各种显微技术-制片-染色

形态学研究技术显微镜介绍（PPT3~18）固定（PPT19~20）组织切片（PPT21~25）组织染色（PPT26~30）免疫组织化学/免疫细胞化学（PPT31~56）荧光染料（PPT57~65）定量分析（PPT66~77）应用（PPT78~88）电子显微镜（PPT89~102）显微镜的介绍★四种光学显微镜：亮视野；相差；微分干涉相差；暗视野（用的非常少，比如原位杂交中同位素标记的点是亮的，用暗视野显微镜在暗背景下看到的亮点会更清楚）★倒置显微镜：可操作空间大，可以做电生理等实验，最常用的观察方法是相差，由于此方法不需要染色，因此是观察活细胞的理想方法，分辨率不如正置组成和普通显微镜一样，只不过物镜与照明系统颠倒，前者在载物台之下，后者在载物台之上，倒置显微镜和放大镜起着同样的作用，就是把近处的微小物体成一放大的像，以供人眼观察。只是显微镜比放大镜可以具有更高的放大率而已。目镜的作用与放大镜一样。所不同的只是眼睛通过目镜所看到的不是物体本身，而是物体被物镜所成的已经放大了一次的像。★体视显微镜：视野大可作精细解剖和/或胚胎，分辨率不如正置1．双目镜筒中的左右两光束不是平行的，而是具有一定的夹角——体视角（一般为12度---15度），因此成像具有三维立体感；2．像是直立的，便于操作和解剖，这是由于在目镜下方的棱镜把像倒转过来的缘故；3．虽然放大率不如常规显微镜，但其工作距离很长4．焦深大，便于观察被检物体的全层。5．视场直径大。★荧光显微镜：光源是汞灯,有滤镜。固定后的细胞、组织用荧光染料；活体细胞用荧光蛋白。荧光显微镜和普通显微镜有以下的区别：1.照明方式通常为落射式，即光源通过物镜投射于样品上；2.光源为汞灯紫外光，波长较短，分辨力高于普通显微镜；3.有两个特殊的滤光片，光源前的用以滤除可见光，目镜和物镜之间的用于滤除紫外线，以保护人目。（荧光素的标记只是作为一种指示剂，不像电子显微镜下面看到的是真实物体，要真正敲定某种物质的location只能借助电镜）★共聚焦显微镜：（结构，原理）光源不是汞灯,是激光器，（注：在观察的时候，使用汞灯为光源，拍摄的时候使用激光器）与普通的CCD成像不同,普通的CCD成像杂光多，不清晰，颜色是真彩,共聚焦显微镜的颜色是伪彩（同一个激光器有几个不同的波长，可据荧光素选择具有需要波长的激光器。不同于普通荧光显微镜激发光是某一波段内的光，激光器发出的是某一特定波长的光，能量集中，功率大。）从一个点光源发射的探测光通过透镜聚焦到被观测物体上，如果物体恰在焦点上，那么反射光通过原透镜应当汇聚回到光源，这就是所谓的共聚焦，简称共焦。共焦显微镜(CLSM或LSCM)]在反射光的光路上加上了一块半反半透镜，将已经通过透镜的反射光折向其它方向，在其焦点上有一个带有针孔(Pinhole)，小孔就位于焦点处，挡板后面是一个光电倍增管(photomultipliertube，PMT)。可以想像，探测光焦点前后的反射光通过这一套共焦系统，必不能聚焦到小孔上，会被挡板挡住。于是光度计测量的就是焦点处的反射光强度。其意义是：通过移动透镜系统可以对一个半透明的物体进行三维扫描。★成像系统eq\o\ac(○,1)digitalcameraimagingsystem(CCD)（真彩）CCD的真实名称为电荷耦合器件，工作原理是CCD将光线转换成模拟电压信号，并且标出每个象素的灰度级，再由一个模数转换器将模拟电压信号转换为数字信号，每种颜色使用8、10或12位来表示，逐点扫描后，通过扫描图像专用格式保存在电脑里。成像过程中，光源发出的光必须经过镜片的反射和透镜的聚焦，且得到的图像是真彩。eq\o\ac(○,2)共聚焦成像-----激光共聚焦显微镜（伪彩）有小孔，分辨率高，但进入的光量也少，需在两者间达到平衡；不是CCD那种全量，而是只扫描某个部分，得到的pic每张都在焦点上，可以叠加；得到的灰白pic可以人为赋予各种颜色。固定★固定的目的和作用若想得到理想的染色结果、正确地判断抗原物质在组织细胞内的位置，除需有良好的酶和抗体外，保持组织细胞内抗原物质的不动性（immobility）和免疫活性也是至关重要的。固定的目的在于迅速终止酶的活性，避免组织细胞结构的解体，阻止细胞内外肽类和蛋白质的扩散移位，增强组织细胞对标本制作过程中各种有害影响的对抗作用，总之，在于达到固定抗原和保存组织细胞形态结构的目的。尤其是保持抗原分子上有限数目氨基酸顺序和抗原决定簇的完整性，保持抗原分子三维空间构型的稳定性以便于结合特异性抗体。尤其是大多数神经激素和肽类物质，因为具有水溶性，在进行免疫组织化学研究之前，常常需要固定处理。但是肽类物质和蛋白质的物理化学性质不同，因而对不同的固定剂或者固定方法的适应程度也不尽相同。某些固定剂甚至可以同时破坏和/或保护同一抗原物质的不同抗原决定簇。因此，在进行免疫组织化学研究的时候，先要了解所研究物质（如蛋白质和肽类）的化学性质，再根据需要来选用适宜的固定剂或固定方法，改进固定的条件。★固定剂选择最佳固定液的标准是：①最好地保持细胞和组织的形态结构；②最大限度地保存抗原的免疫活性。值得注意的是免疫组织化学技术中禁用含重金属的固定液。免疫组织化学研究中常用的固定剂：交联固定：多聚甲醛、戊二醛（glutaraldehyde）沉淀固定:乙醇、甲醇、丙酮（acetone）细胞可选择的固定液多，一般固定10min～20min。★pH：较多中性固定液（PH7.4），有时也会用酸性或碱性固定液用不同的磷酸缓冲液配制PFA（多聚甲醛），得到酸、中、碱性固定液。★固定的时间：长,对组织结构有好处,但对抗原不一定好；组织固定时间最好在l2h内，一般固定时间不应超过24小时。随着固定时间的延长对组织抗原的检出强度将逐渐降低。★常用的固定方法有两种：浸入法和灌注法。浸入法即将组织浸泡在固定液内（必要时在4℃灌注法主要适用于动物研究；灌注固定可以使固定液迅速到达全身组织充分固定。★Procedure（灌注,浸泡,后固定）★蔗糖（10%、20%、30%）-----高渗的蔗糖溶液，能够置换出水，所以可作为冰冻切片前的冻融保护。蔗糖脱水的作用：eq\o\ac(○,1)冰冻切片时的冻融保护，eq\o\ac(○,2)提高染色时抗原的浓度。★固定时应注意力求保持组织新鲜，勿使其干燥；组织块不宜过大过厚，组织块厚度必须控制在0.3cm以内；固定液必须有足够的量，在体积上一般大于组织20倍以上，否则组织中固定不良而影响效果；组织固定后，应充分水洗，去除固定液，以减少固定液造成的人为假象。三、切片★冰冻切片是免疫组织化学中最常用的一种切片方法，能够最大量的保存抗原、操作简便，主要适用于不稳定的抗原（如检测细胞膜的某些抗原成分），但标本来源受限。新鲜的组织及已固定的组织均可作冰冻切片。冰冻切片时,组织中水分易形成冰晶,影响抗原定位。冰晶小而多，对组织结构损害大。因此可采用以下措施减少冰晶的形成：①速冻，缩短组织从-33～-43℃的时间。（用干冰或液氮，但液氮易使组织冻裂）②冰冻切片一般用恒冷切片机。切片后如不染色，必须将切片吹干，贮存于低温冰箱内，进行短暂预固定干燥后贮存于低温。冰冻切片优缺点：eq\o\ac(○,1)不用任何包埋,迅速,薄,4～5μm,可以保存很长的时间eq\o\ac(○,2)缩短了制片时间eq\o\ac(○,3)抗原性不受损失eq\o\ac(○,4)对稳定性差的抗原，如淋巴细胞表面抗原尤其适合。★石蜡切片：在冰冻切片染色不好的情况下可选用石蜡切片，可作抗原修复。抗原修复：组织在制作过程中,由于化学试剂的作用封闭了抗原，又由于热的作用致使部分抗原的肽链发生扭曲,致使在免疫组化的染色过程中不能将其显示出来，为了解决上述的问题,利用化学试剂和热的作用将这些抗原重新暴露出来或修正过来的过程称为抗原修复。在制作切片或超薄切片时，由于组织是柔软的，或局部的软硬不均，这样制作厚薄均匀的切片是困难的。所以有必要用一定物质浸透组织内部，整个组织一样硬化，以利于切成薄片，这种物质叫做包埋剂。

包埋：就是将已经固定，脱水，透明，浸蜡的组织快从最后的蜡浴取出置入充满熔融石蜡的包埋框内，包埋成块，使组织和包埋剂相容一体并迅速冷却，这个程序称为包埋。包埋剂凝固后，进一步加强了组织的硬度和韧度而便于进行切片。石蜡切片的优缺点：eq\o\ac(○,1)石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法eq\o\ac(○,2)最大优点是组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察；eq\o\ac(○,3)石蜡块还能长期存档，供回顾研究。eq\o\ac(○,4)石蜡切片制作过程对组织内抗原显现有一定的影响，但可通过某些措施予以改善，因而它是大多数免疫组化中首选的组织标本制作方法。HE染色石蜡切片制作的基本过程（了解）1、取材与固定：

从人或动物新鲜尸体上取下组织块(一般厚度不超过0．5厘米)投入预先配好的固定液中(10％福尔马林，Bouin氏固定液等)使组织、细胞的蛋白质变性凝固，以防止细胞死后的自溶或细菌的分解，从而保持细胞本来的形态结构。

2、脱水透明：

一般用由低浓度到高浓度酒精作脱水剂，逐渐脱去组织块中的水份。再将组织块置于既溶于酒精，又溶于石蜡的透明剂二甲苯中透明，以二甲苯替换出组织块的中酒精，才能浸蜡包埋。

3、浸蜡包埋：

将已透明的组织块置于已溶化的石蜡中，放入溶蜡箱保温。待石蜡完全浸入组织块后进行包埋：先制备好容器(如折叠一小纸盒)，倒入已溶化的石蜡，迅速夹取已浸透石蜡的组织块放入其中。冷却凝固成块即成。包埋好的组织块变硬，才能在切片机上切成很薄的切片。（生物秀实验频道）

4、切片与贴片：

将包埋好的蜡块固定于切片机上，切成薄片，一般为5—8微米厚。切下的薄片往往皱折，要放到加热的水中烫平，再贴到载玻片上，放45℃恒温箱中烘干。

5、脱蜡染色：

常用HE染色，以增加组织细胞结构各部分的色彩差异，利于观察。苏木精(Hematoxylin，H)是一种碱性染料，可将细胞核和细胞内核糖体染成蓝紫色，被碱性染料染色的结构具有嗜碱性。伊红(Eosin，E)是一种酸性染料，能将细胞质染成红色或淡红色，被酸性染料染色的结构具有嗜酸性。染色前，须用二甲苯脱去切片中的石蜡，再经由高浓度到低浓度酒精，最后入蒸馏水，就可染色。

HE染色过程是：

①将已入蒸馏水后的切片放入苏木精水溶液中染色数分钟。

②酸水及氨水中分色，各数秒钟。

③流水冲洗1小时后入蒸馏水片刻。

④入70％和90％酒精中脱水各10分钟。

⑤入酒精伊红染色液染色2—3分钟。

6、脱水透明：

染色后的切片经纯酒精脱水，再经二甲苯使切片透明。

7、封固：

将已透明的切片滴上加拿大树胶，盖上盖玻片封固。待树胶略干后，贴上标笺，切片标本就可使用。★振动切片用振动切片机（Vibratome），可以把新鲜组织（不固定不冰冻）切成厚片20～100μm，以漂浮法在反应板进行免疫组织化学染色，然后在解剖显微镜下检出免疫反应阳性部位，修整组织进行后固定，最后按电镜样品制备、脱水、包埋、超薄切片、染色观察等。组织不冰冻，无冰晶形成和组织抗原破坏，在免疫组化染色前避免了组织脱水、透明、包埋等步骤对抗原的损害，能较好地保留组织内脂溶性物质和细胞膜抗原，主要用于显示神经系统抗原分布研究。这种包埋前染色，尤其实用于免疫电镜观察。应用：一是做电镜,常温最薄切到50μm；二是做漂片,即切一些厚的片子,把它漂在容器里染色,使两面都可以浸透；三是做脑片,但与做电镜的横向的切片机不同,要用垂直的振动切片机。水平振动切片机：室温下切，组织软，可得的比较厚的切片；可做漂片，两面都可以染色。垂直振动切片机：垂直切割，得到的切片上细胞可正常存活，可做脑片。四、组织染色★普通的组织染色：苏木精和伊红染色（HE染色）苏木精：碱性染料,结合组织的酸性化合物,染出的是蓝～紫色。嗜碱性的核,细菌,钙等被苏木精染成蓝色.时间长伊红：酸性染料,结合组织的碱性化合物,被伊红染色的结构呈粉～红色。伊红对细胞质、肌纤维、胶原纤维具有着色性。★特殊染色：其他细胞结构只有特殊染色后才能被光学显微镜识别.（如用尼氏染色染尼氏小体）★尼氏染色(Nisslstain)将RNA和DNA染成紫色。在神经元细胞质上的尼氏小体被认为是核糖体和糙面内质网。这种染色将尼氏小体染成紫色。★衬染：非特异性背景染色。HE染色（苏木精-伊红染色）染料的染色原理：（1）化学作用：染料的性质有酸、碱、中性之别，那么组织中的碱性部分（如细胞质）易和酸性染料亲和而发生作用，组织中的酸性部分（如染色质）易和碱性染料亲和而发生作用。（2）物理作用：指吸附或溶解作用。组织蛋白和某些染料有相互吸附的作用。

媒染剂、促染剂和分化剂

媒染剂：某些天然染料（如苏木精），本身无着色性，要与其他物质结合后才具有着色性，这些被结合的物质称为媒染剂，如许多铁盐、铬盐及钾盐等。

促染剂：是促进染料着色性的物质，如冰醋酸是伊红的促染剂。

分化剂：能使切片上需要显示的结构清晰，而使不需要显示的结构脱去颜色的物质。如1%盐酸酒精。一、苏木精-伊红染色（H.E染色）

所做出的石蜡包埋切片可应用的染色方法很多，应根据不同的检查目的而选用不同的染色方法。而最为常用的染色法为H.E染色。

1、苏木精(苏木素、苏木紫)（hematoxylin）：为从苏木中提取。苏木精本身不是染料，不能直接染色，必须经氧化才能染色。可以在空气中自然氧化，但需时很长，所以一般都是加氧化剂（如碘酸钠）氧化。同时，被染材料又须经媒染剂作用后才有着色能力，所以在配制苏木精染液时，都加有媒染剂。苏木精液主要着染细胞核。

有数种不同配方的苏木精液。

Mayer(梅耶)氏苏木精液：

苏木素

1g

硫酸铝钾

50g（媒染剂）

碘酸钠

0.2g（促进氧化）

水合氯醛

50g

柠檬酸

1g

蒸馏水

1000ml

2、伊红（曙红）(eosin)：又分几种，如伊红Y、伊红B等。

伊红对细胞质、肌纤维、胶原纤维具有着色性。

一般用0.5%伊红/70%乙醇液或1%伊红水溶液。

由于苏木精着染细胞核，伊红着染细胞质，所以这种方法称为双重对比染色法。

实验材料：石蜡切片、盖玻片、小镊子、大镊子、树胶、滤纸、纱布、染色缸、二甲苯、乙醇系列、Mayer氏苏木精液、0.5%伊红酒精液（或1%伊红水溶液）、1%盐酸酒精、蒸馏水、显微镜。1、

切片脱蜡、复水：

由于要染色的切片尚包在石蜡之中，而所用的染色液都为水溶液，因此在染色之前，必须再度复水。与固定的组织块脱水、透明的步骤相反，石蜡切片先在二甲苯中溶去石蜡，再经过各级酒精，下行至水。

把玻片放入盛有二甲苯的染色缸中以溶去石蜡（20min），再经第二缸二甲苯（10min）。经100%、95%、90%、80%、70%各级酒精入水，每级3-5min。

2、入苏木精液染5-7min。

3、流水洗去附着染液，（在１%盐酸酒精中蘸3-4下），然后流水冲洗20min使切片由淡红色变为灰兰色。

4、入伊红染液5-7min。

5、脱水、透明：

如果组织片中有水分，则光不宜通透，在显微镜下观察不清组织的结构，所以必须经过脱水。透明剂能增强组织的折光系数。这样，才能在显微镜下观察。

在70%、80%、90%的酒精中每级各蘸3—4下，再经95%、100%Ⅰ、100%Ⅱ梯度酒精，每级各5min。在二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中分别透明10min。

6、封片：

从二甲苯中取出载玻片，未等二甲苯挥发，在组织切片上滴加适量树胶，上面再加盖玻片（倾斜放下）封固。五、免疫组织化学（定义），免疫细胞化学---重点免疫组化是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素)显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry)。免疫组织化学的全过程包括：1.抗原的提取与纯化；2.免疫动物或细胞融合，制备特异性抗体以及抗体的纯化；3.将显色剂与抗体结合形成标记抗体；4.标本的制备；5.免疫细胞化学反应以及呈色反应；6.观察结果。★方法分类：1.直接法间接法直接法：将带有标记的抗体直接与抗原反应，显示出抗原存在的部位优点：操作简单缺点：敏感性不高，检测效率低；抗体标记少（难买到）。间接法：在抗体抗原初级反应的基础上，再用带标记的第二抗体同第一抗体反应，从而使初级反应得到放大，显示增强。优点：信号放大，检测敏感性好；二抗是针对种属特异性的，种类少，有标记的二抗方便易得。2.免疫荧光（单、二、三……标记）3.免疫酶法※其他分类方法1、按标记物质的种类，如荧光染料、放射性同位素、酶（主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶）、铁蛋白、胶体金等，可分为免疫荧光法、放射免疫法、酶标法和免疫金银法等。2、按结合方式可分为抗原—抗体结合，如过氧化物酶-抗过氧化物酶（PAP）法和亲和连接，如卵白素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC）法、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法等，其中SP法是最常用的方法。★免疫荧光法免疫荧光技术是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素，制成荧光抗体，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检测组织或细胞内的相应抗原（或抗体）。在组织或细胞内形成的抗原抗体复合物上含有标记的荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受外来激发光的照射而发生明亮的荧光（黄绿色或橘红色），可以看见荧光所在的组织细胞，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。注意：多标的时候，一抗来源要不同，以便区分二抗。如：一抗二抗Rabbit—anti—ProA——FITC—anti—rabbitmouse—anti—ProB——Cy3—anti—mouse颜色的选择：双色：绿、红三色：红、绿、蓝（眼睛不敏感）singleimmunostainingdoubleimmunostaining★免疫酶法※免疫酶细胞化学技术是以酶作为抗原抗体反应的标记物，在既不改变抗原抗体的免疫反应特异性也不影响酶活性的条件下，与相应的酶底物作用，形成一种不溶性的反应产物。在光学显微镜下观察时，要求反应的终末产物是不溶性的有色物质，具有可观察性。在电镜下观察时，则要求底物的终末产物具有较高的电子密度。由于辣根过氧化物酶（HorseRadishPeroxidase,HRP）具有稳定性强和反应特异性高等优点，是目前应用最多的酶标记物。实验方法包括酶标记抗体法、非标记抗体酶法和非标记的过氧化物酶—抗过氧化物酶技术（即PAP法）如：免疫酶标法（ABP）：Avidin-Biotin-Peroxidase，辣根过氧化物酶可催化一个呈色反应，将DAD变成棕色的沉淀。二抗-Biotin+Avidin-Peroxidase→底物DAD→棕色沉淀Avidin-Biotin-Peroxidase※免疫酶方法的优缺点：优点：片子保存时间长不需要荧光显微镜，在普通显微镜下可见级联放大的作用。缺点：操作复杂新的检测手段发展有限。只能用CCD成像，不能用共聚焦显微镜。★免疫细胞化学中的注意事项：组织中的抗原保护(固定)好的抗体抗体特异性染色好，敏感性好,非特异染色少有效的检测手段★一抗选择要素：（一抗二抗的选择）宿主Host（Mo,Rb,Go,GP,Ch）使用范围Application（IB,IH,IP,IC)IB用的抗体对空间结构要求不高，IH,IC用的抗体对空间结构要求高交叉反应Crossreaction（Rt,Mo,Hu,Rb)70%以上同源性就会有反应储存Storage(4℃,-20℃,-70℃好的抗体：高亲和力，高粘性（粘度低，洗的时候易洗去）高滴度（滴度低，背景高）抗体浓度越高，特异性越差，用抗体不是越浓越好（背景会高），要进行梯度稀释，找到合适浓度(如1：100，1：500，1：2000，1：5000)。尽量用低浓度，既可以节约抗体，又可以减少非特异性结合★二抗为种属特异性，有合适的标记荧光素，根据所用一抗选定二抗。一般来说，如果一抗是小鼠源性，二抗应选择兔/山羊或其它种属抗小鼠的抗体，尤其是多标记的时候，以免出现交叉反应。★Controls抗体阳性Control:染已经研究明确的含有该抗体特异性抗原的组织，验证抗体是否好用阴性Controls：不加一抗，加抗体稀释液及二抗，看是否会有非特异性地染色。吸收实验(特异性的阴性control):将过量的抗原和工作浓度抗体一起孵育24小时(等于用抗原使抗体饱和掉),用这个buffer去孵育组织.（理论上此时buffer里面已经没有抗体）看抗体是否是特异性的结合抗原——做新的东西时一定要做。★出现的问题及补救措施:见PPT（老师没细讲，应该不会考）六、荧光染料★核染料★肌动蛋白和微管蛋白染料★凋亡探针★钙指示剂★细胞器探针:高尔基体,内质网,溶酶体,液泡和其他酸性细胞器，线粒体★光敏探针Photoactivatable(caged)probes七、定量分析指标：数量、长度、强度★因为许多生理、病理刺激不是“全或无”的，所以要定量分析变化过程，如果变化窗口比较大，则比较有研究价值。所以可以统计不同大小的细胞数目，突起长度的变化，某些物质在细胞内位置变化的程度等来定量。八、应用★活细胞染色（只能染细胞膜表面上的东西，因为抗体不可能进入活细胞中。对抗体要求高，必须针对膜蛋白上的胞外区域。）★荧光共振能量转移FRET——用成像的方法研究两个分子之间的相互作用原理：荧光共振能量转移----是指在两个不同荧光分子，如果一个荧光分子（供体Donor）的发射光谱与另一个分子（受体Acceptor）的吸收光谱有一定的重叠，当这两个荧光分子间的距离合适时（一般小于10nm），就可观察到荧光能量由供体向受体转移的现象，即以前一种基团的激发波长激发时，可观察到后一个基团发射的荧光。简单地说，就是在供体基团的激发状态下由一对偶极子介导的能量从供体向受体转移的过程，此过程没有光子的参与，所以是非辐射的。--------可用来研究分子间相互作用FluorescenceResonanc