发酵工程知识讲座

发酵工工程发酵与与我们的生活活发酵与与我们的生活活维生素素氨基酸酸干扰素素疫苗苗青霉素素发酵与与我们的生活活生物物菌菌肥肥生物物杀杀虫虫剂剂主要内内容发酵工工程概概论一、发发酵及及发酵酵工程程的概概念二、发发酵工工程的的发展展简史史发酵工工程特特点及及其类类型一、发发酵的的特点点二、发发酵的的生产产类型型发酵方方法的的分类类及流流程发酵过过程工工艺控控制一、提提供优优良的的菌种种二、掌掌握好好移种种时机机和接接种量量主讲内内容三、发发酵过过程中中的代代谢变变化及及控制制四、基基质浓浓度变变化及及控制制五、温温度对对发酵酵的影影响及及控制制六、溶溶解氧氧对发发酵的的影响响及控控制七、pH对对发酵酵的影影响及及其控控制八、CO2对发酵酵的影影响及及其控控制九、泡泡沫对对发酵酵的影影响及及其控控制十、发发酵终终点的的判断断及异异常发发酵情情况的的处理理发酵工工程概概论早期的的发酵酵概念念微生物物在无无氧条条件下下的代代谢过过程。。英文的的发酵酵，fermentation一一词来来源于于拉丁丁语的的“发发泡””，fervere。发酵概概念的的发展展利用微微生物物在有有氧或或无氧氧条件件下的的生命命活动动来制制备微微生物物菌体体或代代谢产产物的的过程程统称称为发发酵。。一、发发酵及及发酵酵工程程的概概念发酵工工程概概论发酵工工程概概念：：是指采采用工工程技技术手手段，，利用用生物物（主主要是是微生生物））和有有活性性的离离体酶酶的某某些功功能，，为人人类生生产有有用的的生物物产品品，或或直接接用微微生物物参与与控制制某些些工业业生产产过程程的一一种技技术。。从广义义上讲讲，由由上游游工程程、中中游过过程（（发酵酵工程程）、、下游游过程程三部部分组组成。。发酵工工程概概论上游工工程下游工工程优良菌菌株的的选育育保藏藏、发发酵条条件的的确定定（pH、温度度、溶溶氧和和营养养）等等产品分分离纯纯化（（固液液分离离、细细胞破破壁、、蛋白白质纯纯化））、喷喷雾干干燥、、产品品检验验、包包装处处理等等强调过过程优优化与与控制制发酵过过程发酵工工程概概论发酵酵工工程程传统发酵工工程现代发酵工工程利用微生物物的生长和和代谢活动动来大量生生产人们所所需产品的的过程理论与工程程技术体系系。该技术术体系主要要包括菌种种选育与保保藏、菌种扩大生产产、代谢产产物的生物物合成与分分离纯化制制备等技术术集成。是将DNA重组及细胞胞融合技术术、酶工程程技术、组组学及代谢谢网络调控技术、过过程工程优优化与放大大技术等新新技术与传传统发酵工工程融合，，大大提高高传统发酵酵技术水平平，拓展传传统发酵应应用领域和和产品范围围的一种现现代工业生生物技术体体系（新一一代工业生生物技术））。强调现代生生物技术、、控制技术术和装备技技术在传统统与现代发发酵工业领域的集成成应用。发酵工程概概论抗生素、生生物制药、、氨基酸、、核苷酸、、有机酸、饲饲料添加剂剂、微生态态制剂、生物农药、、生物肥料料等基因工程药药物、细胞胞工程药物物、疫苗；替代代石油工业业的大宗量量的生物基化化学品等，，以及传统统发酵工业升升级。传统生物发发酵现代生物发发酵1900以以前天天然发酵阶阶段1900——1940纯纯培养养技术的建建立（巴斯斯德等，人人为控制））1940——1950通通气搅搅拌纯培养养发酵技术术的建立（（青霉素液液体深层培培养）1950——1960诱诱变技技术与代谢谢控制发酵酵技术的建建立（赖氨氨酸发酵生生产）1960——1970开开拓发发酵原料时时期（石油油发酵时期期）1970年年以后进进入基基因工程菌菌发酵时期期，以及细细胞大规模培养养技术的全全面发展。。近年来，以以现代生物物技术和过过程工程技技术为基础础的现代发酵工工业突飞猛猛进。二、发酵工工程的发展展简史发酵工程特特点及其类类型1.多个反反应过程可可在发酵过过程中一次次完成；2.反应通通常在常温温常压下进进行，条件件温和，能能耗少，设设备很简单单；3.原料来来源广泛，，可再生；；4.可特异异性地进行行复杂的化化学反应；；5.要求无无菌操作。。一、发酵的的特点二、发酵生生产类型1、以微生生物细胞为为产物的发发酵2、以微生生物代谢产产物为产品品的发酵3、以微生生物酶为产产品的发酵酵4、生物转转化或修饰饰化合物的的发酵5、微生物物废水处理理和其他1、生产微微生物细胞胞物质定义：是以获得具具有多种用用途的微生生物菌体细细胞为目的的的产品的的发酵工业业（酵母、、藻类、单单细胞蛋白白、药用真真菌、生物物杀虫剂等等）。特点：细胞的生长长与产物积积累成平行行关系，生生长速率最最大时期也也是产物合合成速率最最高阶段，，生长稳定定期产量最最高。2、微生物物代谢产物物发酵包括初级代代谢产物、、中间代谢谢产物和次次级代谢产产物。对数生长期期形成的产产物是细胞胞自身生长长所必需的的，称为初初级代谢产产物或中间间代谢产物物，如氨基基酸、核酸酸、蛋白质质等各种次级代代谢产物都都是在微生生物生长缓缓慢或停止止生长时期期即稳定期期所产生的的，来自于于中间代谢谢产物和初初级代谢产产物，如抗抗生素。从初生代谢谢到次生代谢谢3、微生物物酶发酵产酶的特点点：产酶的微生生物种类多多，易于工工业化生产产，便于改改善工艺提提高产量。。分类：胞内酶和和胞外酶生物合成特特点：需要诱导作作用，或遭遭受阻遏、、抑制等调调控作用的的影响，在在菌种选育育、培养基基配制以及及发酵条件件等方面需需给予注意意。4、微生物物的转化发发酵微生物转化化是利用微微生物细胞胞的一种或或多种酶，，把一种化化合物转变变成更有经经济价值的的产物。如如维生素C。5、微生物物特殊机能能的利用利用微生物物消除环境境污染利用微生物物发酵保持持生态平衡衡微生物湿法法冶金利用基因工工程菌株开开拓发酵工工程新领域域。发酵方法的的分类及流流程一、分类：：根据对氧的的需要区分分：厌氧发酵、、有氧发酵酵和兼性厌厌氧发酵根据培养基基物理性状状区分：液体和固体体发酵根据从微生生物生长特特性区分：：分批发酵、、补料分批批发酵和连连续发酵根据培养方方式区分：：表面发酵和和深层发酵酵二、典型分分批发酵工工艺流程图图主发发酵罐罐种子培养锅炉空气压缩机空气过滤器蒸煮灭菌pH调节液培养基原料料罐纯种分离斜面培养摇瓶培养配料罐菌体分离后后处理发酵过程控控制培养基制备备种子子罐液体产品固体产品产品精制发酵过程工工艺控制发酵是一个个复杂的生生物化学过过程影响因因素很多：：菌种、培培养基、温温度、pH、溶氧、、污染等。。主要包括括：一、提供优优良的菌种种二、掌握好好移种时机机和接种量量三、发酵过过程中的代代谢变化及及控制四、基质浓浓度变化及及控制五、温度对对发酵的影影响及控制制六、溶解氧氧对发酵的的影响及控控制七、pH对对发酵的影影响及其控控制八、CO2对发酵的的影响及其其控制九、泡沫对对发酵的影影响及其控控制十、发酵终终点的判断断及异常发发酵情况的的处理发酵过程工工艺控制要想通过发发酵工程获获得符合人人们要求的的产品，菌菌种的优劣劣是影响发发酵水平的的先决条件件。那么优优良的菌种种具备哪些些特性呢？？一、提供优优良的菌种种1、细胞的生生活力强，，移种至发发酵罐后能能迅速生长长2、不产生或或少产生副副产物及其其他产物3、能广泛利利用原材料料，并高效效地将原料料转化为产产品的能力力4、无杂菌污污染；具有有抗噬菌体体感染的能能力5、泡沫少6、遗传特性性稳定，生生产能力强强二、掌握好好移种时机机和接种量量依据菌体（（丝）形态态、菌龄、、OD或特特定的参数数指标综合合判断。移种过早：：生长缓慢慢，发酵周周期延长；；给于杂菌可乘乘之机。移种过晚：：菌体生长长活力减弱弱，转入新新培养基调整期期延长。接种时间：：对数生长长期，菌体体量还未达达最高峰。。接种量：决决定于生产产菌种在发发酵罐中的的繁殖速度度。一般地，接接种量为10%左右右。接种量过小小，除延长长发酵周期期外，往往往还引起其其它不正常常情况。接种量过高高，会使菌菌体生长过过快，培养养液粘度过过高，造成成供氧不足足。典型生长曲曲线不同生长时时期对比情情况微生物发酵酵生产的水水平除了取取决于生产产菌种的性性能；同时时还需要有有最佳的环环境条件即即发酵工艺艺加以配合合，才能使使其生产能能力充分表表现出来。。最佳发酵工工艺条件：：如营养要要求、培养养温度、pH条件、、对氧的需需求等的控控制，使生生产菌种处处于最佳的的产物合成成条件下。。由于微生物物发酵经过过很多生物物化学反应应步骤，往往往环境条条件的微小小变化，就就会对微生生物的生产产能力产生生明显影响响。所以，，为了控制制整个发酵酵过程，必必须了解微微生物在发发酵过程中中的代谢变变化规律，，通过检测测方法测定定各种发酵酵参数随时时间变化的的情况，以以便能够控控制发酵过过程，使生生产菌种的的生产能力力得到充分分发挥。三、发酵过过程中的代代谢变化及及规律与代谢有关关的参数：：1、物理参参数⑴、温度⑵、罐压⑶、搅拌速速度⑷、空气流流量⑸、表观粘粘度⑹、发酵液液重量2、化学参参数⑴、基质浓浓度⑵、pH⑶、产物浓浓度⑷、DNA量⑸、关键酶酶⑹、溶解氧氧⑺、排气中中的氧含量量⑻、排气中中的CO2含量3、生物参参数⑴、菌丝形形态⑵、菌丝干干重或湿重重⑶、菌体比比生长速率率⑷、氧的比比消耗速率率⑸、糖的比比消耗速率率⑹、氮的比比消耗速率率⑺、产物的的比生产速速率四、基质浓浓度变化及及控制（一）、碳碳源浓度变变化及控制制碳源物质是是发酵过程程中菌体生生长和产物物合成的能能量和碳素素的来源。。在发酵的前前期，碳源源物质主要要用于生长长，消耗较较快；在发发酵后期，，碳源物质质主要用于于产物合成成，消耗速速度放缓。。快速利用的的碳源物质质：对生长长有利，对对次级代谢谢产物的形形成有抑制制作用。缓慢利用的的碳源物质质：对延长长产物的合合成是有利利的，尤其其是次级代代谢产物。。到发酵的中中后期，发发酵液中的的残糖基本本耗尽，影影响产物的的合成。如果采用丰丰富碳源的的培养基，，又会产生生其它的问问题：如培养基浓浓度过高，，影响通气气搅拌，过过高的碳源源浓度也抑抑制菌体的的生长。解决的方法法是采取““中间补料料”（二）、氮氮源浓度变变化及控制制氮源物质主主要用于菌菌体中蛋白白质、核酸酸等含氮物物质的合成成，有些发发酵产物中中含有氮。。发酵前期，，氮源物质质随菌体浓浓度的急剧剧增加而迅迅速减少；；发酵中期期，氮源（（氨基氮））的下降速速度比较缓缓慢；发酵酵后期，由由于菌体自自溶，氨基基氮会回升升。氮源物质往往往抑制次次级产物的的合成。快速利用的的氮源物质质：如氨水、铵铵盐促进菌菌体生长。。缓慢利用的的氮源物质质：有利于延长长产物的合合成期。如果氮源物物质投料多多，会造成成菌体生长长快，但菌菌体衰老也也快。解决方法：：“中间补补料”。五、温度对对发酵的影影响及控制制温度是影响响有机体生生长繁殖最最重要的因因素之一，，因为任何何生物化学学的酶促反反应都是直直接与温度度变化有关关的，最终终影响微生生物的生长长和产物形形成。1、温温度度对对微微生生物物细细胞胞生生长长的的影影响响2、温温度度影影响响生生物物合合成成的的方方向向3、温温度度对对产产物物形形成成的的影影响响4、温温度度影影响响发发酵酵液液的的物物理理性性质质5、温温度度归归根根结结底底是是影影响响酶酶的的活活力力。。最适适温温度度的的选选择择与与发发酵酵温温度度的的控控制制选择择最最适适发发酵酵温温度度应应该该考考虑虑三三个个方方面面：：1））微微生生物物生生长长的的最最适适温温度度和和产产物物合合成成的的最最适适温温度度。。2））不不同同的的菌菌种种、、菌菌种种不不同同的的生生长长阶阶段段最最适适温温度度都都会会不不同同。。3））最最适适发发酵酵温温度度，，与与培培养养基基成成分分和和浓浓度度等等相相关关。。温度度的的控控制制依靠靠夹夹层层或或蛇蛇管管控控制制。。目前前许许多多发发酵酵罐罐都都采采用用自自动动化化控控制制，，但但要要常常巡巡查查，，确确保保其其正正常常运运行行。。六、、溶溶解解氧氧对对发发酵酵的的影影响响及及控控制制溶解解氧氧（（CL）：：溶溶解解于于液液体体（（发发酵酵液液））中中的的氧氧。。氧难难溶溶于于水水，，在在25℃℃，，1标标准准大大气气压压下下，，氧氧在在水水中中的的溶溶解解度度为为0.26mmol/L，，临界界溶溶解解氧氧浓浓度度（（CCr）：：满满足足微微生生物物呼呼吸吸的的最最低低限限度度的的溶溶解解氧氧浓浓度度。。一般般好好气气性性微微生生物物约约为为0.003～～0.05mmol/L之之间间。。最适适氧氧浓浓度度（（Cm）：溶氧氧浓浓度度对对产产物物合合成成有有一一个个最最适适范范围围，CL过高高或或过过低低，，对对合合成成都都不不利利。在好好氧氧深深层层培培养养中中，，氧氧气气的的供供应应往往往往是是发发酵酵能否否成成功功的的重重要要限限制制因因素素之之一一。。（一一））影影响响需需氧氧和和供供氧氧的的因因素素影响响需需氧氧量量的的因因素素1、、菌菌种种特特性性2、、菌菌体体浓浓度度3、、菌菌龄龄4、、培培养养条条件件5、、代代谢谢类类型型6、、培培养养基基成成分分和和浓浓度度影响响供供氧氧量量的的因因素素1、搅搅拌拌转转速速2、通通气气量量3、泡泡沫沫情情况况4、微生物生长长情况5、设备结构和和参数6、发酵液的理理化特性（二）发酵过过程中溶氧变变化规律批式发酵无DO控制情况下，，溶氧变化规规律为“波谷谷现象”。当处于高位平平衡时，表明明供氧性能好好。高位平衡衡通常发生在在正常情况的的前、后期。。低位平衡通常常发生在正常常情况下的对对数期。自然“波谷现现象”，一般般可以自适应应调节。补料与“波谷谷现象”对应应：即补料时时间、剂量选选择与溶氧变变化有关。a.不能在波谷时时补料，加重重缺氧b.一次补料不能能过量，防止止菌体停止呼吸吸、死亡c.每次补料都会会引起一次大大的溶氧下降降。（三）溶解氧氧的应用（1）发酵异异常指标发酵中污染杂杂菌，溶解氧氧发生异常变变化。对于好气性杂杂菌，溶解氧氧会一反往常常在较短时间间内跌到零附附近，跌零后后长时间不回回升。对于厌气性杂杂菌，溶解氧氧升高。污染噬菌体或或其它不明原原因引起发酵液变稀，，此时溶解氧氧迅速上升。。操作故障或事事故分析谷氨酸正常发发酵和异常发发酵的溶解氧氧曲线——正常发酵溶解解氧曲线-----异常发酵溶解解氧曲线—·—异常发酵光密密度曲线（2）补料控制指标标中间补料是否否得当可以从从溶解氧的变化看出。。发酵过程中出出现“发酸””现象，此时时溶解氧很快快下降。（3）代谢方方向控制指标标通过溶氧测量量可以掌握由由好氧转为厌厌氧培养的关关键时机。在酵母以及其其他微生物菌菌体的生产中中，溶氧值是是控制其代谢谢方向的最好好的指标之一一。（4）设备性性能、工艺合合理性指标（四）溶解氧氧的控制（1）溶解氧氧控制的一般般原则生长阶段：CL>CCr生产合成阶段段：CL≈Cm过高的溶氧水水平反而对菌菌体代谢有不不可逆的抑制制作用（2）溶解氧控制作作为发酵中间间控制的手段段之一控制原理发酵过程中，，糖量↑→CL↓糖量↓→CL↑补糖使CL下降，而CL回升的快慢取取决于供氧效效率。对于一个具体体的发酵，存存在一个最适适氧浓度（Cm）水平，补糖速速率应与其相相适应。，加大补糖速率率，减小补糖速率率实现用溶解氧氧水平控制补补料速率补糖速率控制制在正好使生生产菌处于所所谓“半饥饿饿状态”，使使其仅能维持持正常的生长长代谢，即把把更多的糖用用于产物合成成。控制原则加强搅拌转速速；适当的空气流流量；减小培养基粘粘度；提高氧分压；；调节微生物呼呼吸强度的临临界值；合适的细胞浓浓度、碳源种种类、pH、温度等。（3）提高溶氧的的方法七、pH对发酵的影响响及其控制发酵液的pH变化，与发发酵的关系极极为密切，对对菌体的生长长繁殖和产物物积累的影响响极大，因此此是一项重点点检测的发酵酵参数。（一）发酵液液中pH变化的基本原原理微生物代谢对对pH影响主要在两两种情况下发发生：①酸性性或碱性代谢谢产物的生成成或释放；②②菌体对培养养基中生理酸酸性或碱性物物质的利用。。引起发酵液中中pH下降的因素（1）C/N比过高，或中中间补糖过多多，溶氧不足足，致使有机机酸积累，pH下降；（2）消泡剂剂加得过多：：脂肪酸增加加；（3）生理酸酸性盐的利用用；（4）酸性产产物形成：如如有机酸发酵酵。引起发酵液中中pH上升的因素（1）C/N比过低（N源过多），氨氨基氮（NH4＋）释放；（2）中间补补料中氨水或或尿素等碱性性物质加入过过多；（3）生理碱碱性盐的利用用；（4）碱性产产物形成。（二）发酵过程中pH的变化规律生长阶段：pH相对于起始pH有上升或下降降的趋势生产阶段：pH趋于稳定，维维持在最适于于产物合成的的范围自溶阶段：pH又上升（三）pH值对发酵酵的影响pH值直接影影响酶活性；；pH影响生物物合成的途径径；pH值影响菌菌体形态，如如壁厚薄、长长径比；pH值改变使使原生质膜电电荷发生改变变，影响菌体体对营养物质质的吸收和代代谢产物的排排出；pH值影响某某些重要营养养物质和中间间代谢产物的的离解，从而而影响微生物物对这些物质质的利用。（四）影响pH变化的因因素培养基成份；；微生物代谢特特性；发酵条件改变变，如通气量量；菌体自溶或杂杂菌污染。（五）最适pH的选择与与调节选择pH准则则：获得最大比生生产速率和合合适的菌体量量，以获得最最高产量。配制不同初始始pH的培养养基，摇瓶考考察发酵情况况。pH的调节方方法：1、调节培养养基的配方2、补料控制制①加酸、加加碱②增加无机机氮源③增加碳源源物质3、调节通气气量八、二氧化碳碳对发酵的影影响及控制CO2是微生物的代代谢产物，同同时也是某些些合成代谢所所需的一种基基质或生长因因子。（一）CO2来源（二）CO2对发酵的影响响影响发酵液的的酸碱平衡；；影响菌体生长长、形态及产产物合成；CO2及HCO3－主要是是影响响细胞胞膜的的结构构；CO2效应：：不同同微生生物或或某一一生长长阶段段对CO2有着特特殊的的要求，（（促进进或必必需））；CO2通常对对菌体体生长长有抑抑制作作用。。排气气中高高于4％时，，糖代代谢和和呼吸速速率下下降。。发酵液液中的的CO2浓度为为1.6×10-2mol时，会会严重重抑制制酵母母菌的的生长。。（三））CO2浓度的的控制制方法法1、发发酵液液中CO2浓度的的影响响因素素：◆细细胞胞呼吸吸强度度；◆发发酵酵液流流变学学特性性；◆通通气气搅拌拌程度度；◆罐罐压压大小小；◆设设备备规模模。2、二氧氧化碳碳浓度度的控控制方方法：：◆调调节节罐压压、通通气量量和搅搅拌速速度；；◆补补料料。（（如补补糖，，增加加CO2产生，，降低低PH。））九、泡泡沫对对发酵酵的影影响及及控制制（一））泡沫沫产生生的原原因通风和和搅拌拌产生生泡沫沫微生物物代谢谢气体体形成成泡沫沫泡沫的的产生生与培培养基基性质质有关关种子和和接种种量染菌（二））泡沫沫对发发酵的的危害害泡沫是是好氧氧发酵酵中的的正常常现象象，但但过多多的泡泡沫给给发酵酵带来来负面面影响响：使装量量减少少，或或造成成跑液液，使使产量量降低低；通过轴轴封泄泄漏，，污染染设备备，增增加染染菌机机会；；菌体粘粘附罐罐顶、、罐壁壁，发发酵液液中菌菌体量量减少少；影响通通气搅搅拌的的进行行，造造成减减产或或菌体体提前前自溶溶；菌体提提前自自溶会会促使使更多多泡沫沫形成成，恶恶性循循环；；减风量量，影影响溶溶解氧氧浓度度，影影响生生长、、代谢谢；加消泡泡剂，，给提提取工工艺带带来困困难。。（三））泡沫沫的控控制1、机