发酵工程下游加工过程概论

第十二二章发酵工工程下下游加加工过过程简简介一、发发酵工工程下下游加加工过过程概概论1、发发酵工工程下下游加加工过过程的的特点点1）所所需产产物在在培养养液中中浓度度较低低，且且稳定定性差差2）普普遍存存在下下游工工程代代价高高，回回收率率较低低等问问题发酵液液是复杂杂的多多相系系统2、发发酵工工程下下游加加工过过程的的一般般程序序成品加工发酵液的预处理和过滤提取精制采用凝凝聚和和絮凝凝技术术加速速固、、液分分离；；如产产物在在细胞胞内，，还要要进行行细胞胞破碎碎提取（（初步步纯化化）目目的是是除去去与目目标产产物性性质差差异大大的杂杂质精制（（高度度纯化化）是是采用用对产产品有有高度度选择择性的的分离离技术术，除除去与与产物物化学学性质质和物物理性性质相相近的的杂质质最终获获得质质量合合格的的产品品3、主要操操作单单元：：絮凝离心过滤细胞破碎萃取沉淀层析结晶干燥二、发发酵液液预处处理和和过滤滤为什么么要对对发酵酵液进进行预预处理理？预处理理的目目的是是什么么？发酵液液的基基本特特性产物浓浓度低低具有极极性黏度大大表面张张力大大性质不不稳定定一）发发酵液液的预预处理理1、目目的：：发酵液液中杂杂质多多且成成分复复杂，，其中中对纯纯化影影响最最大的的是高高价无机离离子(Ca2+、Mg2+、Fe3+等)和和杂蛋白白等改变发发酵液液的物物理性性质，，加快快悬浮浮液中中固形形物沉沉降的的速度度；尽可能能使产产物转转入便便于以以后处处理的的相中中；（（一般般为液液相））能够除除去部部分杂杂质。。2、高高价无无机离离子的的去除除镁离子子的去去除：：常用草草酸与与钙钙离子子生成成草酸酸钙沉沉淀草酸为为弱酸酸，对对发酵酵产物物的破破坏较较小，，草酸酸钙沉沉淀还还能促促进蛋蛋白质质凝固固，有有利于于提高高滤液液的过过滤速速度；；草酸的的溶解解度较较小，，需大大用量量时，，可用用草酸酸钠取取代；；草酸酸价格格较高高，生生产上上一般般需回回收钙离子子的去去除：：铁离子子的去去除：常用用三三聚聚磷磷酸酸钠钠与与镁镁离离子子形形成成可可溶溶性性络络合合物物Na5P3O10+Mg2+=MgNa3P3O10+2Na+常用用黄黄血血盐盐与与铁铁离离子子形形成成普普鲁鲁氏氏蓝蓝沉沉淀淀3K4Fe(CN)6+4Fe3+=Fe4[Fe(CN)6]3↓+12K+3、、可可溶溶性性杂杂蛋蛋白白的的去去除除杂蛋蛋白白的的存存在在会会降降低低离离子子交交换换树树脂脂和和大大网网格格树树脂脂的的吸吸附附量量，，如如采采用用溶溶剂剂萃萃取取，，会会发发生生乳乳化化，，影影响响两两相相分分离离。。此此外外，，在在常常规规过过滤滤和和膜膜过过滤滤时时，，还还会会使使滤滤速速下下降降，，使使膜膜受受到到污污染染。1））沉沉淀淀法法调等等电电点点因羧羧基基的的电电离离度度比比氨氨基基大大，，所所以以大大多多数数蛋蛋白白质质的的等等电电点点都都在在酸酸性性范范围围(pH4.0-5.5)但仅仅靠靠调调等等电电点点还还不不能能使使大大部部分分蛋蛋白白质质沉沉淀淀蛋白白质质是是两两性性物物质质，，在在酸酸性性溶溶液液中中，，能能与与一一些些阴阴离离子子物物质质如如三三氯氯乙乙酸酸盐盐、、水水杨杨酸酸盐盐、、钨钨酸酸盐盐、、苦苦味味酸酸盐盐、、鞣鞣酸酸盐盐和和过过氯氯酸酸盐盐等等形形成成沉沉淀淀；；在在碱碱性性溶溶液液中中，，能能与与一一些些阳阳离离子子如如Ag+、Cu2+、Zn2+、Fe3+、Pb2+等形形成成沉沉淀淀2））变变性性法法变性性蛋蛋白白溶溶解解度度较较小小最常常用用加加热热法法加热热不不仅仅能能使使蛋蛋白白变变性性，，还还可可降降低低液液体体黏黏度度，，提提高高过过滤滤速速率率；；其他他方方法法：：大幅幅度度调调节节pH，，加加酒酒精精、、丙丙酮酮等等有有机机溶溶剂剂或或表表面面活活性性剂剂变性性法法存存在在一一定定的的局局限限如加加热热法法只只适适用用于于对对热热较较稳稳定定的的目目的的产产物物；；极极端端pH也也会会导导致致某某些些目目的的产产物物失失活活，，且且需需消消耗耗大大量量酸酸碱碱，，而而有有机机溶溶剂剂法法通通常常只只适适用用于于所所处处理理的的液液体体数数量量较较少少的的场场合合。。3）吸附附法加入某些些吸附剂剂或沉淀淀剂吸附附杂蛋白白而将其其除去如四环素素生产中中，采用用黄血盐盐和硫酸酸锌的协协同作用用生成亚亚铁氰化化钾的胶胶状沉淀淀来吸附附蛋白；；在枯草芽芽孢杆菌菌发酵中中，加入入氯化钙钙和磷酸酸氢二钠钠，两者者生成庞庞大的凝凝胶，把把蛋白质质、菌体体及其他他不溶性性粒子吸吸附并包包裹在其其中而除除去凝聚和絮絮凝都是是发酵液液预处理理的重要要方法，，其处理理过程就就是将化化学药剂剂预先投投加到悬悬浮液中中，改变变细胞、、菌体和和蛋白质质等粒子子的分散散状态，，破坏其其稳定性性，使它它们聚集集成可分分离的絮絮凝体，，再进行行分离。。发酵液预预处理的的方法——凝聚和和絮凝凝聚指在投加加的化学学物质（（如水解解的凝聚聚剂：铝铝、铁的的盐类或或石灰等等）作用用下，胶胶体脱稳稳并使粒粒子相互互聚集成成1mm大小块块状凝聚聚体的过过程。电解质的的凝聚能能力可用用凝聚值值表示，，即使胶胶粒发生生凝聚作作用的最最小电解解质浓度度（mmol/L）。。一般反离离子的价价数越高高，凝聚值越越小，即即凝聚能能力越强强。如Al3+>Fe3+>H+>Ca2+>Mg2+>K+>Na+>Li+絮凝指使用絮絮凝剂（（通常是是天然或或合成的的大分子子量聚电电解质））将胶体体粒子交交联成网网，形成成10mm大小小絮凝团团的过程程。其中絮凝凝剂主要要起架桥桥作用，，工业上上使用到到的有聚聚丙烯酰酰胺类衍衍生物、、聚合铝铝盐、海海藻酸钠钠、壳聚聚糖等，，目前最最常用的的是聚丙丙烯酰胺胺类衍生生物。1）板框框(plateandframe)压压滤机板框过滤机结构图

1-尾板2-滤框3-滤板4-主梁5-头板6-紧压装置二）发酵酵液过滤滤常用设设备板框过滤滤机

Plateshifter1500x1500FilterPressClothwashing1）板框框(plateandframe)压压滤机2）带式式压滤机机二）发酵酵液过滤滤常用设设备发酵后期期要少加加消泡剂剂和少进进行补料料，防止止消泡剂剂和未用用完的培培养基增增加过滤滤难度；；菌体自溶溶前放罐罐可防止止因菌体体自溶释释放出的的代谢产产物增加加发酵液液黏度影响发酵酵液过滤滤的因素素1）菌体体细胞体体积真菌菌丝丝体较粗粗大，发发酵液不不需特殊殊处理，，易过滤滤；放线菌菌菌丝细而而分支，，交织成成网格状状，较难难过滤，，发酵液需需经预处处理，凝凝固蛋白白质等胶胶体物质质，提高高过滤速速度；细菌菌体体更小，，发酵液液如不经经絮凝等等预处理理，很难难用常规规过滤设设备进行行过滤操操作。2）培养养基组成成黄豆饼粉粉、花生生饼粉等等会增加加过滤难难度3）放罐罐时机当发酵液液中有不不溶性多多糖时，，会使发发酵液的的黏度增增大而影影响过滤滤速度；；可用酶酶将其转转化成可可溶性单单糖，提提高滤速速。提高过滤滤性能的的方法1）加助助滤剂

助滤剂是一种不可压缩的多孔微粒，能使滤饼疏松，从而增加滤速；

常用硅藻土、珍珠岩等；

加入方法有两种：a)预先在滤布上铺上一层1-2mm厚的助滤剂；b)直接把助滤剂加入发酵液中。2）添加加填充凝凝固剂如CaSO4、AlPO4等本身就就是助滤滤剂，且且能使胶胶状物和和悬浮物物凝固3）酶解解法（沉淀、吸附、萃取、超滤、结晶）发酵液初步纯化细胞碎片分离细胞破碎细胞分离高度纯化成品加工预处理胞外产物（加热、调pH、絮凝）（过滤、离心分离、膜分离)（匀浆、研磨、酶解）（离心分离、双水相萃取、膜分离）（重结晶、离子交换、色谱分离、膜分离）（浓缩、无菌过滤、干燥、成型）胞内产物提取精制——产品品的收得得率和质质量控制制。细胞破碎碎目的代谢谢产物并并非都是是分泌型型的，许许多是存存在于细细胞内的的，特别别是基因因工程菌菌在细胞胞内形成成的包含含体是不不分泌的的，故需需进行细细胞破碎碎。大规模模破碎碎细胞胞常用用方法法；利用高高压使使细胞胞悬液液通过过针型型阀，，由于于突然然减压压和高高速冲冲击撞撞击环环，造造成细细胞破破碎。。影响破破碎的的主要要因素素是压压力、、温度度和循循环次次数1）高高压匀匀浆法法高压匀浆器排出阀2）高高速球球磨法法高速球磨机1-物料进口2-物料出口3、4-冷却水进、出口5、6-夹套冷却水进、出口由于圆圆盘的的高速速旋转转，细细胞悬悬浮液液与极极细的的玻璃璃小珠珠、石石英砂砂或氧氧化铝铝一起起快速速搅拌拌或研研磨，，使细细胞得得以破破碎。。3）超超声波波法常用超超声波波频率率15-25kHz；原理：：由于于超声声波产产生极极为强强烈的的冲击击波压压力，，引起起黏滞滞性旋旋涡在在介质质中的的细胞胞上造造成了了剪切切力，，促使使细胞胞内液液体发发生流流动，，造成成细胞胞破碎碎；超声波波振荡荡易引引起温温度的的剧烈烈上升升，操操作时时需冷冷却；；通常杆杆菌比比球菌菌易破破，阴阴性菌菌比阳阳性菌菌易破破4）酶酶解法法专一性性强，，条件件温和和；但但费用用较高高酶解法法的另另一方方式是是利用用微生生物的的自溶溶作用用大多数数微生生物都都能产产生一一种可可以水水解自自身细细胞壁壁的酶酶；当当改变变一定定的环环境条条件，，可诱诱发这这种酶酶的过过量产产生或或激发发其他他自溶溶酶产产生，，而发发生自自溶现现象。。5）渗渗透压压冲击击法将细胞胞先放放入高高渗透透压的的介质质中，，如高高浓度度的甘甘油或或蔗糖糖液，，在达达到平平衡后后，介介质突突然被被稀释释，或或将细细胞转转入水水或缓缓冲液液中，，水就就会迅迅速进进入细细胞内内，致致使细细胞膨膨胀，，引起起细胞胞壁的的破裂裂；此法适适用于于细胞胞壁较较脆弱弱的，，或者者细胞胞壁预预先用用酶处处理的的，或或细胞胞壁合合成受受到抑抑制的的微生生物；；6）反反复冻冻结-融化化法将细胞胞反复复在低低温下下突然然冷冻冻后在在室温温下融融化，，引起起细胞胞破裂裂；低低温冷冷冻一一方面面能使使细胞胞膜的的疏水水键结结构断断裂，，从而而增加加细胞胞的亲亲水性性能；；另一一方面面胞内内水结结晶使使细胞胞内外外溶液液浓度度发生生变化化，引引起细细胞突突然膨膨胀而而破裂裂。该法适适用于于细胞胞壁较较脆弱弱的细细胞细胞破破碎方方法二、提提取（（初步步分离离）（一））沉淀淀法（（Precipitation））沉淀是是通过过改变变条件件或加加入某某种试试剂，，使溶溶液中中的溶溶质由由液相相转变变为固固相析析出的的过程程。方法简简单、、成本本低、、使用用广泛泛，初初步分分离的的常用用手段段。盐析法法有机溶溶剂沉沉淀法法等电点点沉淀淀法非离子子型聚聚合物物沉淀淀法聚电解解质沉沉淀法法生成盐盐复合合物沉沉淀法法热变性性及酸酸碱变变性沉沉淀法法中性盐的加加入能破坏蛋白质质的胶体性性质，使蛋白质质的溶解度度降低而析析出。1.盐析法法(Saltingout)破坏了蛋白白质在水中中存在的两两个因素(水化层和和电荷),从而使蛋蛋白质沉淀淀。将大量盐加加到蛋白质质溶液中，，高浓度的的盐离子（（如硫酸铵铵的SO4和NH4)有很强强的水化力力，可夺取取蛋白质分分子的水化化层，使之之“失水””，于是蛋蛋白质胶粒粒凝结并沉沉淀析出。。蛋白质盐析析常用的中中性盐，主主要有硫酸酸铵、硫酸酸镁、硫酸酸钠、氯化化钠、磷酸酸钠等。盐溶(saltingin)：许多蛋白在在低盐浓度度下发生盐盐溶现象（（比在纯水水中的溶解解度大大增增加）；高盐浓度则则盐析，离离子强度越越大，蛋白白质的溶解解度越低；；由于各种蛋蛋白质分子子颗粒大小小、亲水程程度不同，，故盐析所所需的盐浓浓度也不一一样，因此此调节混合合蛋白质溶溶液中的中中性盐浓度度可使各种种蛋白质分分段沉淀。。1）蛋白质质浓度蛋白质浓度度高时，欲欲分离的蛋蛋白质常常常夹杂着其其他蛋白质质地一起沉沉淀出来（（共沉现象象）。因此此在盐析前前血清要加加等量生理理盐水稀释释，使蛋白白质含量在在2.5-3.0%。2）离子强强度和种类类3）温度温度是影响响溶质溶解解度的重要要因素，升升高温度可可以增加许许多无机盐盐和小分子子有机化合合物的溶解解度；4）pH由于蛋白质质在等电点点时最易沉沉淀，故可可选择等电电点的pH作为盐析析pH影响盐析的的因素2.等电点点沉淀法原理：利用两性电电解质在电电中性时溶溶解度最低低优点：许多蛋白的的等电点都都在偏酸范范围内，而而许多无机机酸的价格格低廉；缺点：酸化时易引引起蛋白失失活不少蛋白质质与金属结结合后会发发生等电点点偏移，如如胰岛素的的等电点为为5.3，，在与Zn2+结合形成胰胰岛素锌盐盐，其等电电点升为6.2；故故加入金属属离子后选选择等电点点沉淀时，，要注意调调整pH。。二、提取（（初步分离离）（二）结晶晶法（crystallization））物质从液态态（液体或或熔融体））或气态形形成晶体的的过程叫结晶。加入能使结结晶溶质溶溶解度降低低的物质，，让结晶溶溶质形成过过饱和液；；例如卡那霉霉素不溶于于乙醇，向向卡那霉素素脱色液中中加入终浓浓度为60%-80%的乙醇醇，就结晶晶析出;在普鲁卡因因青霉素结结晶时，加加入一定量量的食盐，，可使结晶晶更易析出出结晶方法（过饱和溶溶液形成的的方法）1）浓缩结结晶减压蒸发浓浓缩，达到到过饱和2）冷却结结晶适用于溶解解度随温度度变化很大大的物质；；先加热使使其溶解，，然后冷却却结晶；3）化学反反应结晶加入反应剂剂或调pH