mRNA作为基因治疗

mRNA作为基因治疗：怎样控制蛋白质表达鞠俊0942043010鞠俊0942043010生物技术基地班关键词：mRNA转运，脂质体，细胞核障碍，多聚腺嘌吟尾，mRNA疫苗摘要：很多年来，在人们看来，在有效的基因治疗中，mRNA是不稳定的。但在过去十年，几个研究团队面对挑战，不仅用令人惊奇的结果，即蛋白质的连续的高效表达证明了mRNA调节转染的可行性，而且证明比起质粒DNA有一些优势。这些优势将在这篇综述中被提到。在所有优势中，首先被强调的是，mRNA不需要穿过核膜去发挥它的生理作用；而且由于缺少了CpG岛的修饰，所以减少了细胞免疫反应。另外，这篇综述还提到mRNA分子的稳定性，mRNA的修饰以增加它的半衰期以及外源mRNA被成功用作转染的必要性。而且，这篇综述总结了用作mRNA转染的不同的技术和载体，主要有电打孔,基因枪注射和脂质体转染。并且暗示，现在大多数的注意力集中在疫苗开发方面。总之，这篇综述提供了一个广阔的视角，关于mRNA转染的主要的理论知识和实际操作以及它在科学研究中的可能性和缺陷简介:人们对mRNA代替质粒DNA在基因治疗中的兴趣，最近才有所增强。很长一段时间，mRNA被认为是一种不稳定的分子。在过去的二十年，mRNA转染的研究一直进行着。研究组大部分运用非病毒的方式来完成转染，也有一些使用病毒载体的。所有这些工作证明mRNA的不稳定性被过分估计了。mRNA转染是一种可以取代质粒DNA的治疗方法。mRNA进入细胞后，它的生命是有限的；由这个mRNA编码的蛋白质只是持续几天的时间。显然，这限制了mRNA转染的实用性。它不能被应用于遗传疾病的治疗，因为治疗需要持续的表达。然而，当只需要短暂的蛋白表达量时，以mRNA为基础的基因治疗能够比质粒DNA的使用更有效。这种情况下，mRNA的转染不仅能完成所有的治疗要求，而且有超过质粒DNA的几个优势。这里，我们将比较mRNA和质粒DNA，强调在非病毒途径中，外源mRNA转染有效性的保证以及讨论它的可能应用。2.mRNA作为质粒DNA的替代这里我们将讨论比起质粒DNA，mRNA转染的优势。首先mRNA比质粒DNA安全，不像质粒DNA，mRNA不能整合到基因组上。因此排除了插入突变。另一个额外的优势是mRNA能作为相对简单的治疗小分子。在转染结构中，没有必要去选择和插入强的启动子和终止子。核膜对质粒DNA是一个障碍，而mRNA不用进入核内发挥作用。而且，mRNA缺少能引起免疫反应的CpG岛修饰。{)31()197(1sl9S{)'s1990'sFig.1.NumberofpublicationsonmRNAdelivery{)31()197(1sl9S{)'s1990'sFig.1.NumberofpublicationsonmRNAdeliveryincellsbynon-viralmeans.■EectroporationaGencgun■Lipnplex巧 ■Ikdypkx毋 ■Other2.1核膜的障碍对质粒DNA,与mRNA无关多种细胞内和细胞外的障碍对非病毒的转染造成了严重的限制。脂质体和聚合物提高了质粒DNA的吸收和核内体的逃逸，于是核膜成为非病毒转染的主要障碍。几个研究小组证明质粒DNA注入非分裂细胞的细胞质中，结果基因的表达很低。相反，将相同质粒DNA的拷贝注入到细胞核中，结果是注射细胞全部被转染。质粒DNA进入细胞核可能是在细胞分裂时期，因为核膜暂时消失了。事实上，分裂的细胞比起静止细胞，更利于转染。尽管如此，在分裂的细胞中，进入细胞核的拷贝还是很低。不超过10%的细胞质的质粒进入了细胞核。而且核膜暂时的缺失不能被用作一般的基因治疗中,因为在大多数情况下，靶细胞不分裂。一种使质粒DNA进入非分裂细胞核的可能通道是核孔复合物。核孔复合物是由50-100种蛋白组成的，位于核膜上的孔。小于9纳米的分子能自由通过，更大的分子则需要能量和特异的受体。不同的方法已经被使用，以提高质粒DNA进入核孔的效率，例如核定位信号。核定位信号能共价连接到质粒DNA上,而且需要小心连接到质粒DNA的功能区域。已经证明，核定位信号共价连接到线性DNA上增加荧光素酶的表达达到150倍。但没有报告显示核定位信号特异的序列效应。但是,也有报告称核定位信号对转染效率不起作用。这种增强作用只针对线性DNA而不是质粒DNA。核定位信号的有限的成功只是在体外，很难在体内实现。在虾和斑马鱼胚胎中，与NLS相连的质粒DNA复合物的核吸收和基因表达增强了。但NLS提高质粒DNA在成年动物中的转染效率还没有充分的证据。综上，所有这些报告表明，通过NPC的质粒DNA的运输不是很有效，这严重降低了基因转运的效率，特别是在非分裂的细胞中。而克服核膜障碍的最有效的途径是发展出一套细胞质表达系统。mRNA能完美的完成整个过程。它不用进入细胞核，从而避免了转染的限制因素。mRNA能被运用于人体各种细胞的转染，包括血管内皮细胞，肌细胞，脑细胞。2.2非甲基化CpG修饰的免疫反应在进化的过程中，我们的免疫系统已经学会了识别和消除外来DNA。未甲基化的CpG岛修饰和一些病毒RNA是引起免疫应答的基本信号。已经证明细菌DNA诱导B细胞，单核白细胞，树突细胞和巨噬细胞的激活，也刺激天然杀伤细胞的裂解活性，导致急性炎症。而且，CpG岛修饰和其它的因子，可能在自身免疫疾病中发挥作用。包含CpG岛修饰的质粒DNA的转染的成功率是有限的。转染阳离子载体和非甲基化DNA到肺细胞，观察到炎症反应；当阳离子载体与包含甲基化或者包含减少CpG修饰数量的DNA复合时，细胞因子的浓度很低。这些实验都表明在转染中，甲基化和减少CpG修饰的数量是有必要的。质粒的甲基化通过CpG甲基化酶的作用实现。尽管甲基化的DNA带来了好的效果，但它不能解决与质粒有关的所有问题。例如，甲基化的质粒和未甲基化的质粒一样，都会引起血液中淋巴球和血小板数量的减少。而且甲基化抑制了很多启动子的活性，妨碍了基因的表达。一种可替代的方法是在质粒中插入一段序列，比如GGAGGG，可以抵消CpG岛修饰引起的炎症反应。另一个方法是通过生化方法去除CpG。大多数氨基酸由多个密码子编码，这使得CpG的消除变得简单。不幸的是，在启动子区和复制区的CpG序列的消除会严重影响基因的功能。而且，双链DNA激活了中性粒细胞和B细胞，这是不依靠CpG的方式。mRNA缺少CpG序列，所以表现出减少的免疫效应。基于上面所述的，mRNA作为基因转染显得更加诱人。3．mRNA的稳定性因为mRNA的结构和生物合成已被阐明，普遍认为mRNA是很不稳定的分子，特别是到达细胞质中，这里，它暴露在降解酶中。它的不稳定的原因是糖配基的第二个碳原子上的羟基的存在。由于空间位阻，使得mRNA不能采用稳定的双链螺旋结构，而趋向于降解。最初人们怀疑，mRNA不稳定，所以不能够抵抗转染。尽管如此，它的一些特点提供了可接受的半衰期。影响mRNA的降解的因子，包括顺式作用元件和反式作用因子。这里，我们只讨论顺式作用。mRNA的5端有一个转录后的m7GpppN的帽子结构。这个修饰在mRNA剪辑，稳定和转运方面发挥作用。最重要的是，它促进了翻译过程中核糖体的招募。真核起始因子，是全酶复合物的结构分子，而RNA解旋酶eif4和eif3.是直接与核糖体40S亚基相连的复合物。帽子结构促进核糖体的募集，这个观念受到了考验，因为一些病毒和细胞mRNA能在丢失5端帽子结构的情况下募集核糖体。尽管如此，帽子结构对正常mRNA功能还是很重要的。Fig.2.Influenceofpresenceofanti-reversecapanalogue(ARCA)onmRNAtransfetliorLThecomplexesweremadebymixing2LigofmLucwithLipofectamineandwerepreparedinamediumcontaining】D移ofserum[CM牝rum)orOptiMemAndincubatedwithHeLacellsfor4IILuciferaseactivitywasassayedatdifferenttimepointsIf(lieenzymeactivitywasdetectablefbi'morethan2dayshthecellculturesweresplit】：2every2days.HalfofthemwasanalysedforLuciferaseexpressionandtheotherhalfwa£furthercultured.mRNAconstructsusedinthissetofexperimentscontainedeitheraregularcapanalogue〔mCAP)anARCAanalogue^tiARCA).InadditionHeLacellswereelectroporatedwithnakedmRNA(mARCA-LucormCAP-Luc).Thegraphsrepresentmeans±SD;n^6.首先，mRNA帽子与相关的蛋白异质二聚体相连。这个蛋白复合物调节mRNA从细胞质到细胞核的转运，通过无义调节的RNA降解，在mRNA分子的质量控制中起关键作用。mRNA的降解在细胞质的P位点发生。到现在，超过40种P蛋白被鉴定。包括Xrn核酸外切酶，去腺苷酸化酶。这个帽子结构保护mRNA免受细胞质中的Xrn1和细胞核中的Xrn2降解，因为它的5-5磷酸酯键的连接。这个帽子结构是mRNA分子的必须组分,特别是当想引入一个外源的mRNA时。mRNA在体外合成时，帽结构能够通过3'或5'的侧面，连接到mRNA的5'端。然而只有5'-5'的磷酸酯键连接才产生可翻译的mRNA。体外合成的mRNA只有一半能发挥功能。这个问题能通过抗倒转帽类似物的使用被解决。它能在3-OH处甲基化以修饰帽结构，使得ARCA在正确的方向被插入，于是得到了全部可翻译的mRNA。最近，通过延长5'-5'桥到一个四磷酸盐，又一次增强了翻译活性和ARCA的稳定性。用常规的帽结构和mARCA转染海拉细胞，比较荧光素酶的表达量。脂质体被用于导入mRNA。脂质体一样时，两者的翻译效率差不多。在相同的时间，酶的活性是没有区别的。当脂质体转入包含血清的培养基时，ARCA在mRNA中的存在才显露出优势。这时，荧光素酶活性能在5天被检测到。这些人观察到含有ARCA帽结构的mRNA比起普通的mRNA有更高的翻译效率。用海拉细胞孵育，有血清的情况下。有趣的是，用裸露的含有类似物帽子结构的mRNA转染电穿孔的海拉细胞，荧光素酶的活性在24小时内消失。而用含有ARCA帽子结构的mRNA转染，能够延长标记蛋白质的表达。所有数据说明，含有ARCA的帽结构mRNA能够延长表达，如果mRNA复合物在有血清的状态下孵育或者是直接达到细胞质中。转录后的mRNA的3'端在酶的催化下，增加一个聚腺苷酸的尾。这个聚腺苷酸尾是很关键的。已经表明所有有活性的mRNA都带有100-250个聚腺苷酸尾。为了达到翻译效率，外源mRNA必须有至少20个聚腺苷酸的尾。而且显示蛋白表达量与腺苷酸尾的长度相关。几个研究小组报道，mRNA包含一个细胞质聚腺苷酸元件，它能起始细胞质中的聚腺苷酸尾的延长。这样，抑制状态的mRNA能被激活。直到现在，这个过程只是在细胞早期发育中被观察到。帽结构和polyA在翻译中的协同作用已被证明。通过形成cap-elF4E-elF4G-PABP-poly(A)的封闭结构表现协同作用,促进了核糖体的循环和保护mRNA免受核酸外切酶的降解。另外也有报道，eIF4G-PABP相互作用的打乱，形成了协同效应。这个是在细胞中观察到，而不是非细胞体系，说明细胞中竞争性mRNA的存在能增强帽结构和polyA的结合。实验证明，含有polyA的转染使得翻译效率增加了2-9倍。大多数的真核mRNA在3'端含有mRNA的衰减信号，即很多富含A-U序列的存在。它在不同范围内影响了mRNA的稳定性。已经证明包含UTR的mRNA是不稳定的。而且当用稳定mRNA的UTR替换ARE时，它们的半衰期延长。ARE造成mRNA不稳定的机制还没有被理解。特殊的AU序列用自己的方式使得mRNA不稳定，一方面依靠mRNA自身，一方面与细胞类型和生长环境有关。当和其它特别的mRNA序列或者ARE连接蛋白相互作用时，ARE引起的不稳定能够增加或者减少，。有趣的是，ARE结构上不稳定，或许是作为调节元件。另一种3'非翻译区的形式是铁离子响应元件。它存在于mRNA编码蛋白中，影响铁平衡。它通过与铁调节蛋白相连，对细胞内铁离子浓度作出应答。铁应答元件的效应依靠精确的定位。当在3'UTR区出现时，它们调节mRNA的半衰期；而当处于5'UTR时，将影响翻译。几个其它的不稳定的3'非翻译元件和5'非翻译元件也已被发现。总之，当用外源mRNA转染时，mRNA分子应该至少带上一个帽子结构和polyA尾，尾部至少包含20个腺苷酸，以保证有可接受的半衰期。而且，通过用稳定mRNA的非编码序列替代不稳定mRNA的非编码序列，mRNA的结构能够被优化。另外，编码的mRNA区域也能加速mRNA的衰退。为了解决这个问题，可以用编码同一个氨基酸的不同密码子替换。4mRNA转运的不同技术裸露mRNA的自发的吸收过程的效率是很低的。原则上，两种核苷酸的转运方式是不同的，一种是病毒转运系统，另一种是非病毒的。依靠质粒DNA的转运被广泛研究，而mRNA被RNA病毒装载的报道也存在。然而，病毒转染的基因表达是很难控制的，因为病毒载体可能整合到宿主的基因组上。另外，临床级别的病毒载体的构建是很昂贵和耗时间的。因此，这篇文章我们将集中于非病毒转运方式，主要分为两个亚群，一类是生理上打乱膜的阻碍作用，提供给mRNA一个通道，另一类是采用阳离子载体，比如脂质体，通过内吞被细胞吸收，从而促进mRNA的引入。Fig.3.Non-viralde-^verymethodsofmRNA,4.1电穿孔和基因枪转运电穿孔是一种基因转运方式，现已发展为一种体外转染技术。在核苷酸溶液的存在下，外电场被运用到细胞中，导致细胞膜的电导率和通透性增加。当膜上的电压变得比电介质强度高时，形成了供核苷酸通过的跨膜的通道。外加电场的强度和连续性应该慎重选择，这样在外源物质被细胞吸收后，孔道能再次关闭。否则，细胞会严重伤害，甚至死亡。米尔第一次运用了电穿孔转运药物到几种类型的肿瘤细胞中。此后，它被用于转运质粒DNA到几种组织中。mRNA的电穿孔比起质粒DNA的电穿孔有几点优势。首先，它害处较小，因为要求较弱的电流，因为mRNA只需要穿过细胞膜发挥作用，而质粒DNA要穿过质膜和核膜。而且相比质粒DNA，它产生了更大量的转染细胞。mRNA的电穿孔在树突细胞中的研究很多，因为它可能被应用于生产疫苗。用带有编码不同的肿瘤相关抗原的mRNA转染树突细胞，结果是有效的，转染的成功率达到50%。用电穿孔的方式转运mRNA到树突细胞，是一种安全和相对简单的方式。除了树突细胞，其他类型的细胞也成功运用电穿孔转运了mRNA，也获得了不同的转染效率。在新鲜的骨髓细胞中，用电穿孔转运带有编码GFP的mRNA，获得了25-30%的转染率.4.2基因枪另一种通过打破已存在的障碍来转运遗传物质的方法是基因枪。这种转染方式原为植物转化设计。使用包有核苷酸的高速的金属颗粒，它们到达细胞内的水环境时，释放出核苷酸。这项技术已经被改进了，手提装置促进了它的普及。转染效率和细胞生存能力也已被提高。在大多数人类组织的适用性也已被证明。科学家使用基因枪去转运外源mDNA到外周血单核细胞，发现mRNA的半衰期在9到80分钟之间，这在于去稳定因子是否存在。当编码蛋白的mRNA转运到小鼠中，观察到严重的抗原反应，表明这种技术作为疫苗开发是可能的。用这种技术来转运编码表皮生长因子的mRNA，伤口愈伤的能力增加。另外，它们引入编码GFP的mRNA，在一周后就观察到表达，而用质粒DNA类似物转运则需要30天。4.3脂质体核苷酸与阳离子脂质体的复合物通过电荷和电荷的相互作用形成。这个复合物是带正电的，促进了与带负电的质膜的相互作用。它能通过内吞作用被细胞所吸收。正电荷复合物的缺陷是与带负电的血清蛋白相互作用时，生成的沉淀能被有效的清除。用PEG保护这个阳离子复合物，使得这个障碍被部分的克服。阳离子载体对浓缩核苷酸到小颗粒起作用，而且保护它们免受降解。阳离子脂质体和聚合物的用于复合和转运mRNA的潜能被广泛测试。第一次用脂质体转运mRNA是由米尔进行。他们通过脂质体浓缩mRNA来转运含有编码荧光素酶的mRNA到不同的细胞中。观察到荧光素的活性和引入mRNA的量是成相关性的。综合全部的实验，用阳离子脂质体转运mRNA的产出比起阳离子聚合物要高。不同的细胞，以及不同的阳离子载体，已经在质粒DNA的转运中被测试。他们测试了支链聚乙烯，聚赖氨酸以及聚合物，都显示出非常低的mRNA转运效率。然而，更短的聚合物被运用时，mRNA的静电作用被减弱，形成了更好的表达。脂质体是一种被广泛研究的载体，已证明具有超强的转染效率。为了优化mRNA的脂质体转染，几种方法被测试。用混合了磷灰石的脂质体转染，比起脂质体，表现出5-15倍的高表达量。后来他又证明更高转染效率的主要原因是增加了细胞对磷灰石的吸收。据我们所知，大约90%的转染细胞表达了蛋白。而且脂质体中的mRNA释放很慢，导致了延长的蛋白表达，一般持续8-9天。我们使用编码相同标记蛋白的mRNA和质粒DNA，并与脂质体相混合。证明mRNA转染的一组，蛋白质的表达快，但持续时间短，也有更多的细胞被转染。质粒DNA的组，蛋白表达高，但开始很晚，转染的效率受到包括载体，细胞类型，mRNA和蛋白质的稳定性的影响。5．mRNA作为一种药物分子鉴于以上提到的特征，mRNA作为一种治疗药物是很有前景的°mRNA转染能被用于大量的病理性紊乱，它只是要求短暂的蛋白表达。于是大多数目光聚集在mRNA在疫苗开发方面的潜力。5.1mRNA疫苗树突细胞是通过表面相容复合物蛋白1和2呈递抗原的最有效的细胞，因此能诱发细胞内和人体的免疫应答。传统的疫苗是用特定的多肽和蛋白激活树突细胞。尽管这种方式已经证明了它的合适性，但它的主要的缺点是白血球应答的数量有限。但用装载有蛋白质，DNA和mRNA的树突细胞去诱导对许多抗原决定簇的免疫应答。这个方法避免了不同病人中的HLA的特异性。然而，很多显微可见的肿瘤，限制了装载有蛋白质提取物的树突细胞的适用性。而且，整个的蛋白质提取物包含了不相关的抗原，能够引起自身免疫应答。因此，核苷酸疫苗成为理想的替代。而且，考虑到传染性疾病的疫苗，遗传疫苗消除了不活跃抗原的突变和非可控的增殖。不同的实验组已经表明mRNA在诱导CD8和CD4的T细胞应答方面和蛋白质是一样的。核酸疫苗相对容易制备。尽管在体内DNA能够被吸收而且表达，但比起mRNA有一些缺点。第一点是整合到基因组上，第二点是DNA的持续的表达。已经证明mRNA引起的短暂的抗原表达，作为优化的疫苗是必须的。一些研究集中在编码抗原的单个的mRNA的序列，也有使用全部的细胞mRNA。mRNA是否应该被引入到DC细胞还存在争议。普遍认为，多肽应该被应用到成熟的DC细胞。在非成熟的DC细胞中，已经表现出增强的细胞毒素T细胞的应答，而在成熟的细胞中正好相反。mRNA的引入会诱导部分细胞的成熟。而且，给药时，转染的树突细胞与血管或组织的接触会诱导其成熟过程。不同的注射部位已证明给药的方式是很重要的。只有在非成熟的DC细胞中才表现出强的细胞毒素T细胞应答。有趣的是，mRNA不仅作为一种编码抗原的分子，而且增强了免疫应答和抗原呈递omRNA能被TLRs识别，起始先天的免疫应答，能够与单链RNA反应的TLR主要是TLR7和TLR8.TLR3识别双链RNA。因此mRNA表达抗原为打击病毒和肿瘤开辟了新的思路。5.2抗肿瘤的免疫大多实验组使用mRNA疫苗测试它在不同的肿瘤免疫治疗中的应用。先例是向小鼠中注射编码癌胚抗原的mRNAo其他实验小组做了卵清蛋白，人类端粒酶催化亚基，AFP（—种在肝癌细胞中表达的蛋白），切去顶端的TERT（一种在癌细胞中普遍表达的抗原），RHAMM（调节透明质酸运动性的受体