微生物学检验(第3版)2012铜绿假单胞菌与痰液课件

1痰液和呼吸道标本的微生物检查及铜绿假单胞菌培养鉴定临床微生物与免疫学教研室铜绿假单胞菌1、革兰阴性杆菌，无芽孢，动力阳性32、产生荧光素和水溶性的绿脓素，培养物呈蓝绿色；3、在血平板上形成大而扁平、湿润、有金属光泽、蓝绿色、透明溶血环菌落，有生姜味；4、在中国蓝平板上形成不发酵乳糖菌落（不发酵乳糖细菌的菌落是半透明，淡紫红色，分解乳糖的细菌是大而浑浊的蓝色菌落）55、生化特征

氧化酶＋

O/F：OKIA：K/K枸櫞酸盐利用：＋精氨酸双水解：＋明胶液化：＋硝酸盐还原：N26硝酸盐还原试验硝酸盐亚硝酸盐（红色）硝酸盐氨、氮气锌粉还原亚硝酸盐阳性阳性不变色亚硝酸盐还原还原还原未还原锌粉未反应阴性不变色7目的要求掌握呼吸道标本的细菌学检验和报告方法掌握銅绿假单胞菌的培养特征、主要微生物特性及鉴定方法。了解呼吸道标本的采集方法。8器材和试剂1、标本：痰液标本

2、菌种：铜绿假单胞菌

3、培养基：血平板、中国蓝平板、克氏双糖斜面培养基、半固体培养基、非发酵菌微量生化管等。101.鼻咽拭子采集时，患者用清水漱口，对光而坐，头向上仰张大口，用压舌板轻压舌根，取无菌鼻咽拭子绕过悬雍垂，在鼻咽腔、悬雍垂后侧反复涂抹数次小心取出，避免接触口腔部其他组织。2．咽拭子将拭子用无菌生理盐水湿润，用压舌板轻压舌根，暴露整个口咽部。先用拭子轻擦扁桃体表面后弃去，再取1支湿润的拭子轻压扁桃体，擦取挤压出的分泌物，或擦取伪膜等病变部位。标本的采集123.痰液标本（1）自然咳痰法：受检者用清水溯口数次后，用力咳嗽自气管深部将痰咳出吐至无菌容器中。对痰量少或无痰等咳痰困难者，可雾化吸入45℃左右的10%氯化钠水溶液，使痰容易排出。对于幼儿，可轻轻压迫胸骨上部气管，使其咳嗽而取之。标本的采集14革兰阳性细菌革兰阴性细菌正常菌群α和γ链球菌、微球菌、表皮葡萄球菌、四联球菌、白喉以外的棒状杆菌、乳杆菌

除脑膜炎和淋病奈瑟菌外的其他奈瑟菌、其他嗜血杆菌

上呼吸道常见致病菌

化脓性链球菌、金黄色葡萄球菌、白喉棒状杆菌、结核分枝杆菌、白色念珠菌

脑膜炎奈瑟菌、流感嗜血杆菌、百日咳鲍特菌、肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌

下呼吸道常见致病菌

化脓性链球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、白喉棒状杆菌、结核分枝杆菌、厌氧菌、放线菌、奴卡菌

脑膜炎奈瑟菌、流感嗜血杆菌、肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、产气肠杆菌、嗜肺军团菌痰液标本常见的分离菌15血平板巧克力平板中国蓝平板

鼻咽拭子

直接涂片染色检查革兰染色异染颗粒初步报告

白喉棒状杆菌培养菌落形态、涂片染色初步报告

生化反应、血清学鉴定检验程序常规培养

百日咳杆菌培养

血清斜面培养基鸡蛋培养基鲍-金培养基亚碲酸钾血平板纯培养菌落形态、涂片染色16血平板巧克力平板中国蓝平板

普通培养普通培养普通培养

35℃、18~24h35℃、18~24h35℃、18~24h痰液标本

肉眼观察

涂片染色观察

初步报告

培养前处理

菌落形态和涂片染色

生化反应、血清学鉴定报告

检验程序171、肉眼观察：下呼吸道标本为痰液，选取脓血性的痰液用于细菌学检验。异常恶臭的脓性痰，常见于肺脓疡患者，而且可能与厌氧菌有关。痰液中有颗粒状、菌块和干酪样物质可能与放线菌病和曲霉菌感染有关。痰液标本检验操作流程182、涂片检查：挑选痰液中脓、血性部分涂片，干燥固定后，进行革兰染色镜检。如发现形态典型、有特殊结构，初步可以确定所属菌属或种的细菌，可直接报告。如查见革兰阳性葡萄状排列的球菌，可报告“痰液涂片查见革兰阳性球菌，形似葡萄状”；痰液标本检验操作流程203、分离培养：

1）痰液标本的前处理

A.均质化法：加入等量的PH7.6的1%胰酶溶液，放置35℃、90min使痰液均质化；

痰液标本检验操作流程21B.洗涤法：取无菌平皿4个，加入无菌生理盐水20ml，将痰液标本放入第1个平皿中，用接种环用力震摇，将脓痰分散为小块悬浮于盐水内，将小块脓痰取出依次放入第2、3、4个平皿中重复以上操作。最后在第4个平皿收集脓痰小块，接种于平皿。同时接种未经洗涤的痰液标本，作为对照。痰液标本检验操作流程23特殊菌的培养1.结核分枝杆菌培养：无菌吸管加前处理标本2-3滴于罗-琴培养基35℃孵育至8周，每周观察一次；2.嗜肺军团菌培养：取气管分泌物接种于活性炭酵母琼脂(CYE)或费-高(F-G)平板，35℃、2.5%CO2培养，每天用肉眼观察，直至第14天；3.百日咳鲍特菌的培养：将标本直接接种在鲍-金培养基上，置有盖的玻璃缸（缸内加少量的水，并在水中加少许硫酸铜，防止细菌及霉菌生长）中，35℃

孵育3—5天。244.白喉棒状杆菌培养：将标本接种于血清斜面或鸡蛋培养基，35℃

孵育8-10h观察；5.流感嗜血杆菌培养：将标本接种于血平板和巧克力平板，并在平板中央接种一直线金黄色葡萄球菌（或四角点种），35℃、5%-10%CO2环境孵育18-24h。6.脑膜炎奈瑟菌培养：将鼻烟拭子接种于已保温在350C的卵黄双抗平板上，35℃、5%-10%CO2环境孵育18—24h。特殊菌的培养26注意事项1.上呼吸道标本要及时送检，防止干燥。采集时尽量避免正常菌群的污染。 2.痰液标本最好采取晨痰。3.上呼吸道有大量的正常菌群，正常情况下这些细菌并不致病，但在机体抵抗力下降或某些因素作用下，可以侵入下呼吸道致病。特别是在抗生素作用下或在大量正常菌群掩盖下，致病菌难以检出。27一、痰液标本分区画线接种到血平板、中国蓝平板二、提供的菌落1、进行涂片G染色观察细菌形态；2、触酶试验、氧化酶试验；3、接种于半固体、克式双糖培养基；4、接种到各种非发酵菌生化鉴定培养基中；三、放入35℃恒温培养箱进行培养具体实验操作第一天的主要操作：28非发酵细菌生化鉴定编码表O-F试验4321氧化酶拘橼酸盐麦芽糖精氨酸酶精对

甘露醇木糖硝酸盐还原DNA酶乙酰氨酶厌氧需氧淡绿黄色无色淡绿淡绿黄色紫色红色黄色蓝色黄色淡绿淡绿黄色黄色黄色无色红色绿色灰白黄色红色原来颜色阳性颜色淡绿黄色标记为红色的加石腊油302.观察半固体培养基具体实验操作第二天的主要操作：313.观察克式双糖培养基具体实验操作第二天的主要操作：324.压片法观察动力情况具体实验操作第二天的主要操作：3334354.观察生化反应，查表鉴定具体实验操作第二天的主要操作：36非发酵细菌生化鉴定编码表O-F试验4321氧化酶拘橼酸盐麦芽糖精氨酸酶精对

甘露醇木糖硝酸盐还原DNA酶乙酰氨酶厌氧需氧淡绿黄色无色淡绿淡绿黄色