DB37-T 4000-2020 羊A型产气荚膜梭菌PCR和ELISA检测技术规程-（高清版）

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DB37山 东 省 地 方 标 准DB37/T4000—2020羊APCRELISA规程TechnicalspecificationfordetectionofsheepclostridiumperfringensbyPCRandTechnicalspecificationfordetectionofsheepclostridiumperfringensbyPCRandELISA2020060820200708山东省市场监督管理局发布前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出并组织实施。本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。本标准主要起草单位：山东农业大学、山东省动物疫病预防与控制中心。APCRELISA范围本标准规定了羊A型产气荚膜梭菌PCR和ELISA检测方法的技术规范。本标准适用于羊A型产气荚膜梭菌PCR和ELISA的检测。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB14925实验动物环境及设施下列术语和定义适用于本文件。3.13.1一抗酶联免疫吸附试验（ELISA）中用于与包被的抗原结合的抗体称为一抗。阴阳性血清和待检血清统称为一抗。3.2二抗IgG4试剂或材料使用A型产气荚膜梭菌标准株CVCC41。羊经免疫产气荚膜梭菌抗原3次后获得的血清，每次免疫间隔两周。抗体中和试验检测效价高于1:256（附录A）。从健康的未感染未免疫的羊分离的血清（附录A）。灭菌0.5PBSPBSTTris-HCLbuffer；dNTP；TaqTrisR-25030%（SDS）（AP）（TEMED）FT培L水试验用水符合GB/T6682三级水的规定。20μL～100μLPCR：200μL1.0mL。16000r/min96ELISA340nm～850nm340nm～850nm6产气荚膜梭菌PCR检测方法6.1本检测方法在200μL的离心管中进行，所使用的引物如下：表1产气荚膜梭菌PCR引物序列/0.250.25/体积比为40%的蔗糖水溶液。0.04MTris-0.001M（EDTA）TAE0.5μg/mL/1.5DNADNAPCRPCR（50μL）：10×PCRbuffer（Mg2+）5.0μL、2.5mmol/LdNTP4.0μL、Taq0.3μL2.0μL10pmol/μL50μL；PrimersPrimersequence(5’-3’)Size(bp)CPA-FTATGAATGGCAAAGAGGA589CPA-RACTAAAATACTGACCTTCPCR94℃73056℃3072℃45s，307210min；PCR0.5μg/mL1.56.5结果判定PCR589bp（图1PCR注：注：M代表DNAMarker；1,2,3,4代表检测样本。7ELISA检测方法包被（0.05mol/LpH9.6）10μg/mL，封闭用PBST洗涤酶标板5次。每孔加入封闭液（含1%BSA的PBS）200μL，置于湿盒内，4℃封闭过夜。用PBST洗涤酶标板5次。取1孔加入1:10倍稀释羊抗产气荚膜梭菌α毒素高免血清作为阳性对照（制备方法见附录B），取1孔加入1:10倍稀释的羊阴性血清作为阴性对照（制备方法见附录B）；其它孔加1:10稀释的待检血清，置湿盒内37℃作用60min。抗体稀释液为1℅BSA的PBS。用PBST洗涤酶标板5次。加入1:5000稀释的HRP标记的兔抗羊IgG（抗体稀释液为1℅BSA的PBS），置湿盒内37℃作用45min。用PBST洗涤酶标板5次。加底物反应液，置湿盒内37℃避光显色20min。读数最后用2.0mol/L的H2SO4溶液终止反应，以酶标仪检测样品的OD490值。以待测孔的OD值大于或等于阴性对照孔的2倍者，即P/N大于或等于2判为阳性，重复3次计算平均值。附录A（资料性附录）羊产气荚膜梭菌α毒素的提取和抗血清的制备α（CVCC41）200mLFT37℃5（A）435h-6h进行（12000r/min，30min）0.22µm40%，4离心（10000r/min，20min）2%TritonX-100的Tris-MgCL2403.0mL0.05M的Tris-HCL（PH=7.5）α采用Bradford161.0mg/mL：0mL0.01mL、0.02mL、0.04mL、0.06mL、0.08mL0.1mL，0.1mL；5.0mLG-250）；min-5min595nmA59510.1mL5.0mLG-25095%（mg）A595A5950.5mg/mLA5950.50（10mg/mL-100mg/mL）0.5mL或1.0mL，0.5mL1.0mLG-2505.0mL595nm0.05mg/mLA5950.29。αSDS（SDS）512BR-2500.337℃96h5h-6hV:V1:α选取15kgα3210mg/只GB最后dα-20采集健康未感染过产气荚膜梭菌的羊，制备阴性血清。附录B（0.5称取9.0g（NaCl）1.0L5.0mL（PBS）1mol/LPBS（pH7.2）的配方如下：（NaCL）：8.0g；（KCL）：0.2g；(Na2HPO4)：1.44g；d)磷酸二氢钾(KH2PO4)：0.24g；e)加水900mL，调pH等于7.2，定容至1000mL。B.3PBST缓冲液的配制B.3PBST缓冲液的配制1.0LPBS+1.0mLTween-20。B.4牛血清白蛋白（BSA）将100mg9.5mL（）10mLB.5Tris-HcL缓冲液的配制配方如下：a)Tris碱：121.1g；（1mol/LHCl）：42.0mL；1000mL在900mL水中加入121.1gTris碱，溶液冷却至室温后调节溶液pH值至8.0，然后定容至1000mL，分装后高压蒸汽灭菌30min，室温保存。B.65%浓缩胶配制配方如下：a)水：2.1mL；b)30%丙烯酰胺：0.5mL；c)1.0MTris-HCLbuffer：0.38mL；d)10%SDS：0.03mL；e)10%过硫酸铵（AP）：0.03mL；f)TEMED：0.003mL。12%配方如下：a)水：1.65mL；b)30%丙烯酰胺：2.0mL；c)1.0MTris-HCLbuffer：1