发酵工艺实验

（21）排料排气阀消毒时，开启此阀，蒸汽形成回路，对取样放料阀（底阀）及取样管路进行消毒，罐内液体由此口排放。底阀对取样放料阀（底阀）和取样管路消毒结束后，关闭此阀，防止由于冷却时，取样管路内压力剧降，出现倒吸（抽真空）现象而产生污染。（二）发酵罐的灭菌操作简介：反应器的消毒灭菌在微生物发酵培养过程中非常重要，前期污染的主要原因就是消毒不彻底，为确保培养过程在无污染的情况下进行，必须严格按实罐消毒灭菌程序进行操作。反应器的消毒灭菌分为实消和冷却两步进行。（一）实消步骤关闭所有阀门。向罐内注入待消毒的料液至一定体积（消后体积控制在10L）打开电源总开关，及“搅拌”开关，并设置一定的搅拌速度（宜在200rpm左右）。将控制机箱面板上的“手动/自动”开关处于关闭状态（即控制器处于检测状态）。开启尾气排气阀G--04和冷凝水阀W--06。开启夹套蒸汽阀S--02、蒸汽虑气排水阀S--05,将蒸汽（约0.3-0.4Mpa）通入夹套，预热罐内液体。当罐内温度达到85~95℃左右时，开启滤器消毒阀S--01、滤气排气阀S--04,关闭冷凝水阀W--06,使蒸汽通入过滤器，并经由滤器排气阀S--04和疏水器排放过滤器中的冷凝水。待过滤器中的冷凝水排尽后，（触摸滤器排气阀S04下端的管子烫手即可），关闭滤器排气阀S--04,然后开启无菌空气阀G--03,使蒸汽通入罐内。当温度高于100℃时，罐内产生鼓泡翻腾，此时应关闭“搅拌”开关停止搅拌。蒸汽经排气冷凝器通过尾气排放阀G--04向外排放。此时应调节尾气排气阀G--04到至略有少量蒸汽排出即可。当罐内温度上升至121c(O.IIMpa),适当开启底阀消毒阀S--03、排料取样阀M--01,使少量蒸汽经过排料取样阀M--01排出，由“活”蒸汽对取样放料管路进行消毒灭菌。待排放适当时间后(约20分钟)，先关闭排料取样阀M--01和底阀消毒阀M--03。通过调节夹套蒸汽阀G--04、尾气排放阀S--02或蒸汽进量，使反应器保温、保压(121℃,0.11Mpa)30分钟，实消工作即告完成。注意：在消毒灭菌过程中切记：(1)相关管道或区域均应有蒸汽的进和出，使蒸汽形成活路，不能留有死角。(2)经常开启滤器排气阀S--04,排放过滤器中的冷凝水，随后即关闭此阀。(3)当罐内温度超过121℃时，应尽量减少蒸汽进量，关闭或关小夹套蒸汽阀S--02,而不应加大排气，以免液体携带而导致液体体积减少。(4)液体体积在实消结束后，会出现增加或减少现象，这是在消毒过程中由于蒸汽的冷凝或携带造成的。(5)在消毒灭菌过程中应尽量避免蒸汽压力剧跌，一旦蒸汽压力低于罐内压力，罐内液体会倒压进入管道和过滤器内。当这种情况出现时，应尽快关闭底阀消毒阀S--03,防止料液倒压入过滤器内。(二)冷却步骤当实消灭菌结束后，应关闭底阀消毒阀S--03、切断蒸汽源，开启“搅拌”开关，待压力降至0.8Mpa左右时充入气体方可冷却，否则易造成罐内压力剧降，出现罐压跌零甚至倒吸现象，由此而带来污染。具体步骤如下：检查空气源并将进入装置的空气压力调节至0.12〜0.14Mpa开启“搅拌开关(200rpm左右)。开启冷凝水阀W06.按下列顺序关闭各阀门：(1)无菌空气阀G03;(2)排料取样阀M01;(3)底阀消毒阀S03；(4)滤器消毒阀S01;(5)夹套蒸汽阀S--02。按下列顺序开启各阀门，将无菌空气通入罐内：1)气体调节阀G01;2)滤器进气阀G02;3)无菌空气阀G--03。注意：待罐内压力降至0.08Mpa左右时，方可开启无菌空气阀G--03,避免罐压高于空气压力造成倒压。调节空气调节阀G--01和尾气排放阀G--04,保持一定的罐压。(0.05Mpa)罐内通入无菌空气后关闭夹套排水阀S—05,开启下列各阀,和机箱面板上的分路控制开关，即可进行快速冷却：(1)水泵出口阀W03;(2)夹套回流阀W05;(3)温控切换阀W08;(4)“冷却”开关;(5)“水泵”开关。注意：在冷却过程中罐压的波动比较大，须密切注意观察，切不可使罐压跌零。1、当罐温降至接近培养工艺所需的设定温度(相差约3~4℃)时，将温度手动控制切换成自动控制，具体步骤为：2、(1)2、(2)将机箱面板上的“手动/自动”开关处于开启状态，此时，控制器处于自动控制状态；温度达到培养工艺所需的设定值时，消毒灭菌全过程完毕；(3)按工艺要求，设置工艺所需各个参数，待接种。注意：冷却过程中空气流量不要过大，搅拌速度可适当降低，并严格控制罐压，以防泡沫携带量过多。实验七木聚糖的发酵生产一、实验目的1.了解木聚糖酶；2.熟悉影响真菌产木聚糖酶的发酵条件；3.掌握发酵实验的基本操作。二、实验原理木聚糖酶，英文名称xylanase,半纤维素酶系中最主要的组成部分。是一类组成比较复杂的的酶，是一种多聚五碳糖，并和纤维素分子存在着氢键连接和物理混合。狭义上的木聚糖酶指的是内切书-1,4-木聚糖酶，广义上木聚糖酶的主要功能是降解木聚糖分子，主要包括①内切-P-1,4-木聚糖酶(endo-B-1，4-D-xylanase,EC3.2.1.8)②a-D-葡萄糖醛酸苷酶(a-D-glucuronidases，EC3.2.239)③B-D-木糖苷酶(-xylanxylohydrolase,EC3.2.1.37)④a-L-呋喃型阿拉伯糖苷酶(a-L-arabinofuranosidases)⑤酚酸酯酶。其中主要降解木聚糖分子的是内切-B-1,4-木聚糖酶，此酶主要是通过内切木聚糖主链的B-1,4-木糖苷键,降解木聚糖主链骨架[27,]使木聚糖分子降解成低木聚糖分子,并生成少量的木糖。低木聚糖分子则在B-D-木糖苷酶的催化下，末端释放出木糖残基。木聚糖酶的来源广泛,而且由于其组成不同,结构也很复杂。根据组成木聚糖酶的分子量不同,可以将木聚糖酶划分为高分子量木聚糖酶和低分子量木聚糖酶。高分子量木聚糖酶一般含有269~809个氨基酸残基,而低分子量木聚糖酶氨基酸氨基大约在182~234个。也可将木聚糖酶按照是否具有底物特异性将其分为特异性木聚糖酶和非特异性木聚糖酶。实验器材1．菌种：纯绿青霉.基础产酶培养基：麦麸3g，酵母粉0.2g，硫酸镁0.01g，氯化钠0.05g，磷酸二氢钾0.05g，定容到1000ml。121℃灭菌30min。.其它：电子天平；250ml三角瓶；电炉；灭菌锅；培养皿(5个)；试管；无菌操作台；酒精灯；接种环；涂布棒；报纸；细绳；棉塞；牛皮纸；玻璃棒。实验步骤1、按上述培养基配方配制100毫升培养基，装入一只250毫升三角瓶中，加热使药品溶解后（保持低温加热），用棉塞塞住瓶口，并用牛皮纸扎紧，以备灭菌。2、用一个100毫升的三角瓶装入蒸馏水，用棉塞塞住瓶口，并用牛皮纸扎紧，以备灭菌。3、把物品放入灭菌锅中在121℃时灭菌20分钟，灭菌后放入已杀菌的无菌操作台中。4、待培养基和无菌水冷却至适宜温度时，在无菌条件下，将两支斜面的孢子用无菌水制成悬浮液，用无菌吸管吸1ml接入摇瓶的培养基中。5、将摇瓶放置在29℃、160r/min的摇床上培养22—24小时。在无菌条件下，菌株接种到基础产酶培养基的三角瓶中，放置8,转速恒温培养摇床上振荡培养。实验八木聚糖酶活力测定方法木聚糖酶能够将木聚糖水解成木糖的还原糖类，这些还原糖能够与DNS试剂发生显色反应，根据这个原理可用来测定木聚糖酶的活性。本实验利用木聚糖（生化试剂）为底物，加入一定量的粗酶液反应一段时间后加入DNS,沸水浴5min钟后，利用721可见光分光光度计测反应后的OD值。本实验中，酶活越高，水解木聚糖生成的还原糖越多，其OD值也会跟着增加，通过定义酶活含义，可以测定出酶活，判断酶活的高低。1．木聚糖的制备称取50g麦麸放入烧杯中，按1：10的料液比加入蒸馏水和一定量NaOH，维持pH在10左右，加热煮沸30min，冷却后在4000r/min转速下离心15min，取离心后的上层液体，按1：2的体积比加入乙醇溶液，沉淀30min，再在4000r/min转速下离心10min，将得到的沉淀洗涤至中性，烘干，得到的即为木聚糖。2．测定酶活使用试剂的配制（1）DNS的配制称取酒石酸钾钠182.09g，溶于500mL蒸馏水中，加热，于热溶液中加入3,5一二硝基水杨酸6.39g，NaOH21.09g，待溶液冷却至50℃以下，依次加入苯酚5.09g，无水亚硫酸钠5.09g，搅拌至溶解完全，冷却后用蒸馏水定容至1000mL，贮存预棕色瓶中，室温保存，放置一星期后即可使用。（）1%的木聚糖底物溶液（pH4.8）溶液A：0.2mol/L醋酸（准确量取11.55ml冰乙酸溶于1000ml蒸馏水）。溶液B：0.2mol/L乙酸钠（称取16.4g无水乙酸钠溶液1000ml蒸馏水中）。pH4.8醋酸缓冲液的配制：溶液A和溶液B混合比例为2:3,并稀释一倍。1%的木聚糖底物溶液（pH4.8）配制：按1%的含量称取一定量的木聚糖溶于配置好的缓冲液中。1g/L木糖溶液配置：称取0.25g的木糖用pH4.8醋酸-醋酸钠缓冲液溶解定容至250mL。3．标准曲线的绘制取11支试管按顺序加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0mL的1g/L的木糖溶液，补水至2ml，再各加入3.0mL的DNS试剂，摇匀后在沸水浴中保温显色5min后，待冷却后，加入蒸馏水定溶至15mL,摇匀，自制木聚糖在处测其OD值，标准曲线见表3.2。表3.2520nm下的OD值木糖含量（g/L）00.20.40.60.81.01.2OD值-0.0220.1430.3590.5930.7110.8921.1724．酶活的测定（1）粗酶液的制备取发酵液过滤，得到的上清液即为粗酶液。（2）酶活的测定取0.1ml粗酶液加入pH4.8的醋酸缓冲液配制的1%的木聚糖溶液1.9ml,放入水浴锅中50℃水浴酶解30min，立即取出加入3mlDNS溶液，至沸水裕中反应5min，冷却后加入10ml水定容至15ml,混匀后，于520nm处测其吸光度，对照组为取0.1ml粗酶煮沸15min灭活，其他条件不变。（3）酶活力定义酶活定义：1mL粗酶液在pH4.8、50℃下每分钟分解木聚糖