低温沼气产气量及效率提升综合方案

低温沼气产气量及效率提升综合方案实验目的、原理及任务1.1实验目的（1） 以沼气发酵原理为基础，通过在厌氧发酵过程中研究微生物、相关酶活性的变化过程以及与沼气产生之间的关系及动力学模型，以及非产甲烷菌和产甲烷菌在整个沼气发酵过程中的作用和功能，分析物质转化及沼气形成特点和整个反应过程链的促进作用和反馈抑制特点，分析沼气产生过程的生化过程特点，其物质降解转化及产生沼气的过程与能量代谢流的关系及其平衡关系。（2） 研制基于高效生产沼气的微生物和酶催化剂，完善催化剂成熟的制备工艺，使沼气产量提高，研究高效产沼气的生化反应体系有效控制模式及调控优化技术措施，开发出可用于沼气生产的基于专用微生物菌群和生物酶的高效催化剂制品。（3） 通过添加发酵促进剂，筛选出能提高沼气产量的外源添加物，筛选出各外源添加物后进行正交及验证试验，结合考虑促气效果及经济成本，得出最优组合，最后将该组合在沼气池中进行效果验证。1.2实验原理（1） 沼气工程是一个复杂的生化过程，需要多种产沼气微生物参与，多种生物酶促进了生物质向沼气的转化。大体可分为三个阶段:水解一产酸一产甲烷。水解阶段是在微生物的作用下把不溶于水的固形有机物转变成可溶于水的物质。许多微生物能分泌各种胞外酶，在胞外酶的作用下，固形有机物被水解成相对分子质量较小的可溶性物质。如纤维素酶、淀粉酶、蛋白质酶和脂肪酶等，通过对有机物质进行体外酶解，将多糖水解成单糖或二糖，蛋白质分解成多肽和氨基酸，脂肪分解成甘油和脂肪。产酸阶段是指第一阶段产生的各种可溶性物质（单糖、氨基酸、脂肪酸）进入细胞内后，在各种细菌胞内酶作用下继续分解代谢转化成低分子物质，如丁酸、丙酸、乙酸以及醇、酮、醛等简单的有机物质。最主要的产物是乙酸，也有氢（H2）、二氧化碳（CO2）、氨（NH3）和少量的其他产物。产甲烷阶段由产甲烷菌将前一阶段产生的低分子化合物如乙酸、甲酸、氢和二氧化碳还原转变为甲烷。中间产物乙酸、氢气等对产甲烷有双重作用，在其高于一定浓度时，抑制产甲烷。若能够很快被消耗，维持低的浓度时，对产甲烷有促进作用。在沼气厌氧发酵系统中，非产甲烷菌能为产甲烷菌提供营养，而且创造生活条件；产甲烷菌则将非产甲烷菌的代谢终产物H2/CO2及乙酸加以利用，产生甲烷。当前沼气工程中生物质转化不充分，产气量不足，为了增加沼气的产气量，提高非产甲烷菌对有机物的水解速度比产甲烷菌的继续富集更重要，特别是对纤维素的分解速度，在沼气自然发酵过程中，微生物对纤维素的分解较慢，应用产纤维素酶的菌株可以提高生物质的利用率，使畜禽粪便得到充分水解，提高沼气的产气量，实验结果表明接种低温驯化微生物对提高沼气产量起着决定性作用。（2） 目前常见的沼气高效催化剂产品主要是由一些耐低温纤维素降解菌和耐低温发酵细菌组成，但其在低温条件下应用效果有限。这与沼气发酵过程有关，在沼气发酵过程中共有四大类群微生物参与，分别是：水解发酵菌群、产氢产乙酸菌群、同型产乙酸菌群和产甲烷菌群，他们之间相互依赖又相互制约，共同构成了一条厌氧消化生物链。由于产甲烷菌利用氢气、二氧化碳和乙酸等简单有机物质生成甲烷，其倍增时间长，因此一般认为产甲烷菌合成甲烷的阶段为沼气发酵的限速步骤。产甲烷菌群相对于其它菌群对低温更为敏感，所以，在北方地区低温沼气发酵系统中常常出现挥发酸积累甚至酸化的现象。如果能选育出在低温条件下具有较高活性的产甲烷菌株，优化组配成产甲烷菌剂投加到沼气发酵系统中，进行生物强化沼气发酵过程，理论上就可以提高低温条件下产沼气效率。但产甲烷菌传代和培养条件苛刻，需严格厌氧，且倍增时间长，这给低温沼气发酵菌剂的开发带来了很大的困难。尽管产甲烷菌的活性对于沼气发酵起着决定性作用，但如果忽略其它相关微生物菌群的作用也不能达到理想的效果，因此，应从提高产甲烷菌活性、优化其它不产甲烷菌群，从整体上对沼气发酵微生物生态系统进行调控，实现沼气发酵过程的高效转化。（3）为了有效激活低温环境下沼气发酵系统中各微生物的生理活性，国内外对外源促进剂进行了系统研究。沼气发酵促进剂即指从产沼气发酵系统以外加人的以期提高沼气产量、甲烷含量的物质，如酶、营养物质、代谢促进物、吸附剂、螯合剂等。众多文献表明，向产沼气系统中加入促进剂，可以促进系统微生物的代谢，提高系统生物量，改善厌氧发酵各阶段的作用效率，从而更有效地利用底物，最终提高沼气产量。尤其在低温环境下，促进剂可激活系统微生物的代谢活性，解除低温抑制，提高产气量。当前对沼气发酵促进剂的产气影响研究主要集中在寻求有促气作用的各种外源促进剂及不同添加物的促气效果等方面，而对于不同添加物之间的复合作用以及提高产气的具体机制研究还不多。因此，可加强低温下促进剂的激活机理、低温高效促进剂开发、促进剂投配调控方法等方面的研究，最大程度地提高低温沼气产效率。1.3实验任务（1） 在成熟的沼气发酵池中分离出主要优势微生物，并筛选出促进产生沼气的纤维分解、半纤维分解、淀粉分解及一些特殊的产氢、产乙酸有益微生物菌群。（2） 在厌氧发酵过程中研究微生物、相关酶活性的变化过程以及与沼气产生之间的关系及动力学模型，研究非产甲烷菌和产甲烷菌在整个沼气发酵过程中的作用和功能，分析物质转化及沼气形成特点，以及整个反应过程链的促进作用和反馈抑制特点。分析沼气产生过程的生化过程特点，其物质降解转化及产生沼气的过程与能量代谢流的关系及其平衡关系，为进一步生化过程控制提供理论依据。（3） 利用现代发酵工程技术对沼气产特有发酵菌种进行驯化及培养，以高效低温纤维分解、半纤维分解、淀粉分解及一些特殊的产氢、产乙酸有益微生物菌群为基础，添加保护剂和稳定剂等助剂，研制基于高效生产沼气的微生物和酶催化剂，完善催化剂成熟的制备工艺，使沼气产量提高。（4） 通过添加发酵促进剂，筛选出能提高沼气产量的外源添加物，而后进行正交及验证试验，结合考虑促气效果及经济成本，得出最优组合，最后将该组合在沼气池中进行效果验证。（5） 研究高效产沼气的生化反应体系有效控制模式及调控优化技术措施。根据重庆白市驿板鸭食品有限责任公司现有沼气工程运行特点，制定应用技术方案，实现工程化应用，确定沼气催化剂最佳使用比例量和时间间隔，以及物料添加量，溶氧量、pH和氧化还原电位等，制定成熟应用技术措施方案。文献查阅及资料分析、实验优先级2.1高效催化剂2.1.1、 纤维素酶产生菌2.1.2、 产乙酸菌2.1.2、 产甲烷复合菌剂一一中科院成都生物研究所开发的产甲烷复合菌剂，活菌数达到2X107个/克。投加该菌剂后，在常温条件下，与普通污泥对比，启动时间至少缩短1/2，甲烷浓度相当，沼气总产气量可以提高25%以上。2.1.3、 产氢菌一一产氢菌对沼气发酵的生物强化作用可提高沼气总产量和甲烷总产量，累积甲烷产量增加11%。2.2发酵促进剂2.2.1、酶类一一吕淑霞和陈祖洁的研究表明：发酵物中（以TS计）添加3g.kg-1固体纤维素酶，甲烷产率可提高52.1%；而添加30U.kg-1液体纤维素酶，甲烷产率的提高幅度可高达88.8%ORademacher等人也添加多种酶用来提高厌氧污泥消化速率。Scheidat等人在初沉池污泥中加人蛋白酶、糖化酶和脂肪酶，发现在39°C和55°C下均能明显地提高水解作用。张无敌等人采用3种不同配方的水解酶进行试验，结果表明配方l和2均可提高沼气产量，分别为26.8l%和13.75%。2.2.2、 啤酒糟一一啤酒糟中含有酵母、微量元素等促进发酵微生物生长代谢的因子，另外还含有粗蛋白、淀粉、糖分等有机营养物质，在生长因子和有机营养物质的共同作用下可使产气量提高，并且在发酵前期能加速粪便中可溶性物质的降解，从而使得前期啤酒糟的促进作用更大，可考虑将其与加速产甲烷过程的添加物同时使用从而实现在发酵全过程均能提高产气量。2.2.3、 微量元素——添加一定的微量元素如铭、铜、镍、锌、铁、硒等能够促进沼气发酵微生物尤其是产甲烷菌菌群的活性，从而提高产气量。Geeta等人的研究表明2.5mg.L-1的Ni能最高增加54%的产气量。Speece等人发现，添加Ni时每克VSS的底物（乙酸）利用率可达10g.g-1d-1，而不加Ni时只有2-4.6g.g-1d-1，同时添加Ni和酵母提取物的底物（乙酸）可达l2-15g乙酸.g-1d-1。Sigh和Singh的研究表明，奶牛粪中添加Cu（N03）。亦能促进产气，在48d的停留时间内产气率比对照的0.036m-3.kg-1提高22.22%。同时，将各种微量元素组合应用也有较好的效果。李亚新和董春娟分别以醋酸钙和乙醇为基质，得出激活产甲烷菌的最佳微量元素组合为Fe，C0，Ni，与对照相比，产气速率分别提高了24.6%和25.4%。而陈朝猛等人以有机生活垃圾为底物投加Fe，Co,Ni，与不投加的系统相比，产气量增加了43.4%，甲烷含量提高了5.1%，COD去除率提高了10.2%。2.2.4、 吸附剂——一些吸附剂也能改善产气效果，吸附剂将微生物聚集起来，增加微生物密度，同时能保持对微生物生长有利的环境，从而让微生物更好地降解有机物质，加快挥发酸的消耗，提高产气量。Madamwar和Mithal在系统中加入10g.L-1的商用5果胶，使得最大产气量增加了150%，并且CH4含量可达65%。根据Kumar等人的研究，在批量式和半连续发酵装置中，添加商用木炭DarcoG-60能使沼气量分别提高17%和34.7%。Patel和Madamwar对不同的吸附剂进行了试验，有乳凝胶、聚乙烯醇、活性炭、果胶、高岭土、硅胶、铝粉、皂土、滑石土等，发现随着加入吸附剂量的增加，沼气量和CH含量均增加，且BOD，COD随之下降。2.2.5、螯合剂一一添加螯合剂不仅可以提供碳源，更重要的是提高其他无机营养元素的可利用性，使得微生物能够更好地利用营养物质，提高产甲烷菌的生长速率和种群的稳定性。添加环已烷二胺四醋酸（CDTA），氨三乙酸（NTA），乙二胺四乙酸（EDTA），柠檬酸（CA）四种螯合剂均可促进甲烷产量，提高量从5%-20%不等，其中氨三乙酸的促进作用最高，而且随着螯合剂的添加，产气量随时间的增加而增加。更有报道表明，加入0.1的伊红美蓝能使产气提高25%-35%。实验材料及方法（具体实验方法预览）3.1、高效催化剂3.1.1纤维素没产生菌的分离及其酶活力测定材料与方法试剂:DNS显色剂；2mol/L氢氧化钠溶液；80.0gNaoH；1L蒸馏水；羧酸甲基纤维素钠。培养基：①富集培养基：CMC2Na20.0g，胰蛋白胨2.0g，（NH4）2SO42.0g，MgSO4.7H2O0.3g，KH2PO44.0g，蒸馏水1000ml，自然PH值。②平板筛选培养基：CMC2Na20.0g，（NH4）2SO42.0g，KH2PO44.0g，NaCl0.5g，gSO4.7H2O0.5g，刚果红0.2g，蒸馏水1000ml，琼脂20.0g，自然PH值③摇瓶发酵产酶培养基：麸皮20.0g，胰蛋白胨2.0g，（NH4）2SO42.0g，MgSO4.7H2O0.3g，KH2PO44.0g，蒸馏水1000ml，自然PH值。1.1.3仪器设备：DNP-9272-1A电热恒温培养箱。BL-50立式压力蒸汽灭菌器筒,SW-CJ-1CU双人单面净化工作台，微波炉，DHZ-DA大容量冷冻恒温振荡器，UV-2100紫外可见分光光度计，GL-20G-2高速冷冻离心机。YXS-8型数显恒温水浴锅，Olympus生物显微镜。1.1.4实验取样。供试菌株取自校园内的草坪土、花台土等方法1.2.1纤维素产生菌的分离。从土中取样。接入富集液体培养基，在30摄氏度，50r/min振荡培养3』在平板筛选培养基上进行培养，选变色圈较大的菌株，经反复培养和划线分离，获得详解纤维素的纯菌落。1.2.2纤维素酶产生菌的鉴定对分离纯化出的四个纤维素酶产生菌株进行革兰氏染色，并在显微镜下观察其菌株形态。初步鉴别其种类。1.2.3摇瓶产酶试验。去菌种1环接种于装有20ml液体种子培养基的250ml三角瓶中，30摄氏度，50r/min振荡培养48h，按2%的接种量转移到30ml液体产酶培养基中，30摄氏度，50r/min振荡培养，定时取样测定发酵液中的酶活力。1.2.4酶活力测定。①葡萄糖标准曲线②粗酶液的制备③DNS法测酶活力2结果与分析＜纤维素酶产生菌的筛选〉一、 实验基本流程:培养基的配置，灭菌一一菌种分离，有关试剂的准备（刚果红的配置、DNS试剂的配置、0.1%葡萄糖标样的配置）一一鉴定菌种及纯化，葡萄糖标准曲线的制备一一发酵，酶活测定。二、 实验原理：a、纤维素酶产生菌的鉴定b、刚果红可以跟大分子多糖牢固结合，纤维素是大分子多糖，能与刚果红牢固结合，c、纤维素酶降解平板中的纤维素成小分子糖，那么刚果红无法与小分子糖结合就被洗脱下来。呈现透明圈。d、先用含有纤维素的平板培养菌，等菌长出来后。把菌体刮离。然后加入刚果红染色10-15分钟。再用NaCl冲洗2-3次，产生透明圈就是能水解纤维素的菌。也可以把刚果红直接加到平板中，菌在生长过程中也会逐渐形成透明圈，不过前面的方法更为灵敏。e、纤维素酶活测定，纤维素酶能将羧甲基纤维素钠降解成寡糖和单糖，具有还原性末端的寡糖和具有还原基团的单糖在沸水浴中可以与DNS试剂发生显色反应，反应液颜色的强度与酶解产生的还原糖量成正比，而还原糖的生成量又与反应液中纤维素酶的活力成正比。三、 培养基CMC-Na筛选培养基碳源（CMC-Na）：0.5g、蛋白月东：0.5g、KH2PO4：0.1g、MgSO4.7H2O:0.05g、酵母粉：0.05g、琼脂：1.5g、水：100ml、PH：7.0滤纸筛选培养基：以上细菌培养基中碳源改成0.5g绿植条，其他成分相同刚果红鉴定培养基：碳源（CMC-Na）:2.0g/l、（NH4）2SO4：2.0g/l、KH2PP4：1g/l、MgSO4.7H2O:0.05g/l、NaCl：0.5g/l、刚果红：0.2g/l、琼脂20g/l、PH：7.0四、 实验步骤：两种培养基的配制与其他材料的准备及灭菌一一分装，制斜面培养基一一3.将土样置于无菌生理盐水中（0.9%NaCl溶液），制备成菌悬液，将菌悬液用无菌移液管各移取5ml至CMC-Na和滤纸条筛选培养基中，于28度摇床培养一周。4.取筛选后的菌液用无菌水梯度稀释涂布于刚果红鉴定平板上，28度培养箱培养48小时，观察透明圈的大小5.挑取透明圈大的菌落，于CMC-Na培养基斜面中28度培养后冰箱4度保存。注：该小节内容已初步完成3.2.发酵促进剂3.1.1、啤酒糟【（1）实验材料1）沼气发酵底物（1） 牛粪：总固体含量（TS）20%〜25%。（2） 产甲烷培养基：CH3COONa・3H2O10g，HCOONa3g，CH3OH1mL，MgCl2.6H2O0.1g，K2HPO4•3H2O0.4g，KH2PO40.4g，NH4Cl1.0g，水1L，pH7.0。2） 接种物：家畜粪便室温下富集一周而得，TS16.02%。3） 外源添加物种类及成份4） 化学试剂：硫酸亚铁、氯化钻、氯化镍、硫酸锌、硫酸锰、活性炭、纤维素酶。根据相关文献报导及前期试验基础，选择一些对沼气发酵过程中水解和产甲烷两阶段有促进作用的外源添加物进行试验。所选的外源添加物种类及成份如下：微量元素液1（简称W1）:含Fe、Co、Ni，配制方法参照文献［12］；微量元素液11（简称W2）:含Fe、Co、Ni、Ca、Na、Zn等，配制方法参照文献［13］；维生素液：含生物素、叶酸、盐酸、核黄素等，配制方法参照文献［13］；物质M：蛋白东、氨基酸等的混合物；菌液：厌氧纤维素降解菌富集液，由厌氧污泥加富集培养基［14］室温下富集30d而得；酶I：纤维素酶；酶II:纤维素酶、蛋白酶；酶III:纤维素酶、蛋白酶、糖化酶、淀粉酶；甲胺磷：购于成都市某农贸市场；啤酒糟（干）：啤酒厂可购买。（2）实验方法将发酵底物和接种物混匀后装入1.5L发酵瓶，调节pH为7.0,室温下进行批式发酵，排水集气法收集沼气，每天定时测定产气量。1） 以猪粪为底物的筛选试验以牛粪为底物，待产气稳定后，分别加入2.0g/L啤酒糟、10.0mL/L菌液、酶I、酶II、酶111（各酶的用量参照文献15］）进行试验，并设置对照组（即不加任何外源添加物），每组均设3个重复。各组接种量为20%，料液TS8%。2） 以产甲烷培养基为底物的筛选试验以产甲烷培养基为底物，待产气稳定后分别加入10.0mL/LW1、10.0mL/LW2、2.0g/L物质M、1.0mg/L甲胺磷