药学分子生物学：第二章 DNA的复制、损伤和修复

第二章DNA的复制、损伤和修复DNA复制DNA双链在细胞分裂间期进行的以一个亲代DNA分子为模板合成子代DNA链的过程。DNA复制的一般特征半保留复制(semicon-servativereplication)：DNA复制过程中，两条链分别做模板各自合成一条新的DNA链，子代DNA分子中一条链来自亲代DNA，另一条链是新合成的。ThreeHypothesesofReplicationThreemethodsofDNAreplicationwereconsidered:SemiconservativeConservativeDispersive弥散型复制实验证据（1958Meselson和Stahl）：

MatthewMeselsonFranklinStahl“Heavy”DNA“Hybrid”

DNA“light”DNA“Hybrid”DNA双向复制：从复制起点开始同时向两侧进行复制20-10枯草杆菌中双向复制的证明弱放射线标记复制泡强放射线标记的DNA果蝇中双向复制的证明复制过程中对DNA先强标记再弱标记发现：从中间向两侧变弱表明：复制子有一个中央复制起点和两个复制叉20-12不同时间ColE1质粒用EcoRI单切在复制上方的一段DNA始终没有变化而下方的DNA随着复制泡的增大而变小说明：单向复制3.半不连续复制：

DNA复制过程中，先导链合成是连续的；后随链合成是先形成小片段(Okazakifragment，冈崎片段)，再连接而成DNA长片段。野生型细菌DNA连接酶突变的细菌有一定的复制起始点：复制是从DNA分子上的特定部位开始的，这一部位叫做复制起点(originofreplication,ori)。DNA复制从起始点开始直到终点为止，每个这样的DNA单位称为复制子(replicon)；复制起始点两条链解开成单链，分别做模板各自合成其互补链所形成的Y形结构称为复制叉(replicationfork)。需要引物

(primer)：DNA聚合酶必须以一段具有3'-OH的RNA作为引物，才能开始聚合子代DNA链

DNA复制的酶学使DNA链解离的酶：解旋酶(helicase)：通过ATP获能，沿5‘→3’方向解开DNA双链单链DNA结合蛋白（single-strandbindingprotein,SSB):与单链DNA结合，阻止其再形成双链体状态；保护单链DNA不被水解DNA旋转酶：拓扑异构酶II（DNATopisomerase），催化DNA拓扑异构体相互转换，松弛超螺旋DNA复制过程中的酶RNA引物酶：催化合成与模板DNA3’端互补的RNA引物DNA聚合酶(DNApolymerase)：在引物的3’-OH末端，以dNTP为底物，按模板DNA上的指令逐个聚合上核苷酸，从5’→3‘合成新链E.coliDNAPolymerasesThereare3DNApolymerases,theenzymesthatmakeDNA,foundinE.coli:polIpolIIpolIIIE.coliDNApolymeraseIwasthefirstpolymeraseidentifiedItwasdiscoveredin1958byArthurKornbergDNAPolymeraseIDNApolymeraseI(polI)isaversatile多功能enzymewith3distinctactivitiesDNApolymerase3’5’exonuclease5’3’exonucleaseMildproteolytic温和的蛋白酶treatmentresultsin2polypeptidesKlenowfragmentSmallerfragment5’3’exonucleaseThisactivityallowspolItodegradeastrandaheadofadvancingpolymerase降解前方的DNA链RemovesandreplacesastrandinonepassBasicfunctionsare:PrimerremovalRNA引物去除和转换Nickrepair切口修复KlenowFragmentContainsboth:Polymeraseand3’5’exonucleaseactivitywhichservesasproofreadingIfpolIaddedwrongnt,won’tbasepairproperlyPolIpauses,exonucleaseremovesmispairedntAllowsreplicationtocontinueIncreasesfidelityofreplicationPolymerasesIIandIIIPolIIactivityisnotrequiredforDNAreplication非必须PolIappearsmostlyactiveinrepair主要功能是修复OnlypolIIIisrequiredforDNAreplicationPolIIIistheenzymethatreplicatesbacterialDNAThePolIIIHoloenzyme全酶DNA聚合酶Ⅰ多功能酶

5’3’外切酶

3’5’外切酶

5’3’聚合酶单链多肽大小二个片段切除RNA引物，填补空缺损伤后修复DNA聚合酶Ⅱ与Ⅲ多功能酶

5’3’聚合酶

3’5’外切酶

不对称二聚体单体1-前导链/单体2-随从链DNA复制的主要酶高续进性高聚合酶活性高产物真实性MultipleEukaryoticDNAPolymerasesdeltaepsilon真核细胞DNA聚合酶的作用DNA聚合酶功能DNA聚合酶αDNA复制合成后随链DNA聚合酶δDNA复制合成先导链DNA聚合酶ε参与DNA的修补合成DNA聚合酶βDNA修复DNA聚合酶γ线粒体DNA复制DNA复制的过程复制的起始复制的延伸复制的终止1.复制的起始复制原点(OriC):245bp的DNA序列,富含A-T,3个13聚体的回文结构和4个9聚体的重复序列双链解开、复制起始大约20个DnaA蛋白在ATP的作用下与oriC处的4个9bp保守序列相结合在HU蛋白和ATP的共同作用下,Dna复制起始复合物使3个13bp直接重复序列变性,形成开链解链酶六体分别与单链DNA相结合(需DnaC帮助),进一步解开DNA双链蛋白质DnaADnaBDnaCDnaG（引物酶）结合到DNA双链复制起始部位(需ATP)解链酶的作用辅助DnaB结合到复制起始点合成RNA引物RNA引物的合成和复制的起始必需的2.复制的延伸先导链(leadingstrand)合成：以3’→5’亲本链为模板，由引发体合成引物，DNA聚合酶Ⅲ催化以5’→3’合成一条完整的新链后随链(laggingstrand)合成：引物RNA合成→DNApolⅢ→合成冈崎片段→

DNA

polI切除冈崎片段上的RNA引物→由DNA连接酶连接两个冈崎片段→形成完整的DNA后随链3.复制的终止E.ColiDNA具有终止位点(ter)，与蛋白质Tus结合，阻止解链酶活性而终止复制两个环状DNA分子，经过拓扑异构酶Ⅱ作用分离真核生物DNA复制的特点真核生物多起点复制，形成多个复制叉，自主复制序列启动DNA复制DNA聚合酶α和δ是主要复制酶DNA的延长取决于增殖细胞核抗原(PCNA)真核细胞染色体为线性，末端有由端粒酶合成的端粒结构染色体复制涉及核小体，DNA复制后需要与组蛋白结合形成染色体端粒结构的形成端粒是一段DNA序列和蛋白质形成的复合体端粒DNA由多个串联的5-8bp寡核苷酸序列组成端粒DNA的合成端粒酶是反转录酶，由蛋白质和RNA两部分组成，它以自身的RNA为模板，在后随链模板DNA的3’OH末端延长DNA再以这种延长的DNA为模板，继续合成后随连形成端粒结构端粒的功能和特点保证线性DNA的完整复制保护染色体末端不受核酸酶水解和不发生染色体的异常重组体细胞端粒酶活性低随着复制次数的增加端粒DNA逐步缩短，细胞逐渐停止分裂，进而进入凋亡恶性肿瘤细胞可表达端粒酶，永生分裂线粒体DNA(mtDNA)复制mtDNA结构：双链闭环，含有大量G的重链和含有大部分C的轻链，各有一个复制区，均有编码功能。mtDNA复制过程：环取代方式复制①H-链首先合成：在复制起点处以L链为模板合成RNA引物，合成H链片段并与L链以氢键结合形成双螺旋结构，将亲代的H链置换出来，产生一种D环复制中间物②L-链的合成：当H-链的复制进行到2/3基因组的位置时，L-链的复制起点被暴露，以被置换下来的亲代H链为模板，开始合成L-链DNA，合成也需要RNA引物③复制的完成：H链的合成先完成，L链合成随后结束单链环状DNA的复制φX174噬菌体由一个单链环状DNA组成，这条链称为正（+）链；合成的互补链称为负（一）链。双链体的复制以滚环复制方式进行双链线状DNA的复制过程复制从DNA中间开始—T7噬菌体复制起始必需的三个酶：T7RNA聚合酶、T7DNA聚合酶和基因4蛋白(geneproduct4,gp4)复制由转录开始必需以RNA为引物T7噬菌体DNA的复制复制从末端开始—腺病毒,以单链置换形式进行复制逆转录病毒的复制逆转录病毒：RNA病毒。在逆转录酶的作用下首先将RNA转变为cDNA，并插入宿主的DNA中，进行复制、转录、翻译达到扩增目的RNA→DNA→RNA逆转录酶RNA指导的DNA聚合酶：以RNA为模板合成DNADNA指导的DNA聚合酶：以DNA为模板合成DNA核糖核酸酶H(RNaseH)活性：特异性水解RNA-DNA杂交双链上的RNA逆转录病毒的复制第二节DNA损伤外界因素（如辐射、药物等）使DNA双螺旋结构发生不正常改变，或由于DNA链中某一核苷酸发生突变，使DNA碱基序列改变从而干扰复制和转录DNA损伤的原因内源性损伤：DNA复制错误碱基互变异构体导致错配DNA自发的化学改变氧化作用损伤碱基外源性损伤物理因素：紫外线及各种射线化学因素：碱基类似物、碱基修饰剂、DNA插入剂

1、DNA复制错误

碱基配对的错误频率约为10-1～10-2，DNA聚合酶的作用下降到约10-5-10-6，校正后的错配率仍约在10-10左右。2、DNA自身的不稳定性

(1)碱基的异构互变

使碱基配对间的氢键改变，可使腺嘌呤能配上胞嘧啶、胸腺嘧啶能配上鸟嘌呤等

（例如烯醇式与酮式碱基间的互变）

(2)碱基的脱氨基作用

碱基的环外氨基有时会自发脱落，从而胞嘧啶会变成尿嘧啶、腺嘌呤会变成次黄嘌呤（H）、鸟嘌呤会变成黄嘌呤（X）等，遇到复制时，U与A配对、H和X都与C配对就会导致子代DNA序列的错误变化。胞嘧啶自发脱氨基的频率约为每个细胞每天190个。

(3)脱嘌呤与脱嘧啶

自发的水解可使嘌呤和嘧啶从DNA链的核糖磷酸骨架上脱落下来。一个哺乳类细胞在37℃条件下，20h内DNA链上自发脱落的嘌呤约1000个、嘧啶约500个；估计一个长寿命不复制繁殖的哺乳类细胞（如神经细胞）在整个生活期间自发脱嘌呤数约为108，这占细胞DNA中总嘌呤数约3%。

3、机体代谢过程中产生的活性氧

细胞呼吸的副产物O2-、H2O2等会造成DNA损伤，能产生胸腺嘧啶乙二醇等碱基修饰物，还可能引起DNA单链断裂等损伤，每个哺乳类细胞每天DNA单链断裂发生的频率约为5万次。（二）环境因素1、物理因素（1）电离辐射（2）非电离辐射（1）电离辐射：能直接或者间接引起被穿透物质产生电离包括α粒子、β粒子、γ射线、X射线等。

（2）非电离辐射：包括紫外以及能量低于紫外的所有电磁辐射，传递能量，使物质分子或原子中的轨道电子从较低的能态跃迁到较高的能态。同一条DNA链上相邻的嘧啶以共价键连成二聚体，相邻的两个T、或两个C、或C与T间都可以环丁基环（cyclobutanering）连成二聚体，其中最容易形成的是TT二聚体。2、化学因素（1）自由基（2）碱基类似物（3）碱基修饰物（4）嵌入性染料（1）自由基导致的损伤定义：指能够独立存在，核外带有未配对电子的原子或者分子。具有强烈夺取或丧失电子以成为配对电子的趋向。（2）碱基类似物：一类与DNA正常碱基结构类似的化合物，在DNA复制时取代正常碱基掺入并与互补链碱基配对，从而引起碱基对的置换。（3）碱基修饰物：一类通过对DNA碱基的某些基团的修饰，改变其配对性质，进而改变DNA结构的化合物。①脱氨基剂（亚硝酸）②其它类（羟胺（HA）还原剂，专一性的与胞嘧啶作用）③烷化剂对DNA的损伤

烷化剂是一类亲电子的化合物，很容易与生物体中大分子的亲核位点起反应。烷化剂的作用可使DNA发生各种类型的损伤。甲基硫酸乙酯（EMS）（4）嵌入性染料包括溴化乙锭、吖啶橙等，可以直接插入到DNA碱基对中，可导致碱基间的距离撑大一倍，极易造成DNA两条链的错位，而在DNA复制过程中引起核苷酸缺失、移码或插入。DNA损伤（突变）的类型点突变(pointmutation)

：又称错配，指DNA上单一碱基的变异，分为转换和颠换两种形式。移码突变（frameshiftmutation）：指DNA片段中某一位点插入插入或丢失一个或几个（非3的倍数）碱基对时，造成插入或丢失位点以后的一系列编码顺序发生错位的一种突变。引起该位点以后的遗传信息出现异常重排和/或重组：DNA分子内较大片段的交换5’-G-C-A-G-U-A-C-A-U-G-U-C-3’丙氨酸缬氨酸组氨酸缬氨酸5’-G-A-G-U-A-C-A-U-G-U-C-3’谷氨酸酪氨酸蛋氨酸丝氨酸第三节DNA修复复制修复：校正DNA复制过程中产生的碱基错误连接尿嘧啶糖基酶系统：切除进入DNA分子的尿嘧啶核苷酸错配修复：修复DNA碱基错配、增强DNA复制忠实性、维持基因组稳定性和降低自发突变无嘌呤（AP）修复：AP内切酶去除DNA中无碱基核糖损伤修复光复活修复甲基转移酶切除修复：碱基切除修复、核苷切除修复复制后修复

(postreplicationrepair)大肠杆菌的重组修复系统SOS修复：DNA分子受损伤的范围较大，在复制受到抑制时出现的一种应急修复作用DirectlyUndoingDNADamage

直接修复光复活作用模型紫外线照射引发嘧啶二聚体的形成DNA光裂合酶与DNA损伤区结合酶吸收近紫外到可见光光谱范围的光酶将嘧啶二聚体断裂，然后与被修复的DNA解离DirectlyUndoingDNADamage

直接修复鸟嘌呤甲基转移酶将鸟嘌呤O6上的烷基转移到自身的一个氨基酸残基上ExcisionRepair

切除修复细菌的碱基切除修复DNA糖基化酶使受损碱基外突DNA糖基化酶切除外碱基AP内切酶从AP5端一侧切开DNADNA磷酸二酯酶去除AP位的脱氧核糖磷酸DNA聚合酶I填补空隙，同时向下合成DNA连接缺口ExcisionRepair

切除修复人类的碱基切除修复胞嘧啶发生自发脱落氨基作用，使C转变为U糖基化酶将尿嘧啶切除在AP位点处切断聚合酶将C准确填补，同时将磷酸切除连接酶修复缺口，DNA恢复正常不正确填补，留下一个切口APE1外切错配T聚合酶加入正确的C20-81NucleotideExcisionRepair

核苷酸切除修复NucleotideexcisionrepairtypicallyhandlesbulkydamagethatdistortsDNAdoublehelixNER主要作用于会导致DNA双螺旋发生扭曲的严重损伤NERinE.coli核酸切除酶在严重受损碱基的两侧对DNA链进行切割（12nt）聚合酶I以上方链为模板填补核苷酸再由连接酶粘合切口NERinHuman在多种因子作用下：部分解链，切除突变链合成新的正确链Double-StrandBreakRepairinEukaryotesdsDNAbreaksineukaryotesareprobablymostdangerousformofDNAdamageThesearereallybrokenchromosomesIfnotrepairedleadt