《植物生理学实验》

《植物生理学实验》植物叶绿体色素的提取及理化性质的鉴定一、实验目的1.掌握叶绿体色素的有机试剂提取与纸层析分离方法。2.了解植物叶绿素的重要理化性质及其在光合作用中的重要作用。

二、实验原理1、植物叶绿素的主要种类高等植物：Chl.a、b褐藻、硅藻：Chl.a、c1、c2红藻：Chl.d植物叶绿体色素叶绿素叶绿素a：蓝绿色类胡萝卜素胡萝卜素：橙黄色叶绿素b：黄绿色叶黄素：鲜黄色收集传递转换光能收集传递光能，保护叶绿素2、叶绿素的理化性质卟啉环头：4个吡咯环，4个=CH-，1个Mg2+;

亲水性。IIIIIIVＩVChl.aC55H72O5N4MgChl.bC55H70O6N4Mg叶绿醇尾：4个异戊二烯单位组成的双萜;

亲脂性。脂溶性：

难溶于水,溶于酒精、丙酮、石油醚等有机溶剂。皂化反应:

叶绿素是双羧酸的酯，一个羧基被甲基酯化，另一个羧基被叶醇基酯化而发生皂化反应。取代反应：

在弱酸情况下，卟啉环中的Mg2+可被H+、Cu2+、Zn2+取代。光学特性：吸收光谱叶绿素有2个吸收高峰：

红光区640～660nm(叶绿素特有）蓝紫光区430～450nm（卟啉环共有）荧光与磷光现象：透射光反射光荧光与磷光产生的原理3、类胡萝卜素的理化性质分子结构式：胡萝卜素：C40H56，是不饱和碳氢化合物，有α、β、γ三种同分异构体。叶黄素：C40H56O2，是胡萝卜素衍生的醇类，其两端的紫罗兰酮环第4位C上的H被OH取代。脂溶性：不溶于水，溶于有机溶剂。光学特性：

最大吸收蓝紫光，不吸收红光。植物叶绿体色素的主要性质种类颜色溶解性质作用最大吸收光谱荧光现象磷光现象叶绿素Chla蓝绿色不溶于水，溶于有机溶剂如酒精、丙酮、石油醚等收集、传递、转换光能640-660nm（红光）、430-450nm（蓝紫光）透射光：绿色反射光：红色寿命短（10-9s）暗红色光；寿命较长10-2sChlb黄绿色类胡萝卜素胡萝卜素橙黄色不溶于水，溶于有机溶剂收集传递光能、保护叶绿素分子蓝紫光有叶黄素鲜黄色三、实验试剂与材料试剂：

石油醚（沸程60～90℃）、丙酮、甲醇、氢氧化钾、石英砂、碳酸镁、氯化钠、醋酸铜、盐酸或醋酸等。仪器和器皿：

电子天平、剪刀、研钵、移液管、漏斗、分液漏斗、量筒、试管等。材料：新鲜菠菜叶片等。四、实验操作流程图

丙酮研磨提取叶绿体色素↓过滤、洗研钵漏斗↓↓↓丙酮提取液2~3ml荧光余下的用石油醚萃取↓↓↓↓↓逐滴加酸

纸层析荧光皂化反应光破坏（脱镁）↓↓分离色素

Cu取代↓扫描光谱1、色素提取步骤叶片10g+丙酮20ml（分次）迅速充分研磨成浆、过滤（小块脱脂棉）加少许石英砂、少许碳酸镁滤液丙酮10ml洗研钵、漏斗留2-3ml纸层析取代反应40ml石油醚萃取加50ml蒸馏水轻摇、静置、分层清晰（若乳化，加少许NaCl)观察荧光弃下层（丙酮+水层）加50ml蒸馏水弃水层加50ml蒸馏水弃水层石油醚色素提取液（暗处保存）荧光、皂化反应、光破坏色素纸层析分离（可按自己的方案做）：层析纸（滤纸）一端剪成长1.5cm、宽0.5cm，在距底端2cm处用铅笔轻轻划一横线（如右图）。用毛细管吸取丙酮色素提取液在横线处画滤液细线（一定要细且直），如色素颜色不浓，可等干后再画1-2次。色素浓度高，效果好。2、理化性质观察1.5cm0.5cm取一个小量筒，加层析液3-5ml（石油醚：丙酮=9:1），在上过样的滤纸条上端穿一小孔，然后用毛细管或回形针穿过小孔，吊着滤纸条放入量筒，尖末端（约0.3cm）浸入层析液中（注意：一定不可将滤液细线浸入，滤纸不要碰到管壁），再用培养皿盖住。可观察到层析液沿滤纸条上升，离上端1-2cm或色素条带分离清晰时取下滤纸条、风干，观察4条色素条带颜色，从上到下依次为胡萝卜素、叶黄素、叶绿素a、叶绿素b。分别剪下叶绿素a、b条带，并用1ml丙酮溶解，以丙酮做对照，在400-700nm间，每隔2nm进行光谱扫描。光破坏：

取少量石油醚色素提取液(若浓度高，则要稀释)分装于2支试管，一支放暗处，另一支置强光或阳光下照射，2-3h后观察颜色变化。荧光现象：

取4ml色素提取液于试管中，从透射光、反射光方向观察溶液颜色。皂化反应：

取2ml石油醚色素提取液于试管中，沿壁加入1ml新配制的30%KOH－甲醇溶液，立即用力摇动，静置观察10min，观察反应现象。取代反应：

取2ml丙酮色素提取液于试管中，逐滴加入稀酸溶液，摇动，观察溶液颜色变化。当变褐色后，加少许醋酸铜晶体，再观察颜色变化。五、注意事项实验中注意安全，石油醚、丙酮等试剂要远