酶联免疫吸附试验(ELISA)在食品安全快速检测上的应用课件

酶联免疫技术

与食品安全快速检测姓名:陈超学号：201423104001目录ELISA概述ELISA的常用方法ELISA的应用一、ELISA概述酶联免疫吸附试验(ELISA)：是在免疫荧光和组织化学基础上发展起来的新技术。主要是利用抗原与抗体的高特异性反应，通过合适的载体，使酶标抗原或抗体与待测样品反应，形成酶标抗原抗体复合物，在相应的酶底物参与下，复合物上的酶催化底物使之水解成有色物质。一定条件下，呈色物质与待测物的含量直接相关，因此可以根据呈色物质颜色的深浅，对待测样品进行定性定量分析。常用的标记酶有：辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化物酶、碱性磷酸酯酶等。这一类酶通常满足以下条件：具有较高的催化专一性和活性与抗原抗体偶联后不影响自身酶活性和抗原抗体的免疫活性催化反应的信号产物易检测价廉易得对人体无害二、ELISA的常用方法夹心法间接法测抗体竞争法双抗体夹心法测抗原双抗原夹心法测抗体竞争法测抗原竞争法测抗体（1）双抗体夹心法A.

将抗体吸附于固相表面;B.

加待检抗原，形成抗原-抗体复合物;C.

加酶标抗体;D.加底物。底物的降解量与抗原量成正比。

此法常用于检测抗原（3）竞争法测定抗原A.

将抗体吸附在固相载体表面;

同时加入酶标抗原和待测抗原，竞争结合抗体；C.加底物。底物降解量与未知抗原量成反比。此法既可用于检测抗原和半抗原的定量测定，也可用于测定抗体三、ELISA快速检测技术在食品安全检测中的应用实例

水产品中残留氯霉素的测定

氯霉素，是一种广谱抗菌素。氯霉素对骨髓造血机能有抑制作用，可引起血小板减少性紫癜、粒细胞缺乏症、再生障碍性贫血，腹胀、腹泻、食欲减退，口腔粘膜充血、疼痛、糜烂、口角炎和舌炎等。另外还可引起视神经炎、视力障碍、多发性神经炎、神经性耳聋以及严重失眠。具体方法：酶标板包被有针对兔IgG（氯霉素抗体）的羊抗体。加入氯霉素抗体、氯霉素酶联记物、氯霉素标准或样品溶液。氯霉素抗体与固定的羊抗体结合。游离氯霉素与氯霉素酶联记物竞争氯霉素抗体结合位点。没有结合的氯霉素酶联记物在洗涤步骤中被除去。结合的氯霉素酶联记物将无色的酶底物转化为蓝色的产物，加入反应终止液后使颜色由蓝变成黄色。用酶联分析仪于波长450nm下进行吸光度测定。ELISA是测定水产品中氯霉素含量的一种好方法。由于酶的专一性催化作用，酶标板上多份样品同时检测，故操作简单，灵敏度，精密度较高，是测定水产品中氯霉素含量的一种好方法。目前用于食品安全性检测的方法有很多，常见的有：ELISA检测技术微生物学方法薄层色谱法气象色谱法高效液相色谱法PCR技术核酸探针技术（1）高灵敏度，可达到10亿万分之一甚至更低（2）高特异性（3）宽适用范围，可测定各类食品（4）低检测费用（5）易商品化应用前景谢谢！抗原的制备抗原：是指能够引起机体特异性免疫应答，并能与相应抗体发生特异性反应的物质，即同时具有免疫原性和抗原性。半抗原：具有免疫原性的物质也必然具有抗原性，不具有免疫原性只有抗原性的物质称为半抗原。半抗原相当于一个抗原决定簇，即只具有抗原性，能与抗体结合，但不具有免疫原性，不能诱导机体产生免疫应答。半抗原修饰好后，一般要与合适的载体蛋白以共价键偶联，使之具有免疫原性，称之为人工抗原。如果农药分子上不具有所需的活性基团，则需利用化学方法引入制成半抗原，再与载体偶联。常用的载体蛋白有牛血清白蛋白、卵清蛋向、兔血清白蛋白、人血清白蛋白、人血纤维蛋白、甲状腺球蛋白、猪血清白蛋白等。常用的偶联方法有：混合酸酐法、碳二亚胺法、重氮化法、戊二醛法等。抗体的制备抗体：是机体受到抗原刺激后，机体体液中产生的能与相应抗原特异性结合的免疫球蛋白。较为常见的抗体有多克隆抗体和单克隆抗体。多克隆抗体是经特定的抗原免疫动物后得到的抗血清抗体，是免疫分析中常用的抗体类型。单克隆抗体：由单个B细胞增殖形成的群落产生的结构相同、功能均一的抗体称为单克隆抗体。ELISA在毒素检测中的应用真菌毒素是真菌产生的次级代谢产物。有些对人类危害很大，它们同时具有毒性强和污染频率高的特点。其中产毒最大，致癌力最强的是黄曲霉毒素。至今，几乎所有重要真菌毒素的ELISA检测方法均已建立ELISA在农药残留检测中的应用ELISA已成为许多国际权威分析机构分析农药残留的首选方法。迄今为止，应用ELISA检测食品中的残留农药主要为除草剂、杀虫剂、和杀菌剂。由于该技术具有样本前处理简单，纯化步骤少，大量样本分析时间短，适合于做成试剂盒现场筛选等优点，使其可在蔬菜产区，批发市场和海关配备，工商人员可随身携带或建立固定的农药残留速测点，随时把残留超标的蔬菜，水果杜绝在食用之前。ELISA在肉类品质检测中的应用ELISA在肉类品质检测中的应用主要包括加热终温判定分析和掺入异种肉的检测两方面。ELISA在动物性食品中药物残留检测上的应用例如瘦肉精酶联免疫检测法，基于抗原抗体反应进行竞争性抑制测定，不仅可作为一个定性筛选过程，也可以进一步进行定量测定。检测灵敏度可达到0.5×10-9，完全达到我国农业部目前的1×10-9监督检测标准。酶联免疫法作为药物残留量的筛选方法具有操作简单、准确快速的特点，适用于大量样品的测定。ELISA在人兽共患疾病病原体检测上的应用例如在禽流感病毒检测方面，我国已完成了禽流感流行株的分离和鉴定、禽流感重组核蛋白诊断抗原的研制及应用，建立了禽流感免疫酶诊断方法和技术，已形成试剂盒生产能力。毒素检测农药残留检测细菌污染检测肉类品质检测动物性食品中药物残留检测人兽共患疾病病原体检测重金属污染检测食物中其他成分检测……三、ELISA快速检测技术在食品安全检测中的应用1、双抗体夹心法：此法常用于检测抗原它是利用待测抗原上的两个抗原决定簇A和B分别与固相载体上的抗体A和酶标记抗体B结合，形成抗体A-待测抗原-酶标抗体B复合物，复合物的形成量与待测抗原含量成正比。抗体A待测抗原酶标抗体B包被物加底物显色2、间接法测定抗体此法常用于测定抗体将已知抗原连接在固相载体上，待测抗体与抗原结合后再与酶标二抗结合，形成抗原-待测抗体-酶标二抗的复合物，复合物的形成量与待测抗体量成正比。抗原待测抗体酶标二抗包被物加底物显色3、竞争法此法既可用于检测抗原和半抗原的定量测定，也可用于测定抗体用酶标抗原（抗体）与待测的非标记抗原（抗体）竞争性的与固相载体上的限量抗体（抗原）结合，待测抗原（抗体）多，则形成非标记复合物多，酶标抗原与抗体结合就少，也就是酶标记复合物少，因此，显色程度与待测物含量成反比。限量的