叶绿素的提取及叶绿素铜钠的合成与测定实验方案

叶绿素的提取及叶绿素铜钠的合成与测定实验方案一、 实验目的和要求掌握从蚕沙中提取叶绿素的方法，并计算提取率；初步研究用叶绿素合成叶绿素铜钠的工艺条件；分析叶绿素铜钠产品的纯度，计算产率；利用光谱技术对合成的叶绿素铜钠进行初步表征；通过本实验继续学习及巩固各种实验仪器的安装及操作。二、 叶绿素铜钠产品的验收指标1.60C烘干（恒重）所得产品质量；产品水溶液的pH值；绘制叶绿素铜钠水溶液（1%的吸收曲线（人入）；4-绘制A405/A630的值，给出A405/A630的^；5.绘总铜量与游离铜量关系图（时间紧可不做）。三、 实验原理蚕沙又称蚕屎，是我国丰富的农副的资源，其主要成分有：粗蛋白13.47%一14.45%，粗脂肪2.18%-2.29%，粗纤维：15.79%-16.24%，可溶物：56.92%-57.44%（其中果胶占12%），灰份：9.58%-9.95%。叶绿素：1%，有少量粪胡萝卜素，叶黄素和三十烷醇等。我国广大蚕区的蚕沙产量很大，价格低廉，风干后便于存放。显然，以蚕沙为原料制取叶绿素及其铜钠盐，较之以天然植物为原料，具有成本低、方法简易、资源充足、不受季节限制等优点。叶绿素铜钠是联合国粮农组织、世界卫生组织（ FAO/WHO和我国食品添加剂标准委员会批准使用的一种天然食用色素，叶绿素铜钠以其固有的鲜亮绿色性，较叶绿素对光、热有较好的稳定性及其特有的杀菌除臭性能而被广泛用于食品、医药卫生和日用化学工业，同时又是一种价值很高，在我国，生产叶绿素铜钠一直以蚕砂为原料。叶绿素不仅在医药、食品和日用工业中有着广泛用途，由它制得的叶绿素铜钠盐，更是生产治疗肝炎、胃及十二指肠溃疡药物的重要原料。蚕儿排出的蚕沙（即粪便）中，含叶绿素高达0.81.0%（干物）。我国广大蚕区的蚕沙产量很大，价格低廉，风干后便于存放。显然，以蚕沙为原料制取叶绿素及其铜钠盐，较之以天然植物为原料，具有成本低、方法简易、资源充足、不受季节限制等优点。叶绿素是一种含有卟吩环的天然色素，它与蛋白质结合存在于植物的叶和绿色的茎中，是植物进行光合作用所必须的催化剂。叶绿素有 a和b两种，a为蓝黑色结晶（m.p,117）,b为深绿色结晶（m.p,120130）叶绿素对光、热敏感易氧化裂解而褪色，故用作食品添加剂有其局限性。叶绿素a和叶绿素b分子式如下图1:

注 Y：CH.1giL .广八jqg叶绿醉基|叶绿素丹CHm^^^Y^^I^"^-CHY：CH。1广\一J, I /SH时叶绿酵基M缘索〃W €i）HM—<CH"zU1CH；CH；<CH|—CH-CHS—CH. C-CH—CH/-CH* CH3叶绿素是一个双羧酸的酯，不溶于水，易溶于乙醚，苯，丙酮，乙醇的

脂性溶剂，难溶于石油醚。叶绿素由于遇热，光，酸，碱等易分解，故将其

'"、° 由叶绿素制得的叶绿素铜钠盐，是生产治疗肝炎、胃及十二指肠溃疡药物的重要原料。将叶绿素经过皂化、置铜、纯化和成盐等几步后，就可以得到叶绿素铜钠盐产品。叶绿素铜钠为墨绿色，有金属光泽的粉末，无臭或带氨臭，易溶于水，水溶液呈绿色，透明，无沉淀。1%勺水溶液的Ph值为9.5-10.2。微溶于乙醇和氯仿，几乎不溶于油脂和石油醚。水溶液中加入钙盐会析出沉淀其耐光性比叶绿素强，加热到110C以上会分解。叶绿素铜纳盐在70C以下稳定性较好；光照对叶绿素铜钠盐稳定性的影响较大；还原剂（ 旭2$2。3）对叶绿素铜钠盐稳定性的影响较大，氧化剂在短时间内对其稳定性的影响不大， 但放置的时间不宜超过30min；叶绿素铜钠盐在pH值为6以上的溶液中较为稳定，且有机酸及单糖对其稳定性无明显影响。叶绿素a、b都是双羧酸酯，因此可与碱发生皂化反应：COOCH3 COONaC32H30ON4Mg— +2NaOH鼻C32H30ON4Mg—| +CH3OH+C20H39OHCOOC20H39 COONa在酸性条件下，叶绿素钠盐分子中的镁极易被氢原子取代生成褐色的叶绿酸:CHC34Ha2+4在酸性条件下，叶绿素钠盐分子中的镁极易被氢原子取代生成褐色的叶绿酸:CHC34Ha2+4H=Ca；+4H=CH34H34ONMgN°ONMgNCOONaC32H30ON4M +2H2SO4丁C32H30ON4H2—COONaO34O32N+MN+MCOOHCOOH+MgSO4+NaSO4四、叶绿酸可与铜盐在加热条件下生成叶绿素铜酸析出,丙酮，再与碱反应生成叶绿素铜钠：铜代：将叶绿素铜酸溶于COOH COOHC32H30ON4H2_ +CuSO四、叶绿酸可与铜盐在加热条件下生成叶绿素铜酸析出,丙酮，再与碱反应生成叶绿素铜钠：铜代：将叶绿素铜酸溶于COOH COOHC32H30ON4H2_ +CuSO4TC32H30ON4CU— +H2SO4成盐：COOHCOONaC32H30ON4Cu +2NaOH丁C32H30ON4CU—I +2电。COOHCOONaC H O N2++C H O NC34 34 5 4+ 34 32 5 4C H O CN2+=c H O NC34 32 企 4+ 34 30 6 4C HON&UU+=2NaOH=CHC^O'n Cu+2NaOH:C实验试剂和仪器u+2Hu+2HO30H34NCuNa+2HO28O6N4CuNa2+2H2O试剂：蚕沙（100g）,95%乙醇，氢氧化钠，石油醚，盐酸，丙酮，硫酸铜，磷酸盐缓冲液（pH=7.5）,40%乙醇仪器粉碎机，带温度计、搅拌器的烧瓶，回流冷凝管，恒温槽，烧瓶，冷凝管，抽滤瓶及漏斗，胶管，玻璃棒,100mL量筒，试纸，751分光光度计，台式天平、分析天平,2个10ml容量瓶,1个100ml容量瓶，1个250ml容量瓶，5ml吸量管，吸耳球1个五、实验步骤从蚕沙中提取叶绿素称取（干燥）蚕沙50.00g于500ml广口瓶中，用适量水润湿，加入200ml80%A酮溶液使其完全浸没，加塞置于3040°C恒温水浴中浸泡,3小时后取出并立即过滤，分离得墨绿色溶液转入500ml圆底烧瓶，于40500C水浴用旋转蒸发仪减压蒸憎蒸出丙酮,当温度计计数骤然下降时，蒸憎结束・回收的丙酮可循环用于下一批蚕沙的浸泡，将剩下的溶液，冷却至室温，得到墨绿色膏状物（叶绿素粗品，不宜以置），即为叶绿素粗品。叶绿素的皂化将上述叶绿素转入圆底烧瓶用95%八醇稀释，加入5%NaOH-BOH容液（调pH=11）于60oC水浴回流皂化1小时•将皂化后的溶液冷却转入分液漏斗，用石油醚萃取除杂（上层为黄色），静置分层，下层（为绿色）为可溶性的叶绿酸盐，按上法提取23次。叶绿素酸中镁的铜代在皂化液（下层溶液）中加无水乙醇，使溶液中无水乙醇浓度达80%八浓HCI酸调pH=7加入10ml10%勺CuSO4再用HCI调pH=23,用水浴加热至60C，保温搅拌3060min,趁热过滤，滤渣用乙醇洗涤抽干，合并滤液和洗液，加入等量的蒸馏水，有叶绿素铜酸析出，静置4h过液，依次用蒸馏水、30%40%乙醇、石油醚洗涤4次，抽干，至纯度达90%以上。叶绿素铜钠的形成叶绿素酮酸（即抽干物）用95%丙酮溶解、过滤，滤液5%氢氧化钠乙醇溶解、滤纸去检验，到完全溶解，同时用HCI调pH=1112（创造酸碱反应的条件），反应30分钟，然后过滤，收集沉淀，加适量无水乙醇洗涤，最后60C真空干燥。六、 叶绿素铜钠产品的质量检测及纯度的分析制得的叶绿素铜钠为墨绿色粉状物；称取0.100g叶绿素铜钠溶于蒸馏水配制成 1%溶液，用酸度计测其pH=910.5；叶绿素铜钠的吸光度：磷酸钠缓冲液的配制：取5.8446g磷酸氢二钠与2.0414g磷酸二氢钾溶解在烧杯中，分别定容至250ml与100mI容量瓶中。取250mI磷酸二氢钠与47.6m|磷酸一氢钾混合。吸光度的测定：用电子天平称取烘干产品0.0100g,用蒸馏水溶解在10ml容量瓶中定容，准确量取5ml溶液，用缓冲液定容至100ml,缓冲液为空白液，在15分钟内测定400nm650nm下的吸光度。绘制叶绿素铜钠水溶液的吸收曲线，给出A405与A630的比值.绘制叶绿素铜钠标准吸收曲线：用电子天平称取标准样品0.0100g，用蒸馏水溶解在10ml容量瓶中定容，准确量取5ml溶液，用缓冲液定容至100ml,缓冲液为空白液，在15分钟内测定400nn 650nm下的吸光度。绘制叶绿素铜钠水溶液的标准吸收曲线.七、 实验记录参考文献.浙江大学、华东理工大学、四川大学合编，