实验五DNA限制性酶切和琼脂糖凝胶电课件

限制性内切酶限制性内切酶1EcoRIRestrictionEnzyme识别序列：

------G↓AATTC------

------CTTAA↓G------EcoRIRestrictionEnzyme识别序列2HindIIIRestrictionEnzyme识别序列：

------A↓AGCTT------

------TTCGA↓A------

HindIIIRestrictionEnzyme识别3每一种限制性内切酶都有特定的反应条件

pH范围：7.5~8.0

缓冲液组份:Tris(三羟甲基氨基甲烷）

NaCl、MgCl2、巯基乙醇温度：37℃每一种限制性内切酶都有特定的反应条件4琼脂糖凝胶电泳

是一种简便、快速的分离纯化和鉴定核酸的方法。

琼脂糖是一种线性多糖聚合物。琼脂糖粉末加热到熔点后冷却凝固,会形成良好的电泳介质。琼脂糖凝胶电泳是一种简便、快速的分离纯化和鉴定核酸5电泳

在电场的作用下，在某种支持介质上，将一个混合物分离成若干条区带的过程。电泳在电场的作用下，在某种支持介质上6琼脂糖凝胶的浓度与DNA分离范围琼脂糖浓度(%)线型DNA分离范围(Kb)0.35～600.61～200.70.8～100.90.5～71.20.9～61.50.2～312.00.1～2琼脂糖凝胶的浓度与DNA分离范围琼脂糖浓度(%)线型DNA分7试剂TBE电泳缓冲液

45mmol/LTris-硼酸，1mmol/LEDTA，pH8.0加样缓冲液

0.25%溴酚蓝（深蓝色，300bp)0.25%xylenecyanloFF（天蓝色，2000bp）40%蔗糖EB（溴化乙锭）染色液（有毒）

0.5ug/ml，用水配制试剂TBE电泳缓冲液8溴化乙锭(ethidiumbromide，EB)是一种扁平分子荧光染料，可嵌入核酸的碱基对之间，在紫外线激发下，发出桔红色荧光。电泳结束后，将凝胶浸入0.5ug/ml的EB溶液中染色10min。在紫外光照射下可见核酸电泳带，DNA量一般>5ng。溴化乙锭(ethidiumbromide，EB)是一种扁平9操作步骤操作步骤10酶切反应反应体系

λ－DNA5ul

10xBuffer2ul

HindIII3ulH2O10ul

Total20ul混匀，37度保温30分钟酶切反应反应体系11

制胶用电极缓冲液（0.5×TBE）配制0.7%的琼脂糖胶20mL0.14g琼脂糖，20mL0.5×TBE微波炉加热至沸腾，确定琼脂糖完全溶解冷却至60℃左右准备好梳子和胶槽，倒入琼脂糖溶液，冷却凝固制胶用电极缓冲液12点样Sample1自提DNA5ul+2ulLoadingDye

Sample2自提DNA酶切液20ul+4ulLoadingDyeSample3λ-DNA5ul+2ulLoadingDye

Sample4λ-DNA酶切液20ul+4ulLoadingDye

点样：

Sample1和3各7ul

Sample2和4各10ul点样Sample1自提DNA5ul+2ulLoa13电泳接通电源，150v电泳0.5小时电泳14染色和观察切断电源，取出胶模，将凝胶放入EB染色液中，染色10分钟取出凝胶，紫外灯下观察DNA电泳带型染色和观察切断电源，取出胶模，将凝胶放入EB染色液中，染色115警告EB诱变染色和观察时一定要带手套！警告EB诱变16

1234

←RNA提示1自提DNA2自提DNA/HindIII

3λ-DNA/HindIII4λ-DNA123417结果记录与分析绘制电泳图谱结果记录与分析绘制电泳图谱18λ-DNA/HindIIIMarkerλ-DNA/HindIIIMarker

用HindIII彻底降解λ-DNA贮藏缓冲液：

10mmol/LTris-HCl(pH7.5),10mol/LNaCl,1mol/LEDTAλ-DNA/HindIIIMarkerλ-19λ-DNA/HindIIIMarkers

片段大小（bp）和电泳带型示意图点样孔2313094166557436123222027λ-DNA/HindIIIMarkers

片段大小（20限制性内切酶限制性内切酶21EcoRIRestrictionEnzyme识别序列：

------G↓AATTC------

------CTTAA↓G------EcoRIRestrictionEnzyme识别序列22HindIIIRestrictionEnzyme识别序列：

------A↓AGCTT------

------TTCGA↓A------

HindIIIRestrictionEnzyme识别23每一种限制性内切酶都有特定的反应条件

pH范围：7.5~8.0

缓冲液组份:Tris(三羟甲基氨基甲烷）

NaCl、MgCl2、巯基乙醇温度：37℃每一种限制性内切酶都有特定的反应条件24琼脂糖凝胶电泳

是一种简便、快速的分离纯化和鉴定核酸的方法。

琼脂糖是一种线性多糖聚合物。琼脂糖粉末加热到熔点后冷却凝固,会形成良好的电泳介质。琼脂糖凝胶电泳是一种简便、快速的分离纯化和鉴定核酸25电泳

在电场的作用下，在某种支持介质上，将一个混合物分离成若干条区带的过程。电泳在电场的作用下，在某种支持介质上26琼脂糖凝胶的浓度与DNA分离范围琼脂糖浓度(%)线型DNA分离范围(Kb)0.35～600.61～200.70.8～100.90.5～71.20.9～61.50.2～312.00.1～2琼脂糖凝胶的浓度与DNA分离范围琼脂糖浓度(%)线型DNA分27试剂TBE电泳缓冲液

45mmol/LTris-硼酸，1mmol/LEDTA，pH8.0加样缓冲液

0.25%溴酚蓝（深蓝色，300bp)0.25%xylenecyanloFF（天蓝色，2000bp）40%蔗糖EB（溴化乙锭）染色液（有毒）

0.5ug/ml，用水配制试剂TBE电泳缓冲液28溴化乙锭(ethidiumbromide，EB)是一种扁平分子荧光染料，可嵌入核酸的碱基对之间，在紫外线激发下，发出桔红色荧光。电泳结束后，将凝胶浸入0.5ug/ml的EB溶液中染色10min。在紫外光照射下可见核酸电泳带，DNA量一般>5ng。溴化乙锭(ethidiumbromide，EB)是一种扁平29操作步骤操作步骤30酶切反应反应体系

λ－DNA5ul

10xBuffer2ul

HindIII3ulH2O10ul

Total20ul混匀，37度保温30分钟酶切反应反应体系31

制胶用电极缓冲液（0.5×TBE）配制0.7%的琼脂糖胶20mL0.14g琼脂糖，20mL0.5×TBE微波炉加热至沸腾，确定琼脂糖完全溶解冷却至60℃左右准备好梳子和胶槽，倒入琼脂糖溶液，冷却凝固制胶用电极缓冲液32点样Sample1自提DNA5ul+2ulLoadingDye

Sample2自提DNA酶切液20ul+4ulLoadingDyeSample3λ-DNA5ul+2ulLoadingDye

Sample4λ-DNA酶切液20ul+4ulLoadingDye

点样：

Sample1和3各7ul

Sample2和4各10ul点样Sample1自提DNA5ul+2ulLoa33电泳接通电源，150v电泳0.5小时电泳34染色和观察切断电源，取出胶模，将凝胶放入EB染色液中，染色10分钟取出凝胶，紫外灯下观察DNA电泳带型染色和观察切断电源，取出胶模，将凝胶放入EB染色液中，染色135警告EB诱变染色和观察时一定要带手套！警告EB诱变36

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←RNA提示1自提DNA2自提DNA/HindIII

3λ-DNA/HindIII4λ-DNA123437结果记录与分析绘制电泳图谱结果记录与分析绘制电泳图谱38λ-DNA/HindIIIMarkerλ-DNA/HindI