高效液相色谱-串联质谱法测定动物源性食品中硝基呋喃类代

高效液相色谱-串联质谱法测定动物源性食品中硝基呋喃类代谢物残留量郭德华1汪国权2王东辉1李波1王敏1金玉娥2陈笑梅3（1.上海出入境检验检疫局，上海2001352.上海疾病预防控制中心，上海2003363.浙江出入境检验检疫局，杭州310012）摘要依次用甲醇、乙醇和乙醚溶剂提取，使动物源性样品中呋喃唑酮、呋喃西林、呋喃它酮、呋喃妥因等四种硝基呋喃类游离态代谢物进入提取液，而结合态代谢物保留在残渣中。在酸性条件下用2-硝基苯甲醛分别衍生游离态和结合态代谢物。经乙酸乙酯提取浓缩后，用液相色谱-四极杆串联质谱仪定性和同位素内标法定量。在0.3、1.0和5.0μg/kg3个浓度水平上进行添加回收试验，回收率为85.2~112.5%，检出限（LOQ）均为0.3μg/kg，相对标准偏差（RSD）均小于6.3%（n=6）。关键词硝基呋喃类代谢物动物源性食品液相色谱-四极杆串联质谱法硝基呋喃类药物Nitrofurans主要是指:呋喃唑酮（furazolidone）、呋喃它酮（furaltadone）、呋喃西林（nitrofurazone）、呋喃妥因(nitrofurantoin)等引入硝基的人工合成抗菌药，近年来发现其具有慢性毒性，可引起消化道反应，欧盟、美国等发达国家已禁止使用。硝基呋喃类药物在动物体内数小时内降解，但其代谢产物能与蛋白质紧密结合，形成稳定的残留，残留时间达数周之久，甚至在蒸煮、烘烤、磨碎和微波加热过程中也无法有效降解，因此检测硝基呋喃类药物的代谢产物，更能起到监控作用。目前欧盟对硝基呋喃类代谢物的检测方法灵敏度规定为1μg/kg[1]。有关硝基呋喃类代谢物残留检测方法，主要有酶联免疫法[2]、液相色谱-紫外法[3]、液相色谱-质谱法[4]和液相色谱-串联质谱法[5]，由于酶联免疫法只能测定呋喃唑酮和呋喃它酮代谢物，液相色谱-紫外法、液相色谱-质谱法灵敏度较差，液相色谱-串联质谱法已成为此类代谢物检测的主要技术路线。我们采用两种前处理手段，分别提取游离态和结合态硝基呋喃代谢物，并使用相应的同位素作为内标，不仅具有分析不同状态硝基呋喃代谢物的优势，还可提高定量的准确性，满足对进出口动物源性食品中硝基呋喃类代谢物进行官方监控的要求。1实验部分1.1主要仪器与试剂高效液相色谱仪：1100型，美国安捷伦公司；四极杆串联质谱仪：API4000型，美国应用生物系统公司；低温高速离心机、涡旋混合器、往复式恒温水浴摇床、均质器；1.0M盐酸；甲醇、二甲基亚砜：HPLC级；乙酸乙酯：分析纯；50mM2-硝基苯甲醛溶液：称取75.5mg2-硝基苯甲醛并溶解于10ml二甲基亚砜中(现用现配)；0.1M磷酸氢二钾溶液；1.0M氢氧化钠溶液；去离子水；硝基呋喃类代谢物混合标准溶液，分别称取10mg呋喃唑酮代谢物（AOZ）、呋喃它酮代谢物（AMOZ）、呋喃妥因代谢物（AHD）、呋喃西林代谢物（SEM）标准品（德国Witega公司提供），用甲醇配成100g/mL的混合标准液；硝基呋喃类代谢物同位素混合内标溶液，称取用氘、碳-13、氮-15标记的AOZ-D4、AMOZ-D5、AHD-D3、SEM-13C15N2标准品各10mg（德国Witega公司提供），用甲醇配成100g/mL的混合标准液。根据检测需要用甲醇将混合标准液稀释成0.005μg/mL。1.2分析条件1.2.1液相色谱参数流动相：甲醇+1.0mM醋酸铵水溶液（1+1）；色谱柱：美国安捷伦公司ZorbaxXDB-18（150mm×2.1mmi.d.，5m）；流速：0.15ml/min；柱温：室温；进样量：30μL。1.2.2质谱参数离子源：TurboIonSpray电喷雾；离子源喷雾电压：5500V；离子源温度：540℃；雾化气：42L/min；辅助气：45L/min；气帘气：25L/min；碰撞气：5L/min；检测模式：正离子多反应监测方法（MRM），参数条件见表1。表1多反应监测方法（MRM）参数化合物分子离子碎片离子驻留时间(ms)去簇电压（V）入口电压（V）碰撞电压（V）AOZ236.2104.1134.2404066.066.032.018.332.018.3AMOZ335.2291.3262.3404066.066.017.725.017.725.0AHD249.2104.1134.115015066.066.032.018.025.032.0SEM209.2166.2192.215015060.060.015.017.015.017.0AOZ-D4240.2134.24066.018.018.0AMOZ-D5340.3296.44066.018.018.0AHD-D3252.2134.210066.018.018.0SEM-13C15N2212.2168.215060.015.015.01.3实验方法1.3.1系列标准溶液的配制根据1.3.2所需检测样品，称取已知无硝基呋喃类代谢物残留的同类基质样品10.0g，添加0.003、0.005、0.010、0.025、0.050μg/mL等不同浓度硝基呋喃代谢物混合标准溶液和0.005μg/mL的同位素内标1mL，从样品衍生步骤起与样品同步操作。1.3.2样品的前处理游离态硝基呋喃类代谢物的提取和衍生称取水产品或动物内脏等动物源性样品10.0g，加入1mL水，8mL甲醇，2000r/min下匀质30s，在4℃3000rpm离心5min。倾出上清液于浓缩瓶中，将下层残渣加入3mL甲醇，匀质后在4℃3000rpm离心5min，倾出上清液于同一浓缩瓶中，重复3次；依次加入3mL乙醇、3mL乙醚于下层残渣中，匀质后在4℃3000r/min离心5min，倾出上清液，重复2次。合并上述溶液并浓缩近干。加入4mL水，0.5mL1.0M盐酸，150μL2-硝基苯甲醛溶液，再加入1mL0.005μg/mL的同位素内标，37℃下震荡过夜。结合态硝基呋喃类代谢物的提取和衍生在上述残渣中加入1mL0.005μg/mL的同位素内标，加入4mL水，0.5mL1.0M盐酸，150μL2-硝基苯甲醛溶液，37℃下震荡过夜。净化及测定对上述提取衍生的两份溶液分别按照下面步骤进行净化：加入0.1M磷酸氢二钾5mL，1.0M氢氧化钠400μL，调pH至6.3，加入5mL乙酸乙酯，震荡5min后在4℃3000r/min离心5min，将上层乙酸乙酯提取液转移至试管中，用乙酸乙酯重复提取2次，每次5mL,合并乙酸乙酯层提取液，在50℃下用氮气吹干。准确加入1.0mL流动相，过0.22μm滤膜后上机测定。2结果与讨论2.1样品的前处理方法硝基呋喃类代谢物均为小分子化合物，SEM、AOZ、AHD和AMOZ的分子量分别为75.1、102.1、115.1、201.2，质谱碰撞后无法产生特征性离子碎片，给定量特别是定性带来困难。本方法采用2-硝基苯甲醛进行柱前衍生，使上述代谢物的衍生物分子量分别达到208.2、248.2、235.2、334.3，在适当的碰撞电压下均产生不少于两个特征子离子的碎片峰。在动物体内，硝基呋喃类药物以代谢物的形式存在，其中绝大部分以结合态的形式与蛋白结合，本方法预先用甲醇、乙醇和乙醚等有机溶剂提取样品中游离态硝基呋喃类代谢物，将结合态的代谢物保留在样品残渣中，在酸性条件下完成水解步骤，并分别进行衍生、净化和测定步骤，将两者相加即得到样品中硝基呋喃类代谢物残留总量。2.2质谱条件的优化试验了不同参数（喷雾电压、碰撞电压等）对测定结果的影响，结果表明，随着喷雾电压的增大，硝基呋喃类代谢物的衍生物的信号响应值逐渐增大，电压达到5.5kV时达到最大值，随后趋于平缓。经对每种硝基呋喃代谢物衍生物的碰撞能量优化，在15~32V范围内，分子离子峰[M+1]断裂产生特征性碎片离子。3312XICofMRM4.12345678Time,min0.02.0e44.0e46.0e48.0e41.0e51.2e51.4e51.6e51.8e52.0e52.2e52.4e5Intensity,cps7.501SEM及其同位素SEM-13C15N2；2AHD及其同位素AHD-D3；3AMOZ及其同位素AMOZ-D5；4AOZ及其同位素AOZ-D4图10.003μg/mL混合标准工作液的提取离子色谱图2.3标准工作曲线将标准系列溶液添加到不含硝基呋喃代谢物的南美白对虾样品中，按上述实验步骤操作，以浓度Y（μg.mL-1）为横坐标，峰面积X为纵坐标，绘制标准曲线，线性回归方程、相关系数和线性范围见表2，最低检出浓度为0.0003μg.mL-1，样品检出限为0.3μg/kg（信噪比为10）。表2回归方程、相关系数和线性范围统计表待测组分线性回归方程相关系数线性范围/μg.mL-1AOZY=1.36X+0.02620.99970.003~0.050AMOZY=1.74X+0.04240.99850.003~0.050AHDY=1.04X+0.05010.99980.003~0.050SEMY=1.36X+0.07320.99940.003~0.0502.4加标回收和精密度试验以不含有硝基呋喃类代谢物残留的猪肠衣为样品，按照上述方法进行提取、净化和测定，在0.3、1.0和5.0μg/kg三个浓度水平上进行添加回收试验，四种硝基呋喃类代谢物的添加回收率为85.2~112.5%，相对标准偏差（RSD）均小于6.3%。表3肠衣中游离态硝基呋喃类代谢物回收率及相对标准偏差（n=6）待测组分加入量/μg.kg-1平均回收率/%RSD/%待测组分加入量/μg.kg-1平均回收率/%RSD/%AOZ0.395.25.2AHD0.3108.26.21.087.95.91.085.26.35.093.65.65.093.45.2AMOZ0.388.24.6SEM0.396.13.81.093.85.51.0112.54.95.0106.53.75.099.45.42.5方法验证2004年英国中央科学实验室（CSL）组织了猪肾中硝基呋喃类代谢物的FAPAS®第56轮国际协同试验，21个国家和地区42个实验室参加了测试，本课题组采用上述方法分别测定了游离态和结合态代谢物残留量，并以总量的形式上报了检测结果，最终统计报告显示我们的检测结果均为满意的。3结论本方法采用柱前衍生的手段，使四种硝基呋喃代谢物的极性降低，在液相色谱上得到满意的分离效果，也使四种硝基呋喃代谢物的分子量得到增加，在碰撞时产生特异性断裂碎片，帮助分析者进行质谱图谱解析，并提高了检测灵敏度。本方法采用四种硝基呋喃代谢物相应的同位素内标进行定量的模式，提高了方法的回收率和精密度，采用同时监测两个子离子的定性模式可以提高方法的可靠性，为疑似样品的确证提供技术保障。参考文献1Amendingdecision2002/657/ECasregardsthesettingofminimumrequiredperformancelimits(MRPLs)forcertinresiduesinfoodofanimalorigin.OfficialJournaloftheEuropeanUnion,Commissiondecision(2003/181/EC),L71:172EnzymeimmunoassayforthequantitativeanalysisofAOZ.r-BiopharmAG,Damstadt3A.Conneelyetal.Useofsolidphaseextractionfortheisolationandclean-upofaderivatisedfurazolidonemetabolitefromanimaltissues.TheANALYST,2002,127:7054R.J.McCrackenetal.DeterminationoffurazolidoneinanimalfeedsusingHPLCwithUVandthermosprayMSdetection.J.ChromatogrA,1997,771:3495Alexander.L.,Peter.Z.Determinationofthemetabolitesofnitrofuranantibioticsinanimaltissuebyhigh-performanceliquidchromatography-tandemmassspectrometry.JournalofChromatographyA,2001,939:49DETERMINATIONofTHEMETABOLITESofNITROFURANRESUDUESINFOODofANIMALORIGINbyHPLC-TANDEMMASSSPECTROMETRYGUODehua1WANGGuoqian2WANGDonghui1LIBo1WANGMin1JINYUE2CHENXiaomei3（1.ShanghaiEntry-ExitInspectionandQuarantineBureau，Shanghai2001352.ShanghaiCenterforDiseasePreventionandControl,Shanghai，2003363.ZhejiangEntry-ExitInspectionandQuarantineBureau，Hangzhou310012）ABSTRACTHavingextractedbymethanol,ethanolandaetherinturns,“freeresidues”