者，明显提高了临床妊♘率总结了2011年10月至2012年8月间169名罗氏易位和相2、新一代测序技术(NGS)-PGD/PGSNext

GenerationSequencing(NGS)右用于预防出生缺陷的各个时期减少出生缺陷婚前孕前植入前产前新生儿2、新一代测序技术(NGS)-PGD/PGSNextGen我们与华大合作建立了单细胞水平的全基因组测序。2012年8月诞生了世界首批由NGS-PGD助孕的健康婴儿。2、新一代测序技术(NGS)-PGD/PGS我们与华大合作建立了单细胞水平的全基因组测序。2、新一代测序Clinical

measuresNGS周期数SNP周期数p-value参与PGD/PGS周期数129266接受移植的夫妻数75177移植周期数80203移植胚胎数114292临床妊♘/

移植周期临床妊♘率61.25%(49/80)56.65%(115/203)0.480继续妊♘/

继续妊♘率52.50%(42/80)48.28%(98/203)0.522流产/

流产率14.29%(7/49)14.78%(17/115)0.934成功植入胚胎数/植入率52.63%(60/114)47.60%(139/292)0.362健康婴儿数/

出生婴儿数24/2475/75测序在常规PGD/PGS检测水平上与SNP芯片应用效率应用效率相当；平行统计395例治疗周期共1512枚囊胚，分别用SNP芯片与NGS测序进行PGD/PGS检测，移植周期临床妊娠率，继续妊娠，流产，植入率等临床指标对比未见显著差异（GigaScience,

2014）。应用效果-----

临床妊娠率，继续妊娠，流产率，植入率ClinicalmeasuresNGSSNPp-val单病PGD指导性文件（四）单基因病PGD单病PGD指导性文件（四）单基因病PGD单基因遗传病PGD的部分共识适用范围单基因遗传病，HLA配型

，遗传性肿瘤检测的原则要求只应用于致病基因突变位点明确的家系突变位点分析结合连锁分析连锁分析的遗传多态位点选择性连锁遗传病，建议加入性别指示位点的检测HLA配型连锁分析多态位点选择关注在致病突变位点附近发生重组的胚胎单基因遗传病PGD的部分共识适用范围检测流程家系成员已知致病突变的确认家系成员各遗传多态位点的连锁分析必要时细胞水平验证PGD检测方案的有效性临床活检细胞检测及结果审核检测方法基于PCR的检测方法新一代测序技术-目标捕获测序检测流程质控PGD实验室分区，仪器维护与管理，及试剂耗材的使用应严格遵照临床基因扩增实验室的要求。设置阴阳性对照。设置胚胎细胞洗涤液的空白对照。设置试剂阴性对照评估来源于试剂的污染。胚胎活检样本连同家系成员一并进行遗传多态位点分析。全基因组扩增（WGA）产物一般需要进行多重PCR的质控。高通量测序技术在临床应用前需在细胞水平上检测方案的覆盖度及保真性，以评估检测能力。质控PGD实验室分区，仪器维护与管理，及试剂耗材的使用应严检测策略：突变位点检测+连锁分析要点：①

引入多态位点进行连锁分析的目的在于监测等位基因脱扣（ADO）和重组的发生，一定程度上也可查找污染的来源。②

多态位点的位置：距离突变位点1Mb以内。③

多态位点的数量：突变位点上游2个，下游2个。一起至少2个如果是进行HLA配型，至少要有5个markers，分别位于HLA-A、HLA-B、HLA-DRA及HLA-DQB1的上下游。④建议进行细胞水平的预实验。检测策略：突变位点检测+连锁分析要点：PGD中常用的连锁标记短串联重复序列（STR）:核心重复单位为2-6bp，重复次数10~60多次，基因片段多在400bp以下

。单核苷酸多态（SNP）：由单个核苷酸变异所引起的DNA序列多态性，

在人群中的发生频率超过1%。

数目多，分布广，遗传稳定性高，易实现分析的自动化。PGD中常用的连锁标记短串联重复序列（STR）:核心重复单S-PGD技术针对目的基因和上下游区域，采用多重PCR靶向捕获技术（

Ion

AmpliSeq™Technology

）进行富集，然后再应用NGS技术，通过突变位点检测和建立基于SNP的连锁分析实现PGD，同时也可行染色体非整倍筛查。多重PCR捕获构建文库测序分析S-PGD技术针对目的基因和上下游区域，采用多重PCR靶向51捕获方案设计--------以DMD基因为例方案三方案二方案一...

6Mb

…4Mb编码

区5捕获方案设计--------以DMD基因为例方案三方案二方52样本测试测试上述方案在人群中的适用范围（检出率）样本量99位DMD携带者突变位点分布及频率示意图5样本测试测试上述方案在人群中的适用范围（检出率）样本量突有效SNP位点结果统计设定标准：突变位点两侧各有≥3个有效SNP方案1检出率：

98%

（97/99）方案1+2检出率：99%

（98/99）方案1+2+3检出率：100%

（99/99）两侧分别有≥2个有效STR：67.9%（19/28）突变两侧1M内杂合SNP比例分布53有效SNP位点结果统计设定标准：突变位点两侧各有≥3个有效本院S-PGD平台检出率活检时期方案家系周期数胚胎数诊断率卵裂期仅突变232830277.81%囊胚期仅突变525928389.75%囊胚期多重-STR525727293.01%囊胚期MDA-STR264400175198.23%囊胚期S-PGD290316121198.84%合计681860381995.81%本院S-PGD平台检出率活检时期方案家系周期数胚胎数诊断率卵S-PGD优点：目的区域测序深度大，检出率高,

适用范围广;检测结果准确,SNP密度高，能有效监测重组;靶向捕获设计方案灵活,便于临床成本控制。缺点：1、需要针对致病基因进行个性化设计，不能用于检测其他致病基因。2、某些突变类型不能检测。S-PGD优点：缺点：基因一侧无有效多态位点基因突变位点附近有重组①尽可能寻找有效的SNP或STR。②检测突变位点，并告知可能存在ADO、重组导致误诊的风险。新发突变或者无家系成员男女方疑似生殖腺嵌合①结合胚胎信息综合判断。②收集精子或活检极体，确定突变所在风险染色体。特殊情况基因一侧无有效多态位点基因突变位点附近有重组①尽可能寻找有效病例1••男方，患者，皮肤散在大小不一的咖啡斑及瘤样结节，临床诊断为神经纤维瘤患者。基因诊断结果提示患者NF1基因存在c.6709C>T（p.Arg2237Term）杂合无义突变。患者父母均未携带该突变，提示为新发生突变。遗传方式及生育风险：常染色体显性遗传，50%后代患病患者夫妇申请PGD。病例1••男方，患者，皮肤散在大小不一的咖啡斑及瘤样结节，病例1病例1PGD结果病例1PGD结果病例118%9%8%8%5%5%3%31%α地贫成人型多囊肾Ⅰ型进行性肌营养不良β地贫葡萄糖·6-磷酸脱氢酶缺乏症脊肌萎缩症甲型血友病神经纤维瘤先天性肾上腺皮质增生肾上腺脑白质营养不良共济失调3型马凡氏综合征强直性脊柱炎HLA-B27粘多糖II型白化病软骨发育不全婴儿型多囊肾耳聋乙型血友病视网膜母细胞瘤其他遗传病截止2018年4月，955对夫妻于我院申请单病PGD，涉及200余种单基因遗传病。18%9%8%8%5%5%3%31%α地贫截止2018年4月展望单基因病PGD+PGS同时检测多种单基因病新生突变家系PGD全基因检测 “PEFECT

BABY”展望单基因病PGD+PGS三、PGD/PGS的产前诊断管理三、PGD/PGS的产前诊断管理PGD/PGS技术的复杂性，探索性，活检样本的微量，均有可能导致PGD/PGS误诊产前诊断不可缺少！PGD/PGS

中的产前诊断PGD/PGS技术的复杂性，探索性，活检样本的微量，PGD/（1）单细胞FISH技术中：其中信号重叠是造成假单体误诊的原因，这种缺点可以通过使用不同的荧光信号来降低(Bahce

et

al.,2000)；信号分裂则是造成假三体误诊的原因，实验证明X,

13,16

与

21

的探针产生的错误少于Y

与18(Munné

et

al.,

2002).单细胞PCR技术中：容易发生扩增失败及等位基因脱扣(alleledrop-out，ADO)（两个等位基因中的一个优势扩增，甚至另一个完全扩增失败的现象），发生率约占5%～15%。单细胞WGA-CGH技术中：容易发生单细胞全基因组扩增均匀，杂交后分析的分辨率比较低。误诊原因1：技术局限性导致的误诊。（1）单细胞FISH技术中：其中信号重叠是造成假单体误诊的原嵌合体是指胚胎中不同的卵裂球染色体核型不同，可能是整倍体和非整倍体细胞的同时存在，也可能是不同的卵裂球细胞存在不同的非整倍体。在第三天的活检胚胎已发现多达57％(Baart

et

al.,

2004b;

Coonenet

al.,

2004)。这种胚胎是二倍体受精卵在有丝分裂过程中没有联会或后期滞后造成的。在卵裂球阶段，后期滞后形成的嵌合体占５６％。(Coonenetal.,2004)

。我们前面的研究亦显示植入前胚胎存在高比例的嵌合体。误诊原因2：嵌合体导致的误诊嵌合体是指胚胎中不同的卵裂球染色体核型不同，可能是整倍体和男方染色体为一相互易位携带者，核型为：46,XY,t(13;22)(p11;q11)。红色方框内为衍生的13号和衍生的22号染色体。举例：

2013年一个易位患者的PGD误诊患者1979年出生（34岁）。因男方平衡易位选择SNP芯片PGD技术助孕。易位核型：46,XY,t(13;22)(p11;q11)男方染色体为一相互易位携带者，核型为：46,XY,t(13;2013-01-27进行囊胚活检。获得6枚胚胎。检测4枚胚胎，报告认定3枚可移植，1枚非整倍体异常不可移植。2013-05-28日，患者移植2枚胚胎，成功双胎妊♘。2013-01-27进行囊胚活检。获得6枚胚胎。芯片16M参数分析结果胚胎1号2号3号4号胚胎评级5AB6AB6BB6-BB芯片分析评分79.0979.7579.6777.95芯片结果未见异常未见异常未见异常XX,-13,+22移植是是妊♘是是芯