基因个体化治疗汇总课件

个体化药学服务与基因相关概念个体化药学服务与基因相关概念1人类基因组计划1990年正式启动人类基因组测序计划,2003年完成。

识别人类基因组的所有大约3万个DNA测定组成人类基因组DNA的约30亿对核苷酸的序列人类基因组计划1990年正式启动人类基因组测序计划,2002个体化用药—主要潮流，大势所趋WHO：2000年提出，21世纪步入“3P”时代—预防（preventive），预测（predictable)和个体化（personal）美国FDA：2006全美3600万份用药记录中，880万份（24.3%）使用了说明书中有基因组生物标记信息的药物。FDA：2013.12，已经批准超过200个需要患者基因信息指导才能准确治疗的药物，涉及约40%的患者。三甲评审标准要求：进行个体化给药方案的研究与监测个体化用药—主要潮流，大势所趋WHO：2000年提出，21世3Wewouldn’tthinkofbuyingshoesinasinglesize

我们不会愿意买只有一个尺码的皮鞋Sowhyshouldwebesatisfiedwithone-size-fits-allmedicine?那为什么我们就满足于千人一方呢？Wewouldn’tthinkofbuyingsh4据世界卫生组织的最新统计，各国住院病人发生药品不良反应的比率在10%至20%，其中5%的患者会因为严重的药品不良反应而死亡。目前全世界死亡的病人中，约有1/3的患者死于用药不当，药品不良反应致死占社会人口死因的第4位。药物毒性或不良反应的发生往往是因为药物反应的个体差异所致；个体差异使药品的效果差异显著。个体化药学服务的必要性据世界卫生组织的最新统计，各国住院病人发生药品不良反应的比率5个体化药学临床应用的意义降低医疗事故发生率缩短平均住院日提高医院收入为临床用药提供更精确的指导（精准剂量,减少不良反应，药物相互作用等）个体化药学临床应用的意义降低医疗事故发生率6疗效好疗效不好或无疗效毒副反应药物反应的个体差异相同药物治疗的一组人群基因?环境?药物不良反应药物效应疗效好疗效不好或无疗效毒副反应药物反应的个体差异相同药物治疗7据世界卫生组织的最新统计，各国住院病人发生药品不良反应的比率在10%至20%，其中5%的患者会因为严重的药品不良反应而死亡。目前全世界死亡的病人中，约有1/3的患者死于用药不当，药品不良反应致死占社会人口死因的第4位。药物毒性或不良反应的发生往往是因为药物反应的个体差异所致；个体差异使药品的效果差异显著。个体化药学服务的必要性据世界卫生组织的最新统计，各国住院病人发生药品不良反应的比率8相关药物的剂量范围各类常用药物的有效率常用药物的有效率与剂量相关药物的剂量范围各类常用药物的有效率常用药物的有效率与剂量90%10%20%30%40%50%60%70%80%90%100%基因环境因素II糖尿病乳腺癌男性心肌梗死原发性高血压病冠心病I糖尿病苯妥英锂水扬酸异戊巴比妥双香豆素阿司匹林安替匹林保泰松遗传和非遗传因素在药物代谢中的作用药物代谢及疾病，遗传与非遗传的影响0%10%20%30%40%50%60%70%80%90%110新的医学模式:个体化治疗（PersonalizedTherapy）根据分子诊断提出治疗方案诊断分子诊断-预测反应治疗理想反应药理学+基因组学新的医学模式:诊断分子诊断-预测反应治疗理想反应11基因个体化治疗汇总课件12基因个体化治疗汇总课件13基因个体化治疗汇总课件14基因是载有特定生物遗传信息的DNA分子片断，人类基因包括两大区域:1.编码区(占5%);2.侧翼序列基因是载有特定生物遗传信息的DNA分子片断，人类基因包括两大15

DNA分子是由腺嘌呤（A）、胞嘧啶(C）、鸟嘌呤（G）、胸腺嘧啶（T，DNA专有）和尿嘧啶（U，RNA专有）碱基排列组成,每个人都存在差异，将其称为多态性。人类的基因发现几百万由单一的碱基变换而形成的位点既SNP，它意味着个人间最小的遗传差异。

A:腺嘌呤T:胸嘧啶G:鸟嘌呤C:胞嘧啶CGTTCTCTATTAACA……GCAAGAGATAATTGT……CGTGCTCTATTAACA……GCACGAGATAATTGT……药物相关基因研究A:腺嘌呤CGTTCTCTATTAACA……CGTGCTC1610q24.2Chromosome10CYP2C9gene9Exon55kb490AA10q24.2CGTASNPCYP2C9*1NormalenzymaticactivityGAGGACCGTGTTCAAGluAspArgValGln5’3’CYP2C9*2NoenzymaticactivityT430C>T(Arg144Cys)Cys单核苷酸多态性（SNP）导致人类遗传易感性的重要因素导致人类药物代谢和反应差异的重要因素GT突变野生型突变型10q24.2Chromosome10CYP2C9gen17变态反应药动学代谢吸收、分布、排泄药效学靶向结合作用免疫系统毒副作用治疗作用药物耐受药物代谢酶药物转运蛋白药物靶蛋白、受体人类白血球抗原药物作用基因与药物作用的关系原理基因蛋白合成举例：抗癫痫药丙戊酸钠的相关代谢酶——CYP2C19其基因最主要的两个突变位点

CYP2C19*2:第5外显子681位G→ACYP2C19*3:第4外显子636位G→A产生终止密码，过早终止蛋白合成，产生无活性CYP2C19酶，降低对丙戊酸代谢，使其在体内蓄积，发生毒副反应18变态反应药动学药效学毒副作用药物代谢酶药物转运蛋白...CCATTGAC......CCATTGAC...…GGTAACTG...…GGTAACTG......CCATTGAC......CCGTTGAC...…GGTAACTG...…GGCAACTG......CCGTTGAC......CCGTTGAC...…GGCAACTG...…GGCAACTG...A/A野生型纯合子单核苷酸多态性形成三种基因型和表型XXXA/a野生型杂合子a/a突变纯合子高活性中活性低活性...CCATTGAC......CCA19GCCCACCTCGCCCGCCTC甲病人乙病人WildtypeMutationWildtypeConcentrationMutationConcentrationTimeTimeCYP450CYP450

相同的剂量不同的血浆浓度P450酶活性与PD/PK值的关系GCCCACCTCGCCCGCCTC甲病人乙病人Wildt20吸收-慢

-快受体-缺失-丰富代谢

-慢速-中等-快速-超快速排泄

-缓慢-正常药物体内过程)吸收药物代谢酶药物转运分布药物转运代谢药物代谢酶排泄药物转运药物相关基因研究吸收受体代谢排泄21CYP450

主要存在于肝微粒体中,它的活性决定药物的代谢速率,与药物的清除率有着直接关系。CYP450酶系的基因主要有CYP1,CYP2,CYP3三家族,有以下几种重要的P450酶:CYP1A2、CYP2A6、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1、CYP3A4。药物代谢酶CYP450主要存在于肝微粒体中,它的活性决定药物的代22根据CYP2D6基因型调整抗抑郁药剂量3839米帕明多虑平马普替林曲米帕明地昔帕明去甲替林氯米帕明帕罗西丁文拉法辛阿米替林米安色林PMIMEMUM18213217480301288138174129928113217941811259811915292118138747593115135941161327084110130641159360148170523838%平均剂量根据CYP2D6基因型调整抗抑郁药剂量3839米帕明多虑平马23关于CYP2D6的表型判断举例：关于CYP2D6的表型判断，CYP2D6属于细胞色素P450酶常见药物代谢酶基因型及表型判断举例：关于CYP2D6的表型判断，CYP2D6属于细胞色素P24Β1受体基因突变药物计量调整Β1受体基因突变药物计量调整25

美托洛尔，根据CYP2D6基因调整剂量26美托洛尔，根据CYP2D6基因调整剂量26高血脂药物及硝酸甘油高血脂药物及硝酸甘油27雌激素与儿童智商相关基因雌激素与儿童智商相关基因28【英国《每日邮报》网站3月23日报道】科学家发现了一种会增加儿童智商低下风险的基因。这个发现意味着，在新生儿出生后不久对其进行一项基因检测，可能会有助于发现存在上述问题的婴儿，甚至为应对这一问题确定治疗方案做好准备。科学家认识到，如果7岁以下儿童在体内出现一种常见基因变异体的同时，甲状腺激素水平也出现下降，那么他们的智商变得异常低下的可能性将为其他儿童的4倍。每年约有4%的新生儿带有这种基因，而且体内的甲状腺激素水平较低。给这些儿童服用含有甲状腺激素的药片，或许可以帮助其大脑正常发育并达到正常水平的智商。每年将会有3万名儿童因此受益。这项新研究的关注重点是与细胞内甲状腺激素的产生有关的Ⅱ型脱碘酶。研究人员此前已将这种酶的基因突变与包括糖尿病和高血压在内的其他健康问题联系在一起。在上述新研究中，加的夫大学和布里斯托尔大学的科学家对3123名7岁以下儿童的基因数据进行了分析。这些儿童也接受了智商测试。体内甲状腺激素水平较低且存在Ⅱ型脱碘酶变异体的那些儿童，智商低于85的可能性是其他儿童的4倍。而仅存在甲状腺激素水平较低问题的儿童不会面临更多智商低下的风险。加的夫大学的皮特·泰勒博士说：“如果其他研究证实了我们的科研成果，那么，除了常规的新生儿甲状腺激素筛查外，同时进行针对这种基因变异体的测试，将有助于识别出今后最有可能变得智商低下的那些儿童。”相关研究结果是在于利物浦召开的英国内分泌协会大会上发布的。

儿童DIO2基因突变导致智商低下的研究【英国《每日邮报》网站3月23日报道】科学家发现了一种会增加29在上述新研究中，加的夫大学和布里斯托尔大学的科学家对3123名7岁以下儿童的基因数据进行了分析。这些儿童也接受了智商测试。体内甲状腺激素水平较低且存在Ⅱ型脱碘酶变异体的那些儿童，智商低于85的可能性是其他儿童的4倍。而仅存在甲状腺激素水平较低问题的儿童不会面临更多智商低下的风险。加的夫大学的皮特·泰勒博士说：“如果其他研究证实了我们的科研成果，那么，除了常规的新生儿甲状腺激素筛查外，同时进行针对这种基因变异体的测试，将有助于识别出今后最有可能变得智商低下的那些儿童。”相关研究结果是在于利物浦召开的英国内分泌协会大会上发布的。

儿童DIO2基因突变导致智商低下的研究在上述新研究中，加的夫大学和布里斯托尔大学的科学家对312330本世纪，肿瘤的药物治疗取得了巨大成就。但肿瘤细胞的多药耐药性和肿瘤药物治疗的个体差异常造成肿瘤化疗的失败，且引起严重的毒副反应。个体药物治疗的药效和毒性的差异在很大程度上受到遗传因素如药物代谢酶、药物转运蛋白和药物作用靶点等药物相关基因的遗传多态性的影响。所以抗恶性肿瘤药临床有效率为30-80%肿瘤个体化治疗与基因检测本世纪，肿瘤的药物治疗取得了巨大成就。但肿瘤细胞的多药耐药性31根据病人的遗传特征,选择最有效的疾病治疗方法，更好地控制疾病的进展甚至预防疾病的发生，实现最佳的医学治疗效果。

在合适的时间(RightTime)给合适的病人(RightPatient)施行合适的治疗(RightTreatment),达到肿瘤个体化治疗肿瘤个体化治疗与基因检测根据病人的遗传特征,选择最有效的疾病治疗方法，更好地控制32肿瘤个体化治疗包括靶向治疗和化疗两部分:靶向治疗:通过实时定量、基因测序、FISH等技术检测肿瘤患者基因拷贝及基因突变信息，根据检测结果进行靶向治疗。个体化化疗：通过实时定量、基因分型、mRNA定量等技术，检测患者肿瘤标本或血液标本的mRNA表达、DNA的SNP分型，确定患者对化疗药物的敏感性和毒性反应并确定化疗剂量。肿瘤个体化治疗与基因检测肿瘤个体化治疗包括靶向治疗和化疗两部分:肿瘤个体化治疗与基因33肿瘤细胞基因表达与化疗药物肿瘤细胞基因表达与化疗药物34突变基因与化疗药物突变基因与化疗药物35肿瘤化疗疗效及毒副作用基因检测肿瘤化疗疗效及毒副作用基因检测36果因PPT工作室/guoyinppt原位杂交技术

2014-03-19果因PPT工作室/guoyinppt原37原位杂交技术一原位杂交技术的历史发展二原位杂交技术的原理及分类三原位杂交技术的一般过程四原位杂交技术的应用原位杂交技术一原位杂交技术的历史发展二原位杂交技术38一、原位杂交技术的历史发展

原位杂交技术(Insituhybridization，ISH)是分子生物学、组织化学及细胞学相结合而产生的一门新兴技术，始于20世纪60年代。1969年美国耶鲁大学的Gall等首先用爪蟾核糖体基因探针与其卵母细胞杂交，将该基因进行定位，与此同时Buongiorno—Nardelli和Amaldi等(1970)相继利用同位素标记核酸探针进行了细胞或组织的基因定位，从而创造了原位杂交技术。自此以后，由于分子生物学技术的迅猛发展，特别是20世纪70年代末到80年代初，分子克隆、质粒和噬菌体DNA的构建成功，为原位杂交技术的发展奠定了深厚的技术基础。

一、原位杂交技术的历史发展原位杂交技术(Insit39二、原位杂交技术的原理及分类概念：原位杂交技术(Insituhybridization，ISH)是用标记的核酸探针，经放射自显影或非放射检测体系，在组织，细胞、间期核及染色体上对核酸进行定位和相对定量研究的一种手段。原理：利用核酸分子单链之间有互补的碱基序列，将有放射性或非放射性的外源核酸(即探针)与组织、细胞或染色体上待测DNA或RNA互补配对，结合成专一的核酸杂交分子，经一定的检测手段将待测核酸在组织、细胞或染色体上的位置显示出来。二、原位杂交技术的原理及分类概念：原位杂交技术(Ins40原位杂交法分类1、基因组原位杂交技术基因组原位杂交(GISH)技术是20世纪80年代末发展起来的一种原位杂交技术。它主要是利用物种之间DNA同源性的差异，用另一物种的基因组DNA以适当的浓度作封阻，在靶染色体上进行原位杂交。

2、荧光原位杂交技术荧光原位杂交(FISH)技术是在已有的放射性

原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放

射性DNA分子原位杂交技术。它利用荧光标记

的核酸片段为探针，与染色体上或DNA显微切

片上的特异性杂交，通过荧光检测系

统(荧光显微镜)检测信号DNA序列在染色体或

DNA显微切片上的目的DNA序列，进而确定其杂

交位点。原位杂交法分类1、基因组原位杂交技术413、多彩色荧光原位杂交技术多彩色荧光原位杂交(mFISH)是在荧

光原位杂交技术的基础上发展起来的

一种新技术，它用几种不同颜色的荧

光素单独或混合标记的探针进行原位

杂交，能同时检测多个靶位，各靶位

在荧光显微镜下和照片上的颜色不同，

呈现多种色彩。4、原位PCR原位PCR技术是常规的原位杂交技术与PCR技术的有机结合，即通过PCR技术对靶核酸序列在染色体上或组织细胞内进行原位扩增使其拷贝数增加，然后通过原位杂交技术进行检测，从而对靶核酸序列进行定性、定位和定量分析。原位杂交法分类3、多彩色荧光原位杂交技术原位杂交法分类42三、原位杂交技术的一般过程以经过标记的已知核酸分子为探针以细胞内与探针序列互补的特异核酸分子为靶分子在一定条件下使探针与靶核酸分子在原位发生杂交再对其探测三、原位杂交技术的一般过程以经过标记的已知核酸分子为探针43探针标记靶核酸分子杂交检测探针标记靶核酸分子杂交检测44一）、探针

是含有互补顺序的外源性被标记的DNA或RNA片段，是在原位杂交中用于检测细胞内特定DNA或RNA顺序定位的特殊试剂，探针的碱基序列是已知的，只能与特定的核酸分子结合上1、cDNA2、RNA3、寡核苷酸一）、探针是含有互补顺序的外源性被标记的DNA或RNA片451、cDNA(complementaryDNA)互补于mRNA的DNA分子（长度为数百-数千碱基对）⑴克隆于质粒中，可以无限繁殖，取之不尽⑵较稳定，不易被降解⑶标记方法可靠易行优点1、cDNA互补于mRNA的DNA分子⑴克隆于质粒中46优点：⑴杂交效率比DNA探针高

⑵在检测mRNA时所形成的RNA-mRNA杂交体比DNA-mRNA杂交体稳定

⑶可以同时得到同义RNA链和反义RNA链缺点：2、RNA

RNA是单链分子（探针长度50-300碱基对）容易受RNA酶的污染而被降解优点：2、RNARNA是单链分子容易受47

这类探针是根据靶分子而设计序列在DNA合成仪上用化学方法合成

优点：形成杂交体快速（序列短链，杂交时易于穿透）

缺点：特异性较低（短链和简单）短链探针(长度10-50个核苷酸)3、寡核苷酸这类探针是根据靶分子而设计序列短链探针3、寡核48

二）、探针标记1、标记物

（1）放射性标记物

（2）非放射性标记物2、标记方法

（1）DNA探针标记

（2）RNA探针标记

（3）寡核苷酸探针标记

二）、探针标记1、标记物（1）放射性标记物491、标记物①高度灵敏性；②标记物与核酸探针结合，应绝对不能影响核酸探针与模板的结合能力及结合的特异性；③当用酶促方法进行标记时，应对酶促活性（Km值）无多大影响，以保证标记反应的效率和标记产物的比活性；④高度特异性；⑤较高的化学稳定性，保存时间长，标记及检测方法简单；⑥对环境无污染，对人体无损伤；⑦价格低廉等。1、标记物①高度灵敏性；50标记物分类放射性标记物：同位素35S、33P、32P和3H等非放射性标记物：荧光素生物素地高辛

溴脱氧尿嘧啶等标记分子：某种单核苷酸在单核苷酸分子中导入某个原子、功能基团或侧链分子作为标记物，对碱基配对不造成影响标记物分类放射性标记物：同位素35S、33P、32P和51标记分子：放射性标记分子：

35S-UTP35S-dATP

35S-dCTP

32P-UTP32P-dATP等等非放射性标记分子：

四甲基罗达明-UTP

生物素-UTP(Bio-UTP)

地高辛-dUTP(Dig-dUTP)

溴脱氧尿嘧啶本身为标记分子标记分子：522、标记方法（1）DNA探针标记

切口移位法随机引物法（2）RNA探针标记

在体外转录技术中与探针制备同时完成（3）寡核苷酸探针标记

末端转移法将放射性或非放射性的标记分子在各种酶促反应中参入探针分子2、标记方法（1）DNA探针标记将放射性或非放射性的标记分子53切口平移法切口平移法54随机引物法随机引物法55

三）、靶核酸分子靶分子（或靶序列）：指所要探测的核酸分子或核苷酸序列（DNA或RNA）

DNA——可以是中期染色体上的或是间期细胞核内的，也可以是线粒体DNA或病毒DNARNA——可以是编码细胞合成的任何蛋白质分子的mRNA，也可以是核糖体rRNA线粒体或病毒RNA三）、靶核酸分子靶分子（或靶序列）：56四）、杂交

1.杂交体

2.杂交条件

3.严格度的概念四）、杂交571、杂交体hybrids

DNA-DNADNA-RNARNA-RNA稳定性依次是：DNA-DNA＜DNA-RNA＜RNA-RNA1、杂交体hybrids58DNA-DNA杂交双链分子变性复性DNA-DNA变性复性592、杂交条件（1）杂交液（2）探针浓度（3）温度（4）pH（5）时间（1）、杂交液

①钠盐（杂交效率↑非特异反应↓）②甲酰胺（使杂交所需温度降低裂解红细胞）

③硫酸葡聚糖（提高探针浓度）

④牛血清白蛋白和载体DNA等（阻断探针与组织非特异结合，↓背景）2、杂交条件（1）杂交液（2）探针浓度（3）温度（4）pH60杂交条件

（2）、探针浓度

探针浓度影响杂交反应的速度

放射性标记探针0.5μg/ml非放射性为2μg/ml最适宜的探针浓度要经实验摸索得到确定（1）杂交液（2）探针浓度（3）温度（4）pH（5）时间杂交条件

（1）杂交液（2）探针浓度（3）温度（4）pH61杂交条件（3）、温度杂交时温度一般低于相应杂交体的Tm值25℃Tm值：是核酸的融解温度，是一半双链分子解链时的温度）

当杂交液含50%甲酰胺、盐浓度0.75mol/L左右时杂交温度：对DNA探针是42℃对RNA探针是50-55℃对寡核苷酸探针是37℃1）杂交液（2）探针浓度（3）温度（4）pH（5）时间杂交条件1）杂交液（2）探针浓度（3）温度（4）pH（562杂交条件（4）、PH

pH在5-9范围内，杂交体形成不受影响

常用缓冲液pH为6.5-7.5（5）、时间一般探针浓度下，杂交反应在4-6小时内完成孵育6小时后-杂交信号不再增强反应超过24小时后-已形成的杂交体可能发生解链，杂交信号反而减弱（1）杂交液（2）探针浓度（3）温度（4）pH（5）时间杂交条件（1）杂交液（2）探针浓度（3）温度（4）pH（63五）、杂交体的探测使标记的杂交体在光镜或电镜下可见（一）放射自显影方法（二）免疫细胞化学方法五）、杂交体的探测64（一）、放射自显影方法方法：切片上涂覆核子乳胶膜

置于暗盒中于4℃干燥处自显影

经显影和定影后在显微镜下观察银粒

在细胞和细胞器的分布情况用同位素标记探针来显示杂交反应的方法（一）、放射自显影方法用同位素标记探针来显示杂交反应的方法65基因个体化治疗汇总课件66（二）、免疫细胞化学方法报告分子（reportermolecules）在杂交后探测技术中，为显

示探针标记物而使用的免疫细胞

化学标记物常被叫做报告分子即与抗体（或亲和素、A蛋白、）联结，最终在显微镜下可见的分子：荧光素胶体金酶—-过氧化物酶-H2O2和DAB碱性磷酸酶-NBT/BCIP※用地高辛标记的探针用荧光素、胶体金、酶标记抗地高辛抗体来显示依据免疫细胞化学原理用直接法或间接法来显示探针标记物（二）、免疫细胞化学方法报告分子（reportermole67四、原位杂交技术的应用细胞特异mRNA转录的定位，用于基因图谱、基因表达和基因组进化的研究。感染组织中病毒DNA/RNA的检测和定位。癌基因、抑癌基因和各种功能基因在转录水平的表达和变化的检测。基因在染色体上的定位和检测染色体序列确定染色体核型。间期细胞遗传学的研究疾病的基因变化的研究四、原位杂交技术的应用细胞特异mRNA转录的定位，用于基因图68探针杂交采集标本提取基因组DNA/RNAPCR扩增显色/扫描电泳检测纯化PCR产物基因芯片焦磷酸测序双脱氧标记毛细管电泳焦磷酸测序双脱氧测序RT-PCR实时荧光PCR采集标本标本预处理杂交测序个体化药学服务平台出现污染的高风险环节低风险环节探针杂交采集标本提取基因组PCR扩增显色/扫描电泳检测纯化P69thanksthanks70个体化药学服务与基因相关概念个体化药学服务与基因相关概念71人类基因组计划1990年正式启动人类基因组测序计划,2003年完成。

识别人类基因组的所有大约3万个DNA测定组成人类基因组DNA的约30亿对核苷酸的序列人类基因组计划1990年正式启动人类基因组测序计划,20072个体化用药—主要潮流，大势所趋WHO：2000年提出，21世纪步入“3P”时代—预防（preventive），预测（predictable)和个体化（personal）美国FDA：2006全美3600万份用药记录中，880万份（24.3%）使用了说明书中有基因组生物标记信息的药物。FDA：2013.12，已经批准超过200个需要患者基因信息指导才能准确治疗的药物，涉及约40%的患者。三甲评审标准要求：进行个体化给药方案的研究与监测个体化用药—主要潮流，大势所趋WHO：2000年提出，21世73Wewouldn’tthinkofbuyingshoesinasinglesize

我们不会愿意买只有一个尺码的皮鞋Sowhyshouldwebesatisfiedwithone-size-fits-allmedicine?那为什么我们就满足于千人一方呢？Wewouldn’tthinkofbuyingsh74据世界卫生组织的最新统计，各国住院病人发生药品不良反应的比率在10%至20%，其中5%的患者会因为严重的药品不良反应而死亡。目前全世界死亡的病人中，约有1/3的患者死于用药不当，药品不良反应致死占社会人口死因的第4位。药物毒性或不良反应的发生往往是因为药物反应的个体差异所致；个体差异使药品的效果差异显著。个体化药学服务的必要性据世界卫生组织的最新统计，各国住院病人发生药品不良反应的比率75个体化药学临床应用的意义降低医疗事故发生率缩短平均住院日提高医院收入为临床用药提供更精确的指导（精准剂量,减少不良反应，药物相互作用等）个体化药学临床应用的意义降低医疗事故发生率76疗效好疗效不好或无疗效毒副反应药物反应的个体差异相同药物治疗的一组人群基因?环境?药物不良反应药物效应疗效好疗效不好或无疗效毒副反应药物反应的个体差异相同药物治疗77据世界卫生组织的最新统计，各国住院病人发生药品不良反应的比率在10%至20%，其中5%的患者会因为严重的药品不良反应而死亡。目前全世界死亡的病人中，约有1/3的患者死于用药不当，药品不良反应致死占社会人口死因的第4位。药物毒性或不良反应的发生往往是因为药物反应的个体差异所致；个体差异使药品的效果差异显著。个体化药学服务的必要性据世界卫生组织的最新统计，各国住院病人发生药品不良反应的比率78相关药物的剂量范围各类常用药物的有效率常用药物的有效率与剂量相关药物的剂量范围各类常用药物的有效率常用药物的有效率与剂量790%10%20%30%40%50%60%70%80%90%100%基因环境因素II糖尿病乳腺癌男性心肌梗死原发性高血压病冠心病I糖尿病苯妥英锂水扬酸异戊巴比妥双香豆素阿司匹林安替匹林保泰松遗传和非遗传因素在药物代谢中的作用药物代谢及疾病，遗传与非遗传的影响0%10%20%30%40%50%60%70%80%90%180新的医学模式:个体化治疗（PersonalizedTherapy）根据分子诊断提出治疗方案诊断分子诊断-预测反应治疗理想反应药理学+基因组学新的医学模式:诊断分子诊断-预测反应治疗理想反应81基因个体化治疗汇总课件82基因个体化治疗汇总课件83基因个体化治疗汇总课件84基因是载有特定生物遗传信息的DNA分子片断，人类基因包括两大区域:1.编码区(占5%);2.侧翼序列基因是载有特定生物遗传信息的DNA分子片断，人类基因包括两大85

DNA分子是由腺嘌呤（A）、胞嘧啶(C）、鸟嘌呤（G）、胸腺嘧啶（T，DNA专有）和尿嘧啶（U，RNA专有）碱基排列组成,每个人都存在差异，将其称为多态性。人类的基因发现几百万由单一的碱基变换而形成的位点既SNP，它意味着个人间最小的遗传差异。

A:腺嘌呤T:胸嘧啶G:鸟嘌呤C:胞嘧啶CGTTCTCTATTAACA……GCAAGAGATAATTGT……CGTGCTCTATTAACA……GCACGAGATAATTGT……药物相关基因研究A:腺嘌呤CGTTCTCTATTAACA……CGTGCTC8610q24.2Chromosome10CYP2C9gene9Exon55kb490AA10q24.2CGTASNPCYP2C9*1NormalenzymaticactivityGAGGACCGTGTTCAAGluAspArgValGln5’3’CYP2C9*2NoenzymaticactivityT430C>T(Arg144Cys)Cys单核苷酸多态性（SNP）导致人类遗传易感性的重要因素导致人类药物代谢和反应差异的重要因素GT突变野生型突变型10q24.2Chromosome10CYP2C9gen87变态反应药动学代谢吸收、分布、排泄药效学靶向结合作用免疫系统毒副作用治疗作用药物耐受药物代谢酶药物转运蛋白药物靶蛋白、受体人类白血球抗原药物作用基因与药物作用的关系原理基因蛋白合成举例：抗癫痫药丙戊酸钠的相关代谢酶——CYP2C19其基因最主要的两个突变位点

CYP2C19*2:第5外显子681位G→ACYP2C19*3:第4外显子636位G→A产生终止密码，过早终止蛋白合成，产生无活性CYP2C19酶，降低对丙戊酸代谢，使其在体内蓄积，发生毒副反应88变态反应药动学药效学毒副作用药物代谢酶药物转运蛋白...CCATTGAC......CCATTGAC...…GGTAACTG...…GGTAACTG......CCATTGAC......CCGTTGAC...…GGTAACTG...…GGCAACTG......CCGTTGAC......CCGTTGAC...…GGCAACTG...…GGCAACTG...A/A野生型纯合子单核苷酸多态性形成三种基因型和表型XXXA/a野生型杂合子a/a突变纯合子高活性中活性低活性...CCATTGAC......CCA89GCCCACCTCGCCCGCCTC甲病人乙病人WildtypeMutationWildtypeConcentrationMutationConcentrationTimeTimeCYP450CYP450

相同的剂量不同的血浆浓度P450酶活性与PD/PK值的关系GCCCACCTCGCCCGCCTC甲病人乙病人Wildt90吸收-慢

-快受体-缺失-丰富代谢

-慢速-中等-快速-超快速排泄

-缓慢-正常药物体内过程)吸收药物代谢酶药物转运分布药物转运代谢药物代谢酶排泄药物转运药物相关基因研究吸收受体代谢排泄91CYP450

主要存在于肝微粒体中,它的活性决定药物的代谢速率,与药物的清除率有着直接关系。CYP450酶系的基因主要有CYP1,CYP2,CYP3三家族,有以下几种重要的P450酶:CYP1A2、CYP2A6、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1、CYP3A4。药物代谢酶CYP450主要存在于肝微粒体中,它的活性决定药物的代92根据CYP2D6基因型调整抗抑郁药剂量3839米帕明多虑平马普替林曲米帕明地昔帕明去甲替林氯米帕明帕罗西丁文拉法辛阿米替林米安色林PMIMEMUM18213217480301288138174129928113217941811259811915292118138747593115135941161327084110130641159360148170523838%平均剂量根据CYP2D6基因型调整抗抑郁药剂量3839米帕明多虑平马93关于CYP2D6的表型判断举例：关于CYP2D6的表型判断，CYP2D6属于细胞色素P450酶常见药物代谢酶基因型及表型判断举例：关于CYP2D6的表型判断，CYP2D6属于细胞色素P94Β1受体基因突变药物计量调整Β1受体基因突变药物计量调整95

美托洛尔，根据CYP2D6基因调整剂量96美托洛尔，根据CYP2D6基因调整剂量26高血脂药物及硝酸甘油高血脂药物及硝酸甘油97雌激素与儿童智商相关基因雌激素与儿童智商相关基因98【英国《每日邮报》网站3月23日报道】科学家发现了一种会增加儿童智商低下风险的基因。这个发现意味着，在新生儿出生后不久对其进行一项基因检测，可能会有助于发现存在上述问题的婴儿，甚至为应对这一问题确定治疗方案做好准备。科学家认识到，如果7岁以下儿童在体内出现一种常见基因变异体的同时，甲状腺激素水平也出现下降，那么他们的智商变得异常低下的可能性将为其他儿童的4倍。每年约有4%的新生儿带有这种基因，而且体内的甲状腺激素水平较低。给这些儿童服用含有甲状腺激素的药片，或许可以帮助其大脑正常发育并达到正常水平的智商。每年将会有3万名儿童因此受益。这项新研究的关注重点是与细胞内甲状腺激素的产生有关的Ⅱ型脱碘酶。研究人员此前已将这种酶的基因突变与包括糖尿病和高血压在内的其他健康问题联系在一起。在上述新研究中，加的夫大学和布里斯托尔大学的科学家对3123名7岁以下儿童的基因数据进行了分析。这些儿童也接受了智商测试。体内甲状腺激素水平较低且存在Ⅱ型脱碘酶变异体的那些儿童，智商低于85的可能性是其他儿童的4倍。而仅存在甲状腺激素水平较低问题的儿童不会面临更多智商低下的风险。加的夫大学的皮特·泰勒博士说：“如果其他研究证实了我们的科研成果，那么，除了常规的新生儿甲状腺激素筛查外，同时进行针对这种基因变异体的测试，将有助于识别出今后最有可能变得智商低下的那些儿童。”相关研究结果是在于利物浦召开的英国内分泌协会大会上发布的。

儿童DIO2基因突变导致智商低下的研究【英国《每日邮报》网站3月23日报道】科学家发现了一种会增加99在上述新研究中，加的夫大学和布里斯托尔大学的科学家对3123名7岁以下儿童的基因数据进行了分析。这些儿童也接受了智商测试。体内甲状腺激素水平较低且存在Ⅱ型脱碘酶变异体的那些儿童，智商低于85的可能性是其他儿童的4倍。而仅存在甲状腺激素水平较低问题的儿童不会面临更多智商低下的风险。加的夫大学的皮特·泰勒博士说：“如果其他研究证实了我们的科研成果，那么，除了常规的新生儿甲状腺激素筛查外，同时进行针对这种基因变异体的测试，将有助于识别出今后最有可能变得智商低下的那些儿童。”相关研究结果是在于利物浦召开的英国内分泌协会大会上发布的。

儿童DIO2基因突变导致智商低下的研究在上述新研究中，加的夫大学和布里斯托尔大学的科学家对3123100本世纪，肿瘤的药物治疗取得了巨大成就。但肿瘤细胞的多药耐药性和肿瘤药物治疗的个体差异常造成肿瘤化疗的失败，且引起严重的毒副反应。个体药物治疗的药效和毒性的差异在很大程度上受到遗传因素如药物代谢酶、药物转运蛋白和药物作用靶点等药物相关基因的遗传多态性的影响。所以抗恶性肿瘤药临床有效率为30-80%肿瘤个体化治疗与基因检测本世纪，肿瘤的药物治疗取得了巨大成就。但肿瘤细胞的多药耐药性101根据病人的遗传特征,选择最有效的疾病治疗方法，更好地控制疾病的进展甚至预防疾病的发生，实现最佳的医学治疗效果。

在合适的时间(RightTime)给合适的病人(RightPatient)施行合适的治疗(RightTreatment),达到肿瘤个体化治疗肿瘤个体化治疗与基因检测根据病人的遗传特征,选择最有效的疾病治疗方法，更好地控制102肿瘤个体化治疗包括靶向治疗和化疗两部分:靶向治疗:通过实时定量、基因测序、FISH等技术检测肿瘤患者基因拷贝及基因突变信息，根据检测结果进行靶向治疗。个体化化疗：通过实时定量、基因分型、mRNA定量等技术，检测患者肿瘤标本或血液标本的mRNA表达、DNA的SNP分型，确定患者对化疗药物的敏感性和毒性反应并确定化疗剂量。肿瘤个体化治疗与基因检测肿瘤个体化治疗包括靶向治疗和化疗两部分:肿瘤个体化治疗与基因103肿瘤细胞基因表达与化疗药物肿瘤细胞基因表达与化疗药物104突变基因与化疗药物突变基因与化疗药物105肿瘤化疗疗效及毒副作用基因检测肿瘤化疗疗效及毒副作用基因检测106果因PPT工作室/guoyinppt原位杂交技术

2014-03-19果因PPT工作室/guoyinppt原107原位杂交技术一原位杂交技术的历史发展二原位杂交技术的原理及分类三原位杂交技术的一般过程四原位杂交技术的应用原位杂交技术一原位杂交技术的历史发展二原位杂交技术108一、原位杂交技术的历史发展

原位杂交技术(Insituhybridization，ISH)是分子生物学、组织化学及细胞学相结合而产生的一门新兴技术，始于20世纪60年代。1969年美国耶鲁大学的Gall等首先用爪蟾核糖体基因探针与其卵母细胞杂交，将该基因进行定位，与此同时Buongiorno—Nardelli和Amaldi等(1970)相继利用同位素标记核酸探针进行了细胞或组织的基因定位，从而创造了原位杂交技术。自此以后，由于分子生物学技术的迅猛发展，特别是20世纪70年代末到80年代初，分子克隆、质粒和噬菌体DNA的构建成功，为原位杂交技术的发展奠定了深厚的技术基础。

一、原位杂交技术的历史发展原位杂交技术(Insit109二、原位杂交技术的原理及分类概念：原位杂交技术(Insituhybridization，ISH)是用标记的核酸探针，经放射自显影或非放射检测体系，在组织，细胞、间期核及染色体上对核酸进行定位和相对定量研究的一种手段。原理：利用核酸分子单链之间有互补的碱基序列，将有放射性或非放射性的外源核酸(即探针)与组织、细胞或染色体上待测DNA或RNA互补配对，结合成专一的核酸杂交分子，经一定的检测手段将待测核酸在组织、细胞或染色体上的位置显示出来。二、原位杂交技术的原理及分类概念：原位杂交技术(Ins110原位杂交法分类1、基因组原位杂交技术基因组原位杂交(GISH)技术是20世纪80年代末发展起来的一种原位杂交技术。它主要是利用物种之间DNA同源性的差异，用另一物种的基因组DNA以适当的浓度作封阻，在靶染色体上进行原位杂交。

2、荧光原位杂交技术荧光原位杂交(FISH)技术是在已有的放射性

原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放

射性DNA分子原位杂交技术。它利用荧光标记

的核酸片段为探针，与染色体上或DNA显微切

片上的特异性杂交，通过荧光检测系

统(荧光显微镜)检测信号DNA序列在染色体或

DNA显微切片上的目的DNA序列，进而确定其杂

交位点。原位杂交法分类1、基因组原位杂交技术1113、多彩色荧光原位杂交技术多彩色荧光原位杂交(mFISH)是在荧

光原位杂交技术的基础上发展起来的

一种新技术，它用几种不同颜色的荧

光素单独或混合标记的探针进行原位

杂交，能同时检测多个靶位，各靶位

在荧光显微镜下和照片上的颜色不同，

呈现多种色彩。4、原位PCR原位PCR技术是常规的原位杂交技术与PCR技术的有机结合，即通过PCR技术对靶核酸序列在染色体上或组织细胞内进行原位扩增使其拷贝数增加，然后通过原位杂交技术进行检测，从而对靶核酸序列进行定性、定位和定量分析。原位杂交法分类3、多彩色荧光原位杂交技术原位杂交法分类112三、原位杂交技术的一般过程以经过标记的已知核酸分子为探针以细胞内与探针序列互补的特异核酸分子为靶分子在一定条件下使探针与靶核酸分子在原位发生杂交再对其探测三、原位杂交技术的一般过程以经过标记的已知核酸分子为探针113探针标记靶核酸分子杂交检测探针标记靶核酸分子杂交检测114一）、探针

是含有互补顺序的外源性被标记的DNA或RNA片段，是在原位杂交中用于检测细胞内特定DNA或RNA顺序定位的特殊试剂，探针的碱基序列是已知的，只能与特定的核酸分子结合上1、cDNA2、RNA3、寡核苷酸一）、探针是含有互补顺序的外源性被标记的DNA或RNA片1151、cDNA(complementaryDNA)互补于mRNA的DNA分子（长度为数百-数千碱基对）⑴克隆于质粒中，可以无限繁殖，取之不尽⑵较稳定，不易被降解⑶标记方法可靠易行优点1、cDNA互补于mRNA的DNA分子⑴克隆于质粒中116优点：⑴杂交效率比DNA探针高

⑵在检测mRNA时所形成的RNA-mRNA杂交体比DNA-mRNA杂交体稳定

⑶可以同时得到同义RNA链和反义RNA链缺点：2、RNA

RNA是单链分子（探针长度50-300碱基对）容易受RNA酶的污染而被降解优点：2、RNARNA是单链分子容易受117

这类探针是根据靶分子而设计序列在DNA合成仪上用化学方法合成

优点：形成杂交体快速（序列短链，杂交时易于穿透）

缺点：特异性较低（短链和简单）短链探针(长度10-50个核苷酸)3、寡核苷酸这类探针是根据靶分子而设计序列短链探针3、寡核118

二）、探针标记1、标记物

（1）放射性标记物

（2）非放射性标记物2、标记方法

（1）DNA探针标记

（2）RNA探针标记

（3）寡核苷酸探针标记

二）、探针标记1、标记物（1）放射性标记物1191、标记物①高度灵敏性；②标记物与核酸探针结合，应绝对不能影响核酸探针与模板的结合能力及结合的特异性；③当用酶促方法进行标记时，应对酶促活性（Km值）无多大影响，以保证标记反应的效率和标记产物的比活性；④高度特异性；⑤较高的化学稳定性，保存时间长，标记及检测方法简单；⑥对环境无污染，对人体无损伤；⑦价格低廉等。1、标记物①高度灵敏性；120标记物分类放射性标记物：同位素35S、33P、32P和3H等非放射性标记物：荧光素生物素地高辛

溴脱氧尿嘧啶等标记分子：某种单核苷酸在单核苷酸分子中导入某个原子、功能基团或侧链分子作为标记物，对碱基配对不造成影响标记物分类放射性标记物：同位素35S、33P、32P和121标记分子：放射性标记分子：

35S-UTP35S-dATP

35S-dCTP

32P-UTP32P-dATP等等非放射性标记分子：

四甲基罗达明-UTP

生物素-UTP(Bio-UTP)

地高辛-dUTP(Dig-dUTP)

溴脱氧尿嘧啶本身为标记分子标记分子：1222、标记方法（1）DNA探针标记

切口移位法随机引物法（2）RNA探针标记

在体外转录技术中与探针制备同时完成（3）寡核苷酸探针标记

末端转移法将放射性或非放射性的标记分子在各种酶促反应中参入探针分子2、标记方法（1）DNA探针标记将放射性或非放射性的标记分子123切口平移法切口平移法124随机引物法随机引物法125

三）、靶核酸分子靶分子（或靶序列）：指所要探测的核酸分子或核苷酸序列（DNA或RNA）

DNA——可以是中期染色体上的或是间期细胞核内的，也可以是线粒体DNA或病毒DNARNA——