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实验技术-空斑纯化方法步骤以及若干问题实验技术-空斑纯化方法步骤以及若干问题实验技术-空斑纯化方法步骤以及若干问题xxx公司实验技术-空斑纯化方法步骤以及若干问题文件编号：文件日期：修订次数：第1.0次更改批准审核制定方案设计，管理制度材料和试剂：DMEM培养基，细胞板，中性红，琼脂糖，PBS或无抗无血培养基，1ml和10ml移液管等。操作步骤：1PK15细胞铺细胞板，细胞密度要较高，才容易形成空斑（但太高了也不好，有可能会形成很多层细胞，导致有的细胞形成病变的地方有其他层的细胞没有坏死也被染色从而无法形成空斑）。2过夜后，用无抗无血的培养基清洗洗吧，然后再进行病毒吸附，原液进行10倍倍比稀释，自己可以摸索一下感染稀释度，一般病毒价较低的时候，可以降低稀释度。看空斑形成情况，要是空斑形成太大，连成片，就得增加稀释度。3吸附1-2小时，用无抗无血培养基（或无菌PBS）清洗2-3遍后配制第一次覆盖液。使用%的琼脂糖（加热至液体状）和两倍DMEM溶液等体积混合，逐滴加到细胞板中。没孔加入1-2ml覆盖液。放置于37度培养箱中培养。4每天观察细胞病变情况，出现明显病变时进行二次覆盖，覆盖液和第一次差不多，只是要加入细胞染色液中性红（%），一般体积比为10ml：10ml：1ml（可以适当增加一点，如果染色效果不良的话）。5染色5H以上应该就可以观察染色情况，理论上伪狂犬病毒应能形成白色空斑而PCV2不会产生空斑。在不知道PCV2在哪里的情况下，我们随机挑取若干个没有空斑的细胞，而后进行传代。应该可以得到无伪狂犬污染的PCV2病毒种。1蚀斑实验需要细胞长至什么程度可以接毒？

显微镜下观察，一般情况下，铺满细胞板底部即可，这样不会造成空洞影响蚀斑观察。不同的细胞不一样，一般时候是长满T25的细胞传一个六孔板，第二天就接毒。

2细胞上用什么覆盖物琼脂琼脂糖低熔点琼脂糖浓度应该是多大

我用的是lonza公司的低熔点琼脂糖，终浓度是%。感觉不错，就是挺贵的，2k+人民币。

3如果做挑斑纯化，是不是就不可以染色，染色后对毒力有何影响？

不染色就可以看出来，因为培养基本身里面就含有酚红呈现颜色，形成的斑没有颜色，可以直接挑斑；我也染色后挑过，感觉影响不大，可能不同病毒不一样吧。

4由于细胞上有覆盖物，那么该如何挑斑？

我用的是1ML

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