分子杂交和印迹技术课件

2022/11/111:531第四节分子印迹与杂交技术MolecularBlotting&HybridizationTechnology江黎明2013年10月2022/11/920:571第四节分子印迹与杂交技术Mo指具有一定互补序列、不同来源的核苷酸单链，在一定条件下按照碱基互补配对的原则，形成核苷酸双链的过程。核酸分子杂交(nucleicacidhybridization)印迹(blotting)指利用各种物理方法，使电泳凝胶中的生物大分子转移到硝基纤维膜等特定的支持物上，使之成为固相化分子的过程。2022/11/111:532Marmum和Doty1961年发现的DNA变性复性现象是核酸杂交技术的理论基础。指具有一定互补序列、不同来源的核苷酸单链，在一定条件(heteroduplex)2022/11/111:533(heteroduplex)2022/11/920:573一、印迹技术(blotting)1975年EdwenSouthern建立的DNA印迹杂交。指将电泳凝胶中的生物大分子转移(印迹)于固定化介质如硝酸纤维素膜上并加以检测分析的技术。支持物转移缓冲液纸巾玻璃板500g（1）印迹：电转移真空负压吸引转移Whatman滤纸凝胶Whatman滤纸重物NC膜或尼龙膜毛细作用转移2022/11/111:534一、印迹技术(blotting)1975年EdwenSou

NC膜上载有的DNA单链分子就可以在杂交液中与另一种DNA或RNA分子(称为探针，可用同位素或非同位素标记)进行杂交。具有互补序列的RNA或DNA标记探针结合到存在于NC膜的DNA分子上，经放射自显影或其他检测技术就可以显现杂交分子的有无和位置。（2）杂交：（3）显示：2022/11/111:535NC膜上载有的DNA单链分子就可以在杂交液中与另一种（1）特定基因序列的定性和定量分析核酸分子杂交应用（2）基因克隆的筛选（3）酶切图谱的制作（4）基因突变分析（5）疾病的诊断2022/11/111:536（1）特定基因序列的定性和定量分析核酸分子杂交应用（2）基因二、探针的种类和制备探针(probe)的概念：

用来检测某一特定核苷酸序列或基因序列的DNA或RNA的互补标记片段：与待测特定核苷酸的某一段序列相互补；有明确的标志用于后续的检测。2022/11/111:537二、探针的种类和制备探针(probe)的概念：探针的种类寡核苷酸探针基因组DNA探针cDNA探针RNA探针（一）常用探针的种类DNA探针2022/11/111:538探针的种类寡核苷酸探针基因组DNA探针cDNA探针RNA探针1．DNA探针双链探针:单链探针从克隆在质粒载体中的特异性基因片段制备；优点则是容易制备。用化学法合成或从克隆在M13噬菌体的特异性基因片段制备；优点是在杂交反应中可以排除互补链的干扰。2022/11/111:5391．DNA探针双链探针:单链探针从克隆在质粒载体中的2．RNA探针早期采用细胞mRNA和病毒RNA作探针主要用于研究目的，而不是用于检测。如筛选HIV的基因组DNA克隆、进行中的转录分析等式。与DNA单链探针相比，RNA探针具有标记效率高、易于纯化、成本低和杂交信号强等优点标记是在细胞基因转录或病毒复制过程，效率往往不高，且受多种因素的制约。2022/11/111:53102．RNA探针早期采用细胞mRNA和病毒RNA作探针（二）核酸探针的标记根据是否使用放射性标记物可分为放射性标记和非放射性标记；根据标记物掺入情况可分为均匀标记和末端标记探针。理想标记物应备条件①不影响碱基对特异性④有较高的化学稳定性②检测方法高度特异、灵敏③标记及检测方法简单⑤环保，无损害⑥价格低廉2022/11/111:5311（二）核酸探针的标记根据是否使用放射性标记物可分为放优点缺点灵敏度和特异性极高半衰期短,随用随标1.放射性同位素标记探针对各种酶促反应无任何影响不影响碱基配对的特异性与稳定性放射性污染用于核酸探针标记的放射性同位素主要有32P、3H和35S等；32P应用最多。2022/11/111:5312优点缺点灵敏度和特异性极高半衰期短,随用随标1.放射性同位

32P的放射性较强，放射自显影所需时间较短，灵敏度高，可广泛应用于各种印迹杂交。缺点是半衰期短(14.3天)，射线散射严重，放射自显影后X胶片上的信号有时边缘不清。r-32PATPa-32PdATP**3’H2’dATP2022/11/111:531332P的放射性较强，放射自显影所需时间较短，灵敏度高当双链DNA一条链上产生切口时，E.coliDNA聚合酶Ⅰ的5’→3’聚合酶活性可将核苷酸连接到切口的3’羟基末端；同时，5’→3’的外切酶活性能从切口的5’端除去核苷酸。

最适切口平移的片段一般为50-500个核苷酸。(1)DNA切口平移(nicktranslation)

标记法在切去切口5’端核苷酸的同时又在切口的3’端补上核苷酸，可使切口沿着DNA链移动；用放射性核苷酸代替原先无放射性的核苷酸，将放射性同位素掺入到合成新链中。2022/11/111:5314核酸探针的标记方法当双链DNA一条链上产生切口时，E.coliDNADNA酶Ⅰ：在双链DNA上随机打开若干个单链缺口，产生3’-OH端。大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ：5’→3’DNA聚合酶活性；5’→3’

外切核酸酶活性。DNA切口平移标记法示意图2022/11/111:5315DNA酶Ⅰ：在双链DNA上随机打开若干个单链缺口，产生3’-使寡核苷酸随机引物与DNA模板结合，在Klenow酶的作用下，合成DNA探针。合成产物的大小、产量、比活性依赖于反应中模板、引物、dNTP和酶的量。通常，产物平均长度为400-600个核苷酸。(2)DNA随机引物标记法2022/11/111:5316使寡核苷酸随机引物与DNA模板结合，在Klenow酶随机引物：含有各种可能排列顺序的寡核苷酸片段的混合物。46=4096DNA聚合酶ⅠKlenow片段：保留5’→3’DNA聚合酶活性,弱3’→5’外切酶活性，无5’→3’外切酶活性。DNA随机引物标记法示意图2022/11/111:5317随机引物：含有各种可能排列顺序的寡核苷酸片段的混合物。46=优点：Klenow片段没有5’→3’外切酶活性，反应稳定，可以获得大量的有效探针；对模板的要求不严格，用微量制备的质粒DNA模板也可进行反应；产物的比活性较高，可达4×109cpm/μg探针；随机引物反应还可在低熔点琼脂糖中直接进行。2022/11/111:5318优点：Klenow片段没有5’→3’外切酶活性，反应稳定，可5′3′3′5′完整双链DNA限制性内切酶5′3′3′5′[α-32P]-dNTP其他3种dNTPKlenowDNA聚合酶5′3′3′5′变性5′3′3′5′5′末端突出的DNA3′末端标记的DNA32P-末端标记的单链DNA探针1)DNA的3′末端标记(3)DNA的末端标记2022/11/111:53195′3′3′5′完整双链DNA限制性内切酶5′3条件是有5’-OH存在，人工合成寡核苷酸最常用；双链DNA需用碱性磷酸酶切除5’-P后再标记5′pCpGpTpA……3′5′HO-CpGpTpA……3′T4噬菌体多核苷酸激酶[γ-32P]-ATP5′32p-O-CpGpTpA……3′37℃，反应10min,γ-32P-ATP需150μci/反应2)DNA的5′末端标记碱性磷酸酶2022/11/111:5320条件是有5’-OH存在，人工合成寡核苷酸最常用；双链标记探针的纯化凝胶过滤层析常用的凝胶基质：SephadexG-50、Bio-GelP-60选择性沉淀乙醇存在，醋酸铵可起此作用。2022/11/111:5321标记探针的纯化凝胶过滤层析常用的凝胶基质：Sepha核酸探针的标记方法(1)DNA切口平移标记法(2)DNA随机引物标记法(7)RNA探针的标记(3)DNA的末端标记(4)cDNA探针的标记(5)寡核苷酸探针的标记(6)单链DNA探针的标记2022/11/111:5322核酸探针的标记方法(1)DNA切口平移标记法(2)DNA2.非放射性标记物优点缺点灵敏度较放射性同位素标记低无放射性污染用于核酸探针标记的非放射性标记物主要有生物素、地高辛和荧光素(FITC、罗丹明)等。稳定性好,可较长时间存放特异性较放射性同位素标记低2022/11/111:53232.非放射性标记物优点缺点灵敏度较放射性同位素标记低无放射2022/11/111:5324ThemethodusedtoproducenonradioactiveDNAmoleculesthatcarryaspecificchemicalmarkerthatcanbedetectedwithanappropriateantibody.biotin-avidinsystemDig-dUTP2022/11/920:5824Themethod④HRP/AP标记抗体与Dig结合②漂洗和封闭YHRPHRPHRP⑤底物与抗体-HRP/AP反应,显色或发光底物①

电泳,转膜，紫外交联固定D││D

North-South杂交原理和操作流程(地高辛标记)③杂交：Dig标记的探针与靶DNA结合2022/11/111:5325④HRP/AP标记抗体与Dig结合②漂洗和封闭YHRPHRP别名：VitaminH分子量：244.31水溶性好关于生物素结合对象：亲和素Avidin链亲和素Streptavidin中性亲和素NeutrAvidin单体亲和素MonoAvidin

2022/11/111:5326别名：VitaminH关于生物素结合对象：亲和素Avidi

North-South杂交原理和操作流程(Biotin标记)③杂交：生物素标记的探针与靶DNA结合⑤底物在HRP催化下,反应发光②洗膜封闭①电泳,转膜，紫外交联固定SAHRP底物B││B④HRP标记的链亲和素与探针上的生物素结合2022/11/111:5327North-South杂交原理和操作流程(Biotin标1.曝光：用滤纸吸去杂交膜上多余底物，作好标记，

保鲜膜包裹，放在暗夹里，放上X光片，曝光1-5

分钟；2.显影：取出X光片，按使用说明书显影和定影。后继的化学发光检测

Luminol化学发光原理2022/11/111:5328思考题：1.曝光：用滤纸吸去杂交膜上多余底物，作好标记，2.显影：取三、印迹技术的种类和用途（一）DNA印迹杂交技术（二）RNA印迹杂交技术（四）蛋白质印迹杂交技术（三）其它核酸印迹杂交技术2022/11/111:5329三、印迹技术的种类和用途（一）DNA印迹杂交技术（二）RNA（一）Southern印迹杂交

Southern印迹杂交（Southernblotting）是指DNA与DNA分子之间的杂交。基本过程:

将琼脂糖凝胶电泳分离的待测DNA片段变性，再将凝胶中的DNA分子转移到硝基纤维膜等固相支持物上，然后用标记的探针检测待测的DNA。可用于基因组DNA的定性与定量分析，重组质粒和噬菌体的分析等。2022/11/111:5330（一）Southern印迹杂交Southern印迹杂Southern印迹杂交的基本步骤:

①待测DNA样品的限制性内切酶消化②酶切DNA样品的电泳分离③凝胶中DNA的变性和Southern转移④探针的制备⑤Southern杂交⑥杂交结果的检测2022/11/111:5331Southern印迹杂交的基本步骤:①待测DNA样品的限2022/11/111:53322022/11/920:5832（二）Northern印迹杂交

利用类似于Southern印迹杂交的技术来检测RNA称为Northern印迹杂交（Northernblotting）。原理和过程与Southern印迹基本相同，只是检测的分子是RNA，可用来对组织或细胞中的mRNA进行定性或定量分析。2022/11/111:5333（二）Northern印迹杂交利用类似于SoutheNorthern与Southernblotting的异同点相同点：原理均为毛细作用用途：检测组织或细胞中已知的特异mRNA的表达水平；比较不同组织和细胞的同一基因的表达情况。不同点：转移的是RNA转移前无需酶切转移效率较高变性方法:DNA(碱变性）

RNA（甲醛、乙二醛等）2022/11/111:5334Northern与Southernblotting的异同将菌落或噬菌斑影印在尼龙膜上(以前用硝酸纤维膜)，这种膜只吸附单链DNA；用NaOH处理，这样不仅可以杀死细菌，同时可使DNA变性吸附在膜上；用无关的单链DNA，如小牛胸腺DNA和鲑鱼精子DNA预杂交。膜经中和后再将标记探针和膜放在缓冲溶液中缓缓复性，经放射自显影来确定阳性菌落。3.膜上分子杂交*方法：2022/11/111:5335（三）其他核酸杂交方法将菌落或噬菌斑影印在尼龙膜上(以前用硝酸纤维膜)，这（1）菌落杂交法colonyhybridizationmethod对分散在若干个琼脂平板上的少数菌落(~200)

进行克隆筛选时，可采用本方法。将这些菌落归并到一个琼脂主平板，第二个琼

脂平板表面铺一张硝酸纤维素滤膜。经培养一

段时间后，对菌落进行原位裂解。主平板应贮存于4℃直至得到筛选结果。2022/11/111:5336（1）菌落杂交法colonyhybridization2022/11/111:5337Screeningagenomiclibrarybycolonyhybridization.2022/11/920:5837Screeningag（2）噬菌斑杂交法plaquebybridization噬菌体为载体进行DNA克隆繁殖时所常用的方法。将在琼脂培养基上形成的噬菌体的噬菌斑，移于

硝酸纤维素滤纸上，碱处理使噬菌体DNA变性；DNA固定于硝酸纤维素滤纸上，与用放射性同位

素标记的特定的RNA或DNA片段进行杂交；通过放射自显影法来识别含有所需DNA序列的噬

菌体的噬菌斑，并从原来的琼脂培养基中选出与

其对应的噬菌斑2022/11/111:5338（2）噬菌斑杂交法plaquebybridization限制酶切位点限制酶消化除去中间片段cosLRcoscosL左臂Rcos右臂真核生物染色体DNA限制酶部分消化外源DNA与载体DNA混合连接反应体外包装用重组噬菌体感染大肠杆菌~20KbDNA片段cosLRcos~20Kb外源DNA片段gDNA文库EMBL3/4系列(置换型，适用于基因组DNA文库构建)11/11/20221:53AM39限制酶切位点限制酶消化除去中间片段cosLRcosc2022/11/111:53402022/11/920:5840（四）蛋白质印迹技术(Westernblotting)

根据蛋白质分子之间存在相互作用的特点，将蛋白质电泳分离，然后将其转移和固定于固体支持物（NC膜或其它膜）上，再用相应的蛋白质分子（最常用的是抗体）对其进行检测。因此，被称为免疫印迹（immunoblotting）技术。

用Westernblotting检测样品中存在特异蛋白质用于细胞中特异蛋白质的定量分析用于蛋白质分子的相互作用研究2022/11/111:5341（四）蛋白质印迹技术(Westernblotting)(1)蛋白样品的制备WesternBlot流程(2)SDS(3)转膜(4)封闭(5)抗体杂交及

底物显色(1)蛋白样品的制备WesternBlot流程(2)S（1）蛋白样品的制备总蛋白制备水溶液提取法：大多数蛋白质在稀盐和缓冲液中稳定性好、溶解度大；故稀盐和缓冲液是提取蛋白质最常用的溶剂。有机溶剂提取法：对于分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有机溶剂提取，包括乙醇和丙酮。通过层析或电洗脱法制备目的蛋白。2022/11/111:5343（1）蛋白样品的制备总蛋白制备水溶液提取法：大多数蛋白质在稀蛋白样品的定量目前常用比色法测定样品蛋白的含量：Bradford法（考马斯亮蓝法）Lowry法（Folin-酚试剂法）BCA法（二喹啉甲酸）等。各有优缺点，可以根据具体情况选取。按相应说明操作，测定样品浓度。蛋白样品的定量目前常用比色法测定样品蛋白的含量：Bradfo蛋白样品的变性1MTris-HCl(pH6.8)10ml1MDTT20mlSDS4g甘油20ml溴酚蓝0.2g总体积100ml100mMTris-HCl(pH6.8)200mMDTT4%SDS20%甘油0.2%溴酚兰ddH2O2×SDS上样缓冲液：按1:1与蛋白质样品混合，95-100℃加热5-15min，冰上冷却后，上样20-25μl，总蛋白量20-50μg。2022/11/111:5345蛋白样品的变性1MTris-HCl(pH6.8)10mlStakinggelSeparatinggel（2）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳2022/11/111:5346StakinggelSeparatinggel（2）SD湿转系统（3）转膜2022/11/111:5347湿转系统（3）转膜2022/11/920:5847半干转移系统2022/11/111:5348半干转移系统2022/11/920:5848常用的蛋白质转移膜种类微孔大小结合能力特点NC膜0.45um80-100ug/cm2应用广泛<20kD易丢失PVDF膜0.22um0.22um80-100ug/cm2170-200ug/cm2<20kD不易丢失容量大、强度高尼龙膜480ug/cm2常用的蛋白质转移膜种类微孔大小结合能力特点NC膜0.4丽春红染色蛋白带出现后，于室温用去离子水漂洗硝酸纤维素滤膜，换水几次。转膜后检测（此步可以省略）印度墨汁染色

只用于放射性标记抗体或放射性标记A蛋白探针的Western印迹过程。2022/11/111:5350丽春红染色转膜后检测（此步可以省略）印度墨汁染色2022/1为避免作为检测试剂的特异性第一抗体与膜发生非特异性结合，使非特异性背景提高，需对膜上的潜在结合位点进行封闭处理。5%脱脂奶粉或BSA（室温孵育1h）WesternBlot膜封闭液（生物试剂公司）Tween-20的作用：减少非特异性吸附，不影响抗体与抗原的结合。（4）封闭2022/11/111:5351为避免作为检测试剂的特异性第一抗体与膜发生非特异性结合，使非③HRP/AP标记抗体与蛋白结合②漂洗和封闭YHRPHRPHRP④底物与抗体-HRP/AP反应,显色或发光底物①电泳分离,转膜,固定蛋白于膜上1)WesternBlotting直接法操作流程:（5）抗体结合及底物显色2022/11/111:5352③HRP/AP标记抗体与蛋白结合②漂洗和封闭YHRPHRPH优点：1.快速（一种抗体）2.没有二抗交叉反应引起的非特异性条带缺点：1.免疫反应性降低2.无信号二级放大3.抗体标记费时昂贵,使用不方便2022/11/111:5353优点：1.快速（一种抗体）2.没有二抗交叉反④HRP,AP标记二抗与一抗－蛋白复合物结合②漂洗和封闭YYHRPHRPHRP⑤底物与二抗-HRP,AP反应,显色或发光底物①电泳分离,转膜,固定蛋白于膜上③一抗与蛋白结合(小鼠单抗或兔多抗)2)WesternBlotting间接法操作流程:2022/11/111:5354④HRP,AP标记二抗与一抗－蛋白复合物结合②漂洗和封闭YY优点：1.免疫特异性不受标记影响2.信号放大,灵敏度高（多个二抗结合位点）3.多种标记的二抗可供选4.可选择不同的Marker缺点：1.交叉反应引起的非特异性条带2.额外的二抗孵育以及条件优化2022/11/111:5355优点：1.免疫特异性不受标记影响2.信号放大Southern

NorthernWestern样品DNARNA蛋白质限制性内切酶消化需要不需要不需要电泳琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳SDS电泳变性碱变性甲醛或戊二醛变性高温变性转移膜NC膜或尼龙膜NC膜或尼龙膜NC膜或PVDF膜紫外交联仪等固定需要需要不需要杂交标记物标记探针标记探针抗体三种印迹技术的比较2022/11/111:5356South2022/11/111:53573.简述WesternBlotting间接法操作流程。与直接法相比较，主要的差别是什么？思考题：1.

用于核酸探针标记的32P-(d)ATP主要有几种，

DNA切口平移标记法、随机引物标记法和3′或5′末端标记分别应该用哪种？为什么？2.

简述采用Biotin标记探针进行North-South杂交原理和操作流程。2022/11/920:58573.简述Weste2022/11/111:5358第四节分子印迹与杂交技术MolecularBlotting&HybridizationTechnology江黎明2013年10月2022/11/920:571第四节分子印迹与杂交技术Mo指具有一定互补序列、不同来源的核苷酸单链，在一定条件下按照碱基互补配对的原则，形成核苷酸双链的过程。核酸分子杂交(nucleicacidhybridization)印迹(blotting)指利用各种物理方法，使电泳凝胶中的生物大分子转移到硝基纤维膜等特定的支持物上，使之成为固相化分子的过程。2022/11/111:5359Marmum和Doty1961年发现的DNA变性复性现象是核酸杂交技术的理论基础。指具有一定互补序列、不同来源的核苷酸单链，在一定条件(heteroduplex)2022/11/111:5360(heteroduplex)2022/11/920:573一、印迹技术(blotting)1975年EdwenSouthern建立的DNA印迹杂交。指将电泳凝胶中的生物大分子转移(印迹)于固定化介质如硝酸纤维素膜上并加以检测分析的技术。支持物转移缓冲液纸巾玻璃板500g（1）印迹：电转移真空负压吸引转移Whatman滤纸凝胶Whatman滤纸重物NC膜或尼龙膜毛细作用转移2022/11/111:5361一、印迹技术(blotting)1975年EdwenSou

NC膜上载有的DNA单链分子就可以在杂交液中与另一种DNA或RNA分子(称为探针，可用同位素或非同位素标记)进行杂交。具有互补序列的RNA或DNA标记探针结合到存在于NC膜的DNA分子上，经放射自显影或其他检测技术就可以显现杂交分子的有无和位置。（2）杂交：（3）显示：2022/11/111:5362NC膜上载有的DNA单链分子就可以在杂交液中与另一种（1）特定基因序列的定性和定量分析核酸分子杂交应用（2）基因克隆的筛选（3）酶切图谱的制作（4）基因突变分析（5）疾病的诊断2022/11/111:5363（1）特定基因序列的定性和定量分析核酸分子杂交应用（2）基因二、探针的种类和制备探针(probe)的概念：

用来检测某一特定核苷酸序列或基因序列的DNA或RNA的互补标记片段：与待测特定核苷酸的某一段序列相互补；有明确的标志用于后续的检测。2022/11/111:5364二、探针的种类和制备探针(probe)的概念：探针的种类寡核苷酸探针基因组DNA探针cDNA探针RNA探针（一）常用探针的种类DNA探针2022/11/111:5365探针的种类寡核苷酸探针基因组DNA探针cDNA探针RNA探针1．DNA探针双链探针:单链探针从克隆在质粒载体中的特异性基因片段制备；优点则是容易制备。用化学法合成或从克隆在M13噬菌体的特异性基因片段制备；优点是在杂交反应中可以排除互补链的干扰。2022/11/111:53661．DNA探针双链探针:单链探针从克隆在质粒载体中的2．RNA探针早期采用细胞mRNA和病毒RNA作探针主要用于研究目的，而不是用于检测。如筛选HIV的基因组DNA克隆、进行中的转录分析等式。与DNA单链探针相比，RNA探针具有标记效率高、易于纯化、成本低和杂交信号强等优点标记是在细胞基因转录或病毒复制过程，效率往往不高，且受多种因素的制约。2022/11/111:53672．RNA探针早期采用细胞mRNA和病毒RNA作探针（二）核酸探针的标记根据是否使用放射性标记物可分为放射性标记和非放射性标记；根据标记物掺入情况可分为均匀标记和末端标记探针。理想标记物应备条件①不影响碱基对特异性④有较高的化学稳定性②检测方法高度特异、灵敏③标记及检测方法简单⑤环保，无损害⑥价格低廉2022/11/111:5368（二）核酸探针的标记根据是否使用放射性标记物可分为放优点缺点灵敏度和特异性极高半衰期短,随用随标1.放射性同位素标记探针对各种酶促反应无任何影响不影响碱基配对的特异性与稳定性放射性污染用于核酸探针标记的放射性同位素主要有32P、3H和35S等；32P应用最多。2022/11/111:5369优点缺点灵敏度和特异性极高半衰期短,随用随标1.放射性同位

32P的放射性较强，放射自显影所需时间较短，灵敏度高，可广泛应用于各种印迹杂交。缺点是半衰期短(14.3天)，射线散射严重，放射自显影后X胶片上的信号有时边缘不清。r-32PATPa-32PdATP**3’H2’dATP2022/11/111:537032P的放射性较强，放射自显影所需时间较短，灵敏度高当双链DNA一条链上产生切口时，E.coliDNA聚合酶Ⅰ的5’→3’聚合酶活性可将核苷酸连接到切口的3’羟基末端；同时，5’→3’的外切酶活性能从切口的5’端除去核苷酸。

最适切口平移的片段一般为50-500个核苷酸。(1)DNA切口平移(nicktranslation)

标记法在切去切口5’端核苷酸的同时又在切口的3’端补上核苷酸，可使切口沿着DNA链移动；用放射性核苷酸代替原先无放射性的核苷酸，将放射性同位素掺入到合成新链中。2022/11/111:5371核酸探针的标记方法当双链DNA一条链上产生切口时，E.coliDNADNA酶Ⅰ：在双链DNA上随机打开若干个单链缺口，产生3’-OH端。大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ：5’→3’DNA聚合酶活性；5’→3’

外切核酸酶活性。DNA切口平移标记法示意图2022/11/111:5372DNA酶Ⅰ：在双链DNA上随机打开若干个单链缺口，产生3’-使寡核苷酸随机引物与DNA模板结合，在Klenow酶的作用下，合成DNA探针。合成产物的大小、产量、比活性依赖于反应中模板、引物、dNTP和酶的量。通常，产物平均长度为400-600个核苷酸。(2)DNA随机引物标记法2022/11/111:5373使寡核苷酸随机引物与DNA模板结合，在Klenow酶随机引物：含有各种可能排列顺序的寡核苷酸片段的混合物。46=4096DNA聚合酶ⅠKlenow片段：保留5’→3’DNA聚合酶活性,弱3’→5’外切酶活性，无5’→3’外切酶活性。DNA随机引物标记法示意图2022/11/111:5374随机引物：含有各种可能排列顺序的寡核苷酸片段的混合物。46=优点：Klenow片段没有5’→3’外切酶活性，反应稳定，可以获得大量的有效探针；对模板的要求不严格，用微量制备的质粒DNA模板也可进行反应；产物的比活性较高，可达4×109cpm/μg探针；随机引物反应还可在低熔点琼脂糖中直接进行。2022/11/111:5375优点：Klenow片段没有5’→3’外切酶活性，反应稳定，可5′3′3′5′完整双链DNA限制性内切酶5′3′3′5′[α-32P]-dNTP其他3种dNTPKlenowDNA聚合酶5′3′3′5′变性5′3′3′5′5′末端突出的DNA3′末端标记的DNA32P-末端标记的单链DNA探针1)DNA的3′末端标记(3)DNA的末端标记2022/11/111:53765′3′3′5′完整双链DNA限制性内切酶5′3条件是有5’-OH存在，人工合成寡核苷酸最常用；双链DNA需用碱性磷酸酶切除5’-P后再标记5′pCpGpTpA……3′5′HO-CpGpTpA……3′T4噬菌体多核苷酸激酶[γ-32P]-ATP5′32p-O-CpGpTpA……3′37℃，反应10min,γ-32P-ATP需150μci/反应2)DNA的5′末端标记碱性磷酸酶2022/11/111:5377条件是有5’-OH存在，人工合成寡核苷酸最常用；双链标记探针的纯化凝胶过滤层析常用的凝胶基质：SephadexG-50、Bio-GelP-60选择性沉淀乙醇存在，醋酸铵可起此作用。2022/11/111:5378标记探针的纯化凝胶过滤层析常用的凝胶基质：Sepha核酸探针的标记方法(1)DNA切口平移标记法(2)DNA随机引物标记法(7)RNA探针的标记(3)DNA的末端标记(4)cDNA探针的标记(5)寡核苷酸探针的标记(6)单链DNA探针的标记2022/11/111:5379核酸探针的标记方法(1)DNA切口平移标记法(2)DNA2.非放射性标记物优点缺点灵敏度较放射性同位素标记低无放射性污染用于核酸探针标记的非放射性标记物主要有生物素、地高辛和荧光素(FITC、罗丹明)等。稳定性好,可较长时间存放特异性较放射性同位素标记低2022/11/111:53802.非放射性标记物优点缺点灵敏度较放射性同位素标记低无放射2022/11/111:5381ThemethodusedtoproducenonradioactiveDNAmoleculesthatcarryaspecificchemicalmarkerthatcanbedetectedwithanappropriateantibody.biotin-avidinsystemDig-dUTP2022/11/920:5824Themethod④HRP/AP标记抗体与Dig结合②漂洗和封闭YHRPHRPHRP⑤底物与抗体-HRP/AP反应,显色或发光底物①

电泳,转膜，紫外交联固定D││D

North-South杂交原理和操作流程(地高辛标记)③杂交：Dig标记的探针与靶DNA结合2022/11/111:5382④HRP/AP标记抗体与Dig结合②漂洗和封闭YHRPHRP别名：VitaminH分子量：244.31水溶性好关于生物素结合对象：亲和素Avidin链亲和素Streptavidin中性亲和素NeutrAvidin单体亲和素MonoAvidin

2022/11/111:5383别名：VitaminH关于生物素结合对象：亲和素Avidi

North-South杂交原理和操作流程(Biotin标记)③杂交：生物素标记的探针与靶DNA结合⑤底物在HRP催化下,反应发光②洗膜封闭①电泳,转膜，紫外交联固定SAHRP底物B││B④HRP标记的链亲和素与探针上的生物素结合2022/11/111:5384North-South杂交原理和操作流程(Biotin标1.曝光：用滤纸吸去杂交膜上多余底物，作好标记，

保鲜膜包裹，放在暗夹里，放上X光片，曝光1-5

分钟；2.显影：取出X光片，按使用说明书显影和定影。后继的化学发光检测

Luminol化学发光原理2022/11/111:5385思考题：1.曝光：用滤纸吸去杂交膜上多余底物，作好标记，2.显影：取三、印迹技术的种类和用途（一）DNA印迹杂交技术（二）RNA印迹杂交技术（四）蛋白质印迹杂交技术（三）其它核酸印迹杂交技术2022/11/111:5386三、印迹技术的种类和用途（一）DNA印迹杂交技术（二）RNA（一）Southern印迹杂交

Southern印迹杂交（Southernblotting）是指DNA与DNA分子之间的杂交。基本过程:

将琼脂糖凝胶电泳分离的待测DNA片段变性，再将凝胶中的DNA分子转移到硝基纤维膜等固相支持物上，然后用标记的探针检测待测的DNA。可用于基因组DNA的定性与定量分析，重组质粒和噬菌体的分析等。2022/11/111:5387（一）Southern印迹杂交Southern印迹杂Southern印迹杂交的基本步骤:

①待测DNA样品的限制性内切酶消化②酶切DNA样品的电泳分离③凝胶中DNA的变性和Southern转移④探针的制备⑤Southern杂交⑥杂交结果的检测2022/11/111:5388Southern印迹杂交的基本步骤:①待测DNA样品的限2022/11/111:53892022/11/920:5832（二）Northern印迹杂交

利用类似于Southern印迹杂交的技术来检测RNA称为Northern印迹杂交（Northernblotting）。原理和过程与Southern印迹基本相同，只是检测的分子是RNA，可用来对组织或细胞中的mRNA进行定性或定量分析。2022/11/111:5390（二）Northern印迹杂交利用类似于SoutheNorthern与Southernblotting的异同点相同点：原理均为毛细作用用途：检测组织或细胞中已知的特异mRNA的表达水平；比较不同组织和细胞的同一基因的表达情况。不同点：转移的是RNA转移前无需酶切转移效率较高变性方法:DNA(碱变性）

RNA（甲醛、乙二醛等）2022/11/111:5391Northern与Southernblotting的异同将菌落或噬菌斑影印在尼龙膜上(以前用硝酸纤维膜)，这种膜只吸附单链DNA；用NaOH处理，这样不仅可以杀死细菌，同时可使DNA变性吸附在膜上；用无关的单链DNA，如小牛胸腺DNA和鲑鱼精子DNA预杂交。膜经中和后再将标记探针和膜放在缓冲溶液中缓缓复性，经放射自显影来确定阳性菌落。3.膜上分子杂交*方法：2022/11/111:5392（三）其他核酸杂交方法将菌落或噬菌斑影印在尼龙膜上(以前用硝酸纤维膜)，这（1）菌落杂交法colonyhybridizationmethod对分散在若干个琼脂平板上的少数菌落(~200)

进行克隆筛选时，可采用本方法。将这些菌落归并到一个琼脂主平板，第二个琼

脂平板表面铺一张硝酸纤维素滤膜。经培养一

段时间后，对菌落进行原位裂解。主平板应贮存于4℃直至得到筛选结果。2022/11/111:5393（1）菌落杂交法colonyhybridization2022/11/111:5394Screeningagenomiclibrarybycolonyhybridization.2022/11/920:5837Screeningag（2）噬菌斑杂交法plaquebybridization噬菌体为载体进行DNA克隆繁殖时所常用的方法。将在琼脂培养基上形成的噬菌体的噬菌斑，移于

硝酸纤维素滤纸上，碱处理使噬菌体DNA变性；DNA固定于硝酸纤维素滤纸上，与用放射性同位

素标记的特定的RNA或DNA片段进行杂交；通过放射自显影法来识别含有所需DNA序列的噬

菌体的噬菌斑，并从原来的琼脂培养基中选出与

其对应的噬菌斑2022/11/111:5395（2）噬菌斑杂交法plaquebybridization限制酶切位点限制酶消化除去中间片段cosLRcoscosL左臂Rcos右臂真核生物染色体DNA限制酶部分消化外源DNA与载体DNA混合连接反应体外包装用重组噬菌体感染大肠杆菌~20KbDNA片段cosLRcos~20Kb外源DNA片段gDNA文库EMBL3/4系列(置换型，适用于基因组DNA文库构建)11/11/20221:53AM96限制酶切位点限制酶消化除去中间片段cosLRcosc2022/11/111:53972022/11/920:5840（四）蛋白质印迹技术(Westernblotting)

根据蛋白质分子之间存在相互作用的特点，将蛋白质电泳分离，然后将其转移和固定于固体支持物（NC膜或其它膜）上，再用相应的蛋白质分子（最常用的是抗体）对其进行检测。因此，被称为免疫印迹（immunoblotting）技术。

用Westernblotting检测样品中存在特异蛋白质用于细胞中特异蛋白质的定量分析用于蛋白质分子的相互作用研究2022/11/111:5398（四）蛋白质印迹技术(Westernblotting)(1)蛋白样品的制备WesternBlot流程(2)SDS(3)转膜(4)封闭(5)抗体杂交及

底物显色(1)蛋白样品的制备WesternBlot流程(2)S（1）蛋白样品的制备总蛋白制备水溶液提取法：大多数蛋白质在稀盐和缓冲液中稳定性好、溶解度大；故稀盐和缓冲液是提取蛋白质最常用的溶剂。有机溶剂提取法：对于分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有机溶剂提取，包括乙醇和丙酮。通过层析或电洗脱法制备目的蛋白。2022/11/111:53100（1）蛋白样品的制备总蛋白制备水溶液提取法：大多数蛋白质在稀蛋白样品的定量目前常用比色法测定样品蛋白的含量：Bradford法（考马斯亮蓝法）Lowry法（Folin-酚试剂法）BCA法（二喹啉甲酸）等。各有优缺点，可以根据具体情况选取。按相应说明操作，测定样品浓度。蛋白样品的定量目前常用比色法测定样品蛋白的含量：Bradfo蛋白样品的变性1MTris-HCl(pH6.8)10ml1MDTT20mlSDS4g甘油20ml溴酚蓝0.2g总体积100ml100mMTris-HCl(pH6.8)200mMDTT4%SDS20%甘油0.2%溴酚兰ddH2O2×SDS上样缓冲液：按1:1与蛋白质样品混合，95-100℃加热5-15min，冰上冷却后，上样20-25μl，总蛋白量20-50μg。2022/11/111:53102蛋白样品的变性1MTris-HCl(pH6.8)10mlStakinggelSep