植物组织培养实验报告

植物组织培养\实验报告学院:班级:10姓名:李胜程植物组织培养实验报告植物组织培养实验报告第第PAGE9页/9页学号:2010193023植物组织培养实验报告一、实验目的•掌握无菌操作的植物组织培养方法；•通过配置MS培养基母液，掌握母液的配置和保存方法；5.了解植物细胞通过分裂、增殖、分化、发育，最终长成完整再生植株的过程，加深对植物细胞的全能性的理解。二、实验原理（一）植物组织培养植物组织培养是把植物的器官，组织以至单个细胞，应用无菌操作使其在人工条件下，能够继续生长，甚至分化发育成一完整植株的过程。植物的组织在培养条件下，原来已经分化停止生长的细胞，又能重新分裂，形成没有组织结构的细胞团，即愈伤组织。这一过程称为“脱分化作用”，已经“脱分化”的愈伤组织，在一定条件下，又能重新分化形成输导系统以及根和芽等组织和器官，这一过程称“再分化作用”。（二）植物细胞的全能性植物细胞的全能性即是每个植物的本细胞或性细胞都具有该植物的全套遗传基因，在一定培养条件下每个细胞都可发育成一个与母体一样的植株。（三）组织的分化与器官建成（四）培养基的组成培养基中各成分的比例及浓度与细胞或组织的生长或分化所需要的最佳条件相近，似成功地使用该培养基进行组织培养的主要条件。营养培养基一般由无机营养、碳源和能源、维生素、植物激素（生长调节剂）和包括有机氮、酸和复杂物质的添加剂组成。三、实验器材高压灭菌锅、超净工作台、烘箱、培养室 镊子、记号笔、橡皮筋、玻璃器皿、三角烧瓶、烧杯、量筒、剪刀、棉塞、绳子、牛皮纸、酒精灯、喷雾器等。四、实验材料豌豆种子五、实验药品药品、70%酒精、0.1%升汞、MS培养基、蒸馏水、NaOH84消毒液、蔗糖、琼脂等。六、实验步骤（一）培养基母液的配制2MgSC?7HOFeSO?4HONa-EDTAMn37027.82MgSC?7HOFeSO?4HONa-EDTAMn37027.837.322.3CuSOP5HOCoC?6HOb肌醇甘氨酸0.0250.0251002琼脂PH80006.0成分含量成分 含量 成分 含量NHNO1650ZnSO77H2O 8.6 盐酸硫胺素 0.4KNO1900HBBO 6.2 盐酸吡哆醇 0.5KHPO170KI0.83烟酸0.5CaCl?2HO440NaMln0.25蔗糖30000名称r,曰―\微量儿

2.MS培养基所需母液以及扩大倍数扩大倍数 定容体积（ml） 吸取毫升/L50500205050020Ca盐5050020Mg盐5050020Fe盐5050020有机10020010肌醇10020010激素 100 50 53.3.配制母液所需的药品及称取量（注：根据表1与表2计算各物质的称取量）药品名称称取量（mg）药品名称称取量（mgNHNO41250KI20.75KNO47500NaMnOP2HO6.25KHPO4250CuSOP5HO0.625药品名称称取量(mg)药品名称称取量(mgCaC?2HObMgSCP7HO110009250CoC?6HO肌醇0.6252000FeSO?4HO695甘氨酸40Na-EDTA932.5盐酸硫胺素8MnSCP7HO557.5盐酸吡哆醇10ZnSO77HO215烟酸10HBO155b2MSb23

500ML存放于冰名称NHNO名称NHNOKNO4125047500名称KHPO4CaCb•重量(mg)425011000MS微量元素母液3

500ML存放于冰箱 中名称 重量KI 20.75

备 名称NaMoO・2HO2

。重量(mg)6.25HBO3

155

CuSO・5HO

0.625MnSO-7H2

557.5

CoCb

6H2

0.625ZnSO7HO2

215MS有机母液3箱中备用。名称

定量的卜夕U约品用蒸馏水溶解，疋容至重量(mg) 名称

200ML存放于冰重量(mg)盐酸吡哆醇

2000101

盐酸硫胺素 8甘氨酸 400MS铁盐母液的配制参考表3称取 疋量的卜列药品用蒸馏水溶解，疋容箱中备用。名称 重量(mg) 名称

500ML存放于冰重量(mg)EDTA二钠 932.5 FeSO4-4H2O 695MS钙盐母液的配制用。用。

311000mgCaCb?2HO500MLMS镁盐母液的配制39250mg的MgSQ7HO500ML7)MS肌醇母液的配制32000mg200ML(8)MS激素母液的配制1当量的NaOH1100mg100ml母液。(二)培养基的配制(1)(2)拌；(3)(4)

1L的MS培养基为例进行如下操作：1L的大烧杯，加入适量的蒸馏水在电磁炉上加热至沸腾；分别取(一)中配制的8种母液放入小烧杯中，然后加入，边加边搅称取30g蔗糖加入，边加边搅拌；称取8g琼脂加入，边加边搅拌，知之琼脂粉溶解；51L,加入激素母液，用NaOH调PH6.0左右；(6)紧；

将培养基分别分装于洗好的三角瓶中，塞上棉塞包上牛皮纸用绳子扎放入消毒灭菌锅灭菌，灭菌20分钟左右；灭菌后从灭菌锅中取出培养基，平放在实验台上令其冷却凝固。(三)高压蒸汽灭菌锅的使用方法具体操作步骤：高压锅放水至平把架；把包扎好的培养基装入高压锅；，()关上气阀和安全阀；然后接通电源；0.05MPa时，打开放气阀()；，0.11MPa0.12MPa0.11MPa20分钟；20()待再把培养基取出；

(注意对角扭松螺帽)稍待冷后25C4低温下保存。总结：高压灭菌锅的使用方法可归纳为：进水一放进培养基一盖紧锅盖一关上放汽阀一检查安全阀一接上加热源一待压力升至 0.05MPa时排锅内冷空气，关上放气-0.11MPa(12lC)下灭菌20~25分钟，保持稳定压力一除热源—逐渐打开气阀—锅内空气排除完后—开放锅盖—稍冷后取出培养基。、(四)无菌操作技术、1、植物材料表面——消毒剂灭菌从外界或室内选取的植物材料，都不同程度地带有各种微生物。这些污染源一旦带入培养基，便会造成培养基污染。因此，植物材料必须经严格的表面灭菌处理，再经无菌操作手续接到培养基上，这一过程叫做接种。2、接种步骤：第一步：清理材料―流水冲洗―加入吐温(或洗衣粉)清洗—自来水冲洗；第二步：对材料的表面浸润灭菌

：70%酉精浸10-30秒—无菌水；第三步：灭菌剂处理—0.1-1%升汞5-8min(或其他灭菌) ;第四步：无菌水进行冲洗。注意事项：灭菌剂一般要临时配制，现配现用•升汞可以短期储存；对去除较容易的灭菌剂灭菌后无菌水冲洗3 -4次，升汞一般5-8次,每次不少于3min；灭菌时要轻轻的搅拌，消除气泡，使消毒更彻底；灭菌时间是从倒入消毒液开始，至倒入无菌水时为止；灭菌液要充分浸没材料。3、无菌操作可按以下步骤进行：3320分钟，打开超净工作台的风机以及台上的紫外线灯；接种员先洗净双手，在缓冲间换好专用实验服，并换穿拖鞋等；先用酒精棉球搽拭接种工具，再将镊子和剪刀从头至尾过火一遍，然后反复过火尖端处，对培养皿要过火烤干；（6）接种时，接种员双手不能离开工作台，不能说话、走动和咳嗽等；材料吸干后，一手拿镊子、一手拿剪刀或解剖刀，对材料进行适当的切割。片切成0.5cm2的小块；茎切成含有一个节的小段。微茎尖要剥成只含原基）在接种过程中要经常灼烧接种器械，防止交叉污染；

（如叶1-2片叶7）种，每5天要大强度灭菌一次。

30分钟，若连续接（五）豌豆的萌发与豌豆外植体的接种1、准备打开超净工作台，将镊子酒精灯放如超净工作台中，用紫外灯照20min后关闭紫外灯，同时将豌豆种子用自来水冲 20min关闭紫外灯后在台242豆，大烧杯等放入超净工作台。2、灭菌在超净工作台上取经浸泡处理的豌豆，先用酒精倒入种子瓶中约 2/3消毒一次（1-2s）接着用无菌水冲洗一次。再用84350.5%HgCI泡8min，处理2次，每次5分钟。后用无菌水摇晃清洗4-5次。3、接种将所要用的三角瓶用75%的酒精喷湿，接着把手喷湿并把三角瓶带入超净工作台。接着将灭菌处理好的豌豆种子在超净工作台上用镊子靠近酒精灯的外焰入向下倾斜的锥形瓶杯中，每个瓶内装 4粒豌豆，接种过程放入暗处。（0.5厘米左右的小段，将茎上的叶片剪干净，平铺在培养基上；叶片成用镊子破碎，平铺在培养基上。）

0.5*0.54上。5、定期观察种子的萌发情况和外植体的分化情况，记录种子的萌发率、污染率以及愈伤组织的诱导率。种子的萌发率为：83.3%种子的污染率：0%外植体的污染率：100% 伤组织（茎）的诱导率愈伤组织（叶）