23基因工程载体-人工染色体载体XXXX09

第三节其其他载载体2012.09其他载体体一、人工工染色体体二、植物物基因工工程载体体三、动物物基因工工程载体体一、人工工染色体体人基因组组十分庞庞大，约约含4××109bp，建建立和筛筛选人的的基因组组文库，，要求有有容量更更大的载载体，酵酵母人工工染色体体（yeastartificialchromosome,YAC））载体应应运而生生。YAC含有有酵母染染色体端端粒（telesome）、、着丝点点(centromere)及复制制起点等等功能序序列，可可插入长长度达200-500kb的的外源DNA，，导入酵酵母细胞胞可以随随细胞分分裂周期期复制繁繁殖供作作克隆，，成为人人基因组组研究计计划的重重要1、酵母人工工染色体（yeastartificialchromosome,YAC)酵母人工染色色体（yeastartificialchromosome，YAC）◆酵母人工染色色体是另一类酵母母穿梭载体。。具有自主复复制序列、克克隆位点以及及可在细菌和和酵母菌中选选择的标记基基因。◆YAC可以接接受100-1000kb的外源源DNA片段段，这一特点点使YAC成成为人类基因因组计划及图图位克隆分离离基因的重要要工具，并促促进了发展人人类人工染色色体(humanartificialchromosome，，HAC)的的研究。正常酵母人人工染色体体含有：*四膜虫虫端粒（tel)*酵母自自主复制序序列（ARS)*酵酵母母着着丝丝点点(CEN)*酵酵母母的的选选择择标标记记(TRP1、、URA1)YAC载载体体thecapacitytoclonelargeexogenousDNAfragments(upto2Mb)hasmadeYACsavitaltoolinphysicalmappingThefunctionalelementsofayeastchromosome（1）着丝粒粒区（CEN）AAGTCACGTGTTGTTTCTGNTTTCCGAAAYAC的组成结结构酵母染色色体着丝丝粒区的的保守序序列:78-86bpIIIIII由三个区区组成酵母端粒保守守序列是(G4T2)n重复序列列。（3）复复制起点点（ORI）约100bp的的自主复复制序列列（ARS）。（2）端端粒（TEL））（真核生生物中只只有酵母母菌有ARS）两个端粒粒序列Tel。。位于SUP4基因内部部。（4）克克隆位点点插入失活活选择：：SUP4酶失活活的酵母母菌落呈呈红色；不失活的的菌落是是白色。。142、细菌菌人工染染色体（Bacterialartificialchromosome,BAC））细菌人工工染色体体（bacterialartificialchromosome，BAC））◆BAC载载体是基基于细菌菌的性因子(F因子子)质粒粒的一些特特点构建建的。F因子在在细菌接接合时转转移1Mb的细细菌染色色体片段段。将F因子经经基因工工程改良良构成的的BAC载体，，可用于于克隆100kb以以上的DNA片片段。◆带有外源源片段的的BAC载体在在细菌细细胞中通通常仅单单个拷贝贝，这一一特点有有利于保保持DNA大分分子，在在细胞内内稳定复复制而不不发生重重组。BAC载载体本身身分子量量小，具有氯霉霉素抗性性选择基基因及多多克隆位位点。Structureofabacterialartificialchromosome(BAC),usedforcloninglargefragmentsofdonorDNA.CMRisaselectablemarkerforchloramphenicolresistance.oriS,repE,parA,andparBareFgenesforreplicationandregulationofcopynumber.cosNisthecossitefromlphage.HindIIIandBamHIarecloningsitesatwhichforeignDNAisinserted.Thetwopromotersarefortranscribingtheinsertedfragment.TheNotIsitesareusedforcuttingouttheinsertedfragment.3、PAC载体体二、植植物载载体PlantcloningvectorsTi质质粒:侵染染广泛泛的双双子叶叶植物物T-DNA或T-区区(T-region)：约约20kb，包包含专专化冠冠瘿碱碱生化化合成成和冠冠瘿瘤瘤生长长的基基因，，随机机地整整合到到植物物染色色体上上。结构特特点：：两端端具有有25个碱碱基对对的顺顺向重重复序序列，，但重重复不不是完完全的的。25个个碱基基对的的序列列称为为T-DNA的的边界界序列列(T-DNAbordersequence)。。去除除右边边界序序列，，将使使T-DNA失失去转转移和和整合合的功功能；；左边边界的的缺失失，对对致瘤瘤性无无明显显影响响。毒性区区域即即vir(virulence)区域域:引引起T-DNA转移移的区区域。。长度度约35kb，，和T-DNA处于于不同同位置置植物Ti质质粒载载体（1））T-DNA区区（transferred-DNAregions）T-DNA是农农杆菌菌侵染染植物物细胞胞时，，从Ti质质粒上上导入入植物物细胞胞的一一段DNA。T-DNA两端端各有有一段段25bp的重重复序序列(LB,RB)。。T-DNA携带带的致致瘤基基因是是一些些与激激素合合成有有关的的基因因，由由于激激素合合成基基因使使细胞胞处于于不停停的分分裂状状态，，形成成冠瘿瘿瘤，，不能能进行行细胞胞分化化。Ti质质粒改改造后后才能能应用用于植植物的的基因因工程程。保保留留T-DNA两两端的的末端端序列列，然然后用用外源源DNA插插入或或直接接取代代野生生型T-DNA的部部分基基因，，使转转化的的植物物细胞胞不具具有成成瘤能能力。。T-DNA区域域内的的所有有基因因与转转移无无关，，所以以将致致瘤基基因全全部缺缺失即即卸甲甲(disarmed)后，，将细细菌抗抗生素素的抗抗性基基因或或其它它序列列插入入到这这个区区域，，形成成的T-DNA仍可可将RB至至LB内的的序列列转移移并整整合到到植物物基因因组。。Vir区的的毒性性基因因是T-DNA转移移所必必需的的，毒毒性基基因可可以顺顺式及及反式式两种种方式式控制制T-DNA转转移。。（2）Vir区（virolenceregion））Vir区段段上的基因因与T-DNA从细菌转转移到植物物细胞的遗遗传过程有有关，区段上的的基因能够够使农杆菌菌表现出毒毒性，故称称之为毒性区。Vir区区段总长度度大约35kb，由由7个互补补群组成，，分别命名名为VirA、、VirB、VirC、VirD、VirE、、VirG和VirH。（3）Con区(regionsencodingconjugations)该区段上存存在着与细细菌间接合合转移的有有关基因（（tra），调控Ti质质粒在农杆杆菌之间的的转移。（4）Ori区(originofreplication)该区段基基因调控控Ti质质粒的自自我复制制，故称称之为复制起始始区。Ti质粒粒分子受受到信号号分子的的激活作作用之后后，virD基因编码码的一种种核酸内内切酶，，先在T-DNA的RB序列列中的第第3和第第4碱基基之间切切开一个个单链缺口，随随后在T-DNA同一一条链的的LB序序列中切切出第二二个单链链缺口。。T-DNA便以以单链形式式释放出来来，并在在RB序序列的引引导下定定向地转转移到寄寄主植物物细胞。。在有关的的植物细细胞酶体体系的催催化作用用下，合合成互补补链形成成双链形形式的T-DNA分子子。在在一系列列酶的参参与下整整合进植植物基因因组。这这种整合合是一种种非正常常重组。。T-DNA转移移的机制制2、Ti质粒载载体DisarmedTivectors（非致瘤瘤载体））Cointegratevectors（共整合合载体））Binaryvectors（双元载体））1）DisarmedTivectors去除T-DNA中的肿瘤瘤基因在T-DNA中插入用于于转化植株筛筛选的遗传标标记基因IntermediatevectorsAsmallportionofT-DNAwassubclonedinaconventionalE.coliplasmidvector(i.e.pBR322)foreasymanipulation,producingintermediatevectorsIntermediatevectorsareincapableofreplicationinA.tumefaciensandalsolackconjugationfunctions.Transferofthemwasachievedusingatriparentalmating.TriparentalmatingAnE.colistrainAcarryingahelperplasmidabletomobilizetheintermediatevectorintransTheE.colistrainBcarryingtherecombinantintermediatevectorA.tumefacienscarryingthedisarmedTiplasmid3.BinaryvectorT-DNAdoesnotneedtobephysicallyattachedtotherestoftheTiplasmidUseseparateplasmidstosupplythedisarmedT-DNAandthevirulencefunctionsThesmallplasmidcanbeusedtoinsertedforeigngeneWhenthetwoplasmidspresenttogetherinthesameA.tumefacienscell,theT-DNAcarriedbypBI121istransferredtotheplantchromosomalDNAbyproteinscodedbygenescarriedbypAL4404Ti质粒及其其衍生载体Ti质粒是约约200-500kb的的环状DNA分子，很难难直接使用，，故需对其加加以改造，构构建出Ti质质粒的衍生载载体系统，广广泛用作植物物基因工程中中的载体：（1）双元载载体(binaryvectors）如pBin19载体，具具有原核生物物的卡那霉素素抗性基因(AphⅠ)作为细菌选选择标记，真真核生物的卡卡那霉素抗性性基因(nos-NptⅡ)作为植植物的选择标标记，pUC19的多克克隆位点及αα-互补显色色标记（2）共整合合载体(integratedvectors)（1）双元载载体系统（binaryvector）具有两个质粒粒——穿梭质质粒和Ti质质粒。（2）共整合合载体（integratedvector）共整合载体系系统包括在T-DNA上上的激素合成成区经过突变变后的Ti质质粒和中间载载体两部分。。Ti质质粒的的衍生生载体体发根农农杆菌菌存在在另一一种质质粒，，Ri质粒粒。Ri质质粒也也可完完成外外源基基因向向植物物的转转移工工作。。发根农农杆菌菌侵染染后植植物细细胞产产生许许多不不定根根，这这种不不定根根生长长迅速速，不不断分分枝成成毛状状，故故称之之为毛毛状根根，也也称为为发状状根，，分别别简称称为毛毛根或或发根根，Ri质质粒为为根诱诱导质质粒。。Ri质质粒粒的的结结构构与与Ti质质粒粒的的结结构构很很相相似似，，可可以以分分为为T区区、、vir区区、、ori区区和和其其它它区区域域等等几几个个部部分分。。Ri质质粒粒T区区与与Ti质质粒粒的的T-DNA十十分分相相似似：：①T区区的的左左右右边边界界序序列列。。左左右右边边界界上上含含有有25bp的的重重复复序序列列。。②TL-DNA区区。。该该区区中中含含有有与与毛毛状状根根形形成成有有关关的的rolA、、B、、C、、D基因因群群。。③TR-DNA区区。。该该区区中中含含有有与与农农杆杆碱碱合合成成有有关关的的基基因因（（ags）和和生生长长素素合合成成有有关关的的基基因因（（tms1、、tms2）。。ags基因因在在转转化化的的初初期期起起着着重重要要的的作作用用，，是是不定定根根产产生生的的关关键键Ri质质粒粒CaMV克克隆隆载载体体含1个个约约8kb的的环环状状双双链链DNA分分子子；；用于于十十字字花花科科和和少少数数非非十十字字花花科科的的植植物物基基因因转转移移；；其感感染染对对植植物物有有害害，，不不能能直直接接做做载载体体；；CaMV的的DNA在在植植物物细细胞胞中中能能高高水水平平转转录录35SRNA，，其其启启动动子子是是一一强强启启动动子子。。构构建建的的含含35S启启动动子子的的系系列列克克隆隆载载体体可可在在植植物物细细胞胞内内高高效效表表达达基基因因。。三、、动动物物载载体体质粒和噬菌体载体只能在细菌中繁殖，不能满足真核DNA重组需要。感染动物的病毒可改造用作动物细胞的载体。由于动物细胞的培养和操作较复杂、花费也较多，因而病毒载体构建时一般都把细菌质粒复制起始序列放置其中。使载体及其携带的外来序列能方便地在细菌中繁殖和克隆，然后再引入真核细胞。目前病毒载体常用者有改造来自猴肾病毒SV40（SimianVirus40）、逆转录病毒和昆虫杆状病毒等，使用这些病毒载体的目的多为将目的基因或序列放入动物细胞中表达或试验其功能、或作基因治疗等。

猴病毒40（SV40）的基因组常用来作为克隆载体，把外源DNA转入哺乳类细胞。猴病毒40是球形动物病毒，直径40nm，呈20面体，有一个共价闭环的双链DNA基因组，全长5244bp。它在猴肾中增殖。被SV40感染的细胞都会出现SV40的T抗原。早已证明完整的小鼠染色体β珠蛋白基因（包括所有的间插顺序和两侧顺序）整合在SV40中后，在被感染的猴肾细胞中都能正确地转录和翻译。表明猴肾细胞的拼接系统能有效地处理小鼠β珠蛋白的初级转录本。Cloningvectorsofanimalcell动物病毒毒：猿猴病毒毒-40(SV-40)的衍衍生物5243bp共价闭闭合环状状分子感染率高高，几乎乎100％寄主主细胞能能被感染染能提供完完整的真真核基因因转录所所需的成成分侵侵染性具具有寄主主特异性性改建：野生型最最多只能能包装其其基因组组长度的的1.05倍的的DNA分子其他：痘苗病毒DNA作载体，，表达乙肝表表面抗原用家蚕的核多多角体病毒表表达人α-干干扰素SV40作为克隆载体有其局限性：①SV40基因组的晚期功能区的裂解性，不利于外源DNA的重组和表达；②早期功能区与病毒的致癌性有关，使用时有顾虑；③重组DNA片段的大小受体限制。逆转录病毒是RNA病毒，它有三个基因：gag-编码病毒的核心蛋白；pol-编码逆转录酶；env-编码病毒的被膜糖蛋白。有的逆转录病毒还带有癌基因（vonc），即有的逆转录病毒有致癌作用。近年来，已设计构建成一些缺陷型病毒（defectivevirus）使逆转录病毒成为有用的基因载体，成功地把抗药性基因转入了人体造血前体细胞，并在细胞中表达。反转录病毒克克隆载体反转录病毒是是一类含RNA的病毒，，进入受体细细胞后，RNA反转录成成DNA，通通过两端由数数百bp组成成的长末端重重复序列，整整合到染色体体上，成为原原病毒。只要将外源目目的基因组入入原病毒DNA的合适克克隆位点，就就能在感染的的动物细胞中中表达。Hock等选选用了缺失编编码病毒外壳壳蛋白基因的的逆转录病毒毒，因此不能能合成自身的的外壳，但它它有识别外壳壳蛋白进行包包装的信号（（一段尚未鉴鉴定的DNA顺序）。用用这种缺陷的的逆转录病毒毒去感染某种种细胞株，这这种细胞株包包含有辅助病病毒（helpervirus））。辅助病毒毒能合成蛋白白外壳，但缺缺失了识别蛋蛋白外壳进行行包装的信号号，因此它不不能包装成病病毒颗粒。当当用逆转录病病毒感染细胞胞株后，逆转转录病毒的RNA进入辅辅助病毒的外外壳蛋白，成成为病毒颗粒粒。这时把受受感染的细胞胞同骨髓细胞胞一起培养，，包装在辅助助病毒外壳蛋蛋白中的逆转转录病毒RNA，进入骨骨髓细胞，病病毒DNA插插入宿主细胞胞基因组，基基因的活性得得到表达。这这时，由于骨骨髓细胞里面面没有辅助病病毒，所以整整合进宿主基基因组的逆转转录病毒，不不再有外壳蛋蛋白可供包装装，因此也就就无法增殖，，而只能被““陷”在宿主主基因组中，，通过细胞分分裂而传给下下一代子细胞胞。分子克隆载体体的选择选择克隆载体体的几个重要要参数（1）实验对对象（2）实验性性质（3）载体容容量（4）合适克克隆位点（5）载体的的稳定性（6）载体DNA制备的的难易（7）外源基基因表达产物物产量、产物物特点等实验对象（1）供体：：遗传背景与与DNA特点点等，其中包包括染色体DNA大小，，基因大小与与结构，碱基基组成，目的的基因的产物物特点以及遗遗传物质的传传递方式等。。（2）受体：：各种中间宿宿主与终宿主主的遗传背景景，如遗传物物质的传递方方式(包括人人为的方法)，DNA限限制修饰系统统，DNA重重组基因特点点，基因产物物修饰系统，，即转录与翻翻译后修饰系系统。实验对象如常用于基因因工程的宿主主菌E.coli，菌株不同，，基因型亦不不同，不同载载体要求不同同菌株。如：：E.coliDH5、E.coliDH5α、E.coliDH5αF’’1）

三者者均有限制制-修饰系系统和重组组基因缺陷陷，外源DNA可存存活，且不不发生重组组2）

DH5α和DH5ααF’都具具有一个可可供遗传标标记lacZα检测测的遗传背背景3）

DH5αF’’可供M13mp系系列载体配配套使用，，M13病病毒的感染染需要F’的存在在1．当一DNA片段段插入终止止子探针型型载体pBU10的的HindⅢ克隆位位点后，重重组质粒仍仍可转化E.coli(CmlsTcs)为CmlrTcr，为为什么?可可设计什什么实验证证明其假设设?2．当一DNA片段段插入pUC18后后，在x-gal平平板上出现现两类菌落落，兰色菌菌落和白色色菌落。从从白色菌落落中分离纯纯化的质粒粒经电泳检检查，均比比原载体DNA分子子大；但从从兰色菌落落随机分离离的质粒DNA却有有两类，其其中一类与与载体大小小相同，另另一类却与与白色菌落落中分离的的质粒大小小相同。如如何解释这这一实验结结果?可可设计何种种实验证明明你的解释释是正确的的?3．当把一一外源DNA插入一一克隆载体体后，重组组DNA分分子转化E.coli细胞所获得得的重组子子分子可根根据其限制制酶图谱分分为两类，，即这两类类转化子中中所含的重重组DNA分子的限限制酶图谱谱不一样，，从这两类类转化细胞胞中分离到到的重组DNA分子子可用限制制酶回收插插入的片段段。而从这这两类