知识补充高效液相色谱法

HPLC

HighPerformanceLiquidChromatography17.1概述17.2高效液相色谱仪17.3高效液相色谱的固定相和流动相17.4高效液相色谱法的主要类型第一页，共八十八页。1HPLC的发展历史1952James和Martin发展了气相色谱；1967Kirkland等研制高效液相色谱法；吸附柱色谱1906GC1950年代GC-MS1950年代末HPLC1960年代毛细管电泳和毛细管电动色谱等一系列新的色谱法1980年代中期第二页，共八十八页。2HP1100型高效液相色谱仪第三页，共八十八页。317.1.2HPLC与GC的比较气相色谱（GC）适合分析在操作温度下能气化而不分解的有机化合物，仅占15%，衍生后也只有不到20%。

GC不适合高沸点、难挥发及热不稳定化合物、离子性化合物、高聚物等。第四页，共八十八页。4补充高效液相色谱法

保留值塔板数塔板高度分离度选择性气相色谱﹦液相色谱塔板理论速率方程液相色谱所用基本概念：第五页，共八十八页。517.1.2HPLC与经典LC的比较第六页，共八十八页。6HPLC：高效色谱柱、高压泵、高灵敏检测器经典LC：粒径150-200m，流速0.xml/min，分离时间数小时（依重力流动）tS第七页，共八十八页。7

用高压输液泵将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，经进样阀注入待测样品，由流动相带入柱内，在柱内各成分被分离后，依次进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析的方法称为高效液相色谱法（highperformanceliquidchromatography,HPLC)。17.1.3HPLC定义第八页，共八十八页。817.1.4现代高效液相色谱法的特点：(1)高效：(2)高压：HPLC工作压力高达20MPa-30MPa。(3)高速：分离一个样品只需几分钟至几十分钟。(4)高灵敏度：紫外检测器的检测限可达10－9g，荧光检测器的检测限可达10－12g。一般GC的填充色谱柱是数千塔板／米，高效液相色谱法的塔板数可达约8万塔板/米，使分离效率大大提高。第九页，共八十八页。9高效液相色谱法的优点是：

其缺点是：价格昂贵，要用各种填料柱，容量小，流动相消耗大且有毒性的居多。17.1.5高效液相色谱法的优、缺点检测的分辨率和灵敏度高，分析速度快，重复性好，定量精度高，应用范围广。适用于分析高沸点、大分子、强极性、具有生物活性、热稳定性差的化合物。第十页，共八十八页。10色谱分离的过程第十一页，共八十八页。1117.1.6样品分子在色谱柱中的分离过程第十二页，共八十八页。1217.1.6样品分子在色谱柱中的分离过程第十三页，共八十八页。13

色谱分离的实质是样品分子（即溶质）与溶剂（即流动相或洗脱液）以及固定相分子间的作用，作用力的大小，决定色谱过程的保留行为。17.1.7色谱分离的实质第十四页，共八十八页。1417.2高效液相色谱仪第十五页，共八十八页。1517.2高效液相色谱仪结构输液系统进样系统分离系统检测系统第十六页，共八十八页。1617.2高效液相色谱仪结构高效液相色谱仪结构示意图输液系统进样系统分离系统检测系统第十七页，共八十八页。1717.2高效液相色谱仪结构进样器贮液器高压泵色谱柱馏分收集器检测器记录仪输液系统进样系统分离系统检测系统第十八页，共八十八页。1817.2高效液相色谱仪结构进样器贮液器高压泵梯度洗脱装置色谱柱馏分收集器检测器记录仪高效液相色谱仪结构示意图输液系统进样系统分离系统检测系统第十九页，共八十八页。1917.2高效液相色谱仪结构17.2.1输液系统17.2.2进样系统

分离系统17.2.4

检测系统第二十页，共八十八页。2017.2高效液相色谱仪结构17.2.1输液系统高压输液泵在线脱气装置梯度洗脱装置第二十一页，共八十八页。2117.2.1高压输液泵作用：将流动相以稳定的流速或压力输送到色谱系统。输液泵的稳定性直接关系到分析结果的重复性和准确性。第二十二页，共八十八页。2217.2.1高压输液泵性能：⑴足够的输出压力⑵输出恒定的流量⑶输出流动相的流量范围可调节

⑷压力平稳,脉动小

第二十三页，共八十八页。2317.2.1高压输液泵注意事项：⑴防止任何固体颗粒进入泵体⑵流动相不应含有任何腐蚀性物质⑶泵工作时防止溶剂瓶流动相用完

⑷不要超过最高压力⑸流动相应先脱气第二十四页，共八十八页。24在线脱气、超声脱气、真空脱气等作用：脱去流动相中的溶解气体。流动相先经过脱气装置再输送到色谱柱。脱气不好时有气泡，导致流动相流速不稳定，造成基线飘移，噪音增加。O2,N2,CO2…17.2.1在线脱气装置第二十五页，共八十八页。2517.2.1梯度洗脱装置Isocraticelution恒定组成的单一溶剂体系Gradientelution以一定速度改变多种溶剂的配比淋洗，目的是分离多组容量因子相差较大的组分。High-PressureMixing作用:缩短分析时间,提高分离度,改善峰形,提高监测灵敏度第二十六页，共八十八页。26补充、液相色谱中的柱外谱带展宽色谱柱本身以外区域的谱带展宽，称为柱外谱带展宽。样品注入色谱柱后，在色谱柱以外的任何死空间（如进样器、柱接头、连接管和检测器）中，样品分子的扩散和滞留，都会引起色谱峰的扩展，而使柱效降低，所以柱外死体积影响是不能忽略的。第二十七页，共八十八页。27进样系统:密封性好，死体积小，重复性好1注射器进样装置优点：可以任意改变进样体积，注射快速,不易造成峰扩张。缺点：重现性较差，试液容易渗漏第二十八页，共八十八页。2817.2.2进样系统2高压定量进样阀(六通阀)优点：进样量的可变范围大，耐高压，易于自动化缺点：容易造成色谱峰扩张第二十九页，共八十八页。2917.2.2进样系统第三十页，共八十八页。30色谱柱

色谱柱是实现分离的核心部件。要求柱效高、柱容量大和性能稳定。柱性能与柱结构、填料特性、填充质量和使用条件有关。

17.2.3分离系统：色谱柱第三十一页，共八十八页。31常用内壁抛光过的不锈钢制成颗粒直径早期大（20~75μm），柱管径一般为2mm，柱长为50~100cm.近年来，用高效微型填料（3~10μm）管径为4~5mm，长为10cm~50cm的直形不锈钢柱。每米柱效可达8万塔板数第三十二页，共八十八页。32sphericalandirregularsilicaparticles

Macroporoussphericalsilicaparticle.[K.K.Unger,Poroussilica,Elsevier,1979]

基质：载体或担体。数m~数十m，球形。硅胶或有机高分子聚合物17.2.3分离系统：色谱柱填料第三十三页，共八十八页。33柱性能指标:柱压理论塔板高度H理论塔板数n对称因子f容量因子k选择性因子α分离度R第三十四页，共八十八页。3417.2.4检测系统检测器应具有：溶质性检测器有：紫外、荧光、电化学检测器等总体检测器有：示差折光、介电常数检测器等灵敏度高、噪音低、线性范围宽、响应快，死体积小、定量准确、适应范围广等特点，同时还应该对温度和载液流速的变化不敏感。第三十五页，共八十八页。35

紫外-可见检测器光源检测室光栅二极管阵列检测UVdetectorcell内容积：1-10l光路长：2-10mm第三十六页，共八十八页。3617.2.4荧光检测器特点：有非常高的灵敏度和良好的选择性，灵敏度要比紫外检测法高23个数量级，特别适合于药物和生物化学样品的分析。第三十七页，共八十八页。3717.2.4荧光检测器第三十八页，共八十八页。3817.2.4质谱检测器HPLC-ESI/MS第三十九页，共八十八页。3917.2.4数据处理

计算机进行峰面积的积分、分析结果的计算、误差的分析或色谱图的输出，记录的信号进行程序化、自动化处理。第四十页，共八十八页。40复习:高效液相色谱仪结构进样器贮液器高压泵色谱柱馏分收集器检测器记录仪输液系统进样系统分离系统检测系统第四十一页，共八十八页。4117.2MainstagesofHPLCanalysisPrepareSampleinjectintocolumnelutewithmobilephasedetectsamplecomponentsidentifyandquantify第四十二页，共八十八页。4217.2高效液相色谱仪的工作流程进样器贮液器高压泵梯度洗脱装置色谱柱馏分收集器检测器记录仪高效液相色谱仪结构示意图第四十三页，共八十八页。4317.2高效液相色谱仪的工作流程进样器贮液器高压泵梯度洗脱装置色谱柱馏分收集器检测器记录仪高效液相色谱仪结构示意图第四十四页，共八十八页。4417.2高效液相色谱仪的工作流程进样器贮液器高压泵梯度洗脱装置色谱柱馏分收集器检测器记录仪高效液相色谱仪结构示意图第四十五页，共八十八页。4517.2高效液相色谱仪的工作流程进样器贮液器高压泵梯度洗脱装置色谱柱馏分收集器检测器记录仪高效液相色谱仪结构示意图tS第四十六页，共八十八页。46第四十七页，共八十八页。47高效液相色谱的应用：

医药卫生、食品、

人体化学成分、各类合成药物成分、各种天然植物和动物药物化学成分。17.3高效液相色谱法的应用第四十八页，共八十八页。48高效液相色谱的应用：

医药卫生、食品、环保

等各个领域最为重要的分离分析技术。17.3高效液相色谱法的应用

有机酸、氨基酸、糖、维生素、脂肪酸、香料、甜味剂、防腐剂、人工色素、病原微生物、霉菌毒素等。第四十九页，共八十八页。49南京市儿童医院，徐进，儿科药学杂，1999年第5卷第2期色谱条件色谱条件:岛津LC—10AD高效液相色谱仪；RF一l0AxL荧光检测器，荧光激发波长360nm，发射波长430nm;LD一I0A泵，分析柱为SpherisorbODS5μm,200x4.6mm,预柱为WatersODS柱，室温;流动相为0.05mol/L磷酸盐缓冲液(pH=4.0):乙睛(78:22v/v)，内含0.05mol/L戊磺酸钠，流速为1ml/min17.3HPLC法测定人血浆中氨苄青霉素浓度第五十页，共八十八页。50样品分离良好，保留时间为7.3分钟

第五十一页，共八十八页。51取含有氨苄青霉素的血浆0.2m1.加人10%三氯醋酸0.2m1，涡旋振荡混匀，12000r/min离心10min，取上清液0.2m1于安瓿中，再加人0.5mol/L盐酸0.2m1，密封安瓿后置100℃水浴90min，冷却后再加人蒸馏水0.2m1,涡旋振荡混匀后，进样20微升测定。以外标法峰面积定量。

血样处理方法第五十二页，共八十八页。52HP1100型高效液相色谱仪色谱柱：Hypersil-ODS2-C18，4.6mmX250mm柱检测波长215nm，进样量20μL，流动相为甲醇+0.02mol/L乙酸铵(35+65)，流量0.50mL/min17.3HPLC法快速测定食品中糖精钠、苯甲酸、山梨酸

第五十三页，共八十八页。53第五十四页，共八十八页。54色谱图2:高良姜色谱图1diarylheptanoidA

2高良姜素3diarylheptanoidB第五十五页，共八十八页。55一、液相色谱的速率理论二、影响分离的因素补充高效液相色谱法第五十六页，共八十八页。56n为色谱柱的理论塔板数。因为tR是热力学常数，当色谱柱的长度一定，理论板数目n越大，色谱峰越窄。一、液相色谱的速率理论第五十七页，共八十八页。57液相色谱的速率方程为：D为扩散系数，Cd、

C’为有关项的板高系数，dp和df

为填充粒子直径和固定液膜的厚度一、液相色谱的速率理论第五十八页，共八十八页。58一、液相色谱的速率理论H∝d2p当粒度从45μm降至6μm时,板高要降低10倍。第五十九页，共八十八页。59二、影响分离的因素

速率方程：H=A+Cu故液相色谱H-u曲线与气相色谱的形状不同，如图

影响分离的主要因素有流动相的流量、性质和极性。第六十页，共八十八页。601.影响分离的因素——流速流速大于0.5cm/s时,H～u曲线是一段斜率不大的直线。降低流速，柱效提高不是很大。但在实际操作中，流量仍是一个调整分离度和出峰时间的重要可选择参数。第六十一页，共八十八页。612.固定相及分离柱选择短柱、细内径提高分析速度；研制高效柱填料是一活跃领域。第六十二页，共八十八页。623.流动相组成流动相按组成不同可分为单组分和多组分；按极性可分为极性、弱极性、非极性；按使用方式有等度洗脱和梯度洗脱。第六十三页，共八十八页。633.流动相组成常用溶剂:己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。第六十四页，共八十八页。644.选择流动相时应注意的几个问题：（1）尽量使用高纯度试剂作流动相。（2）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。（3）试样在流动相中应有适宜的溶解度。（4）流动相同时还应满足检测器的要求。第六十五页，共八十八页。65提高柱效的方法(降低板高)：①固定相填料要均一，颗粒细，装填均匀。②流动相粘度低。③低流速。④适当升高柱温。一、液相色谱的速率理论第六十六页，共八十八页。6617.4高效液相色谱法的主要类型17.4.1分配色谱17.4.2液固（吸附）色谱17.4.3离子交换色谱17.4.4尺寸排阻色谱第六十七页，共八十八页。6717.4高效液相色谱法的分离机理及分类

液相色谱的固定相可以是吸附剂、化学键合固定相（或在惰性载体表面涂上一层液膜）、离子交换树脂或多孔性凝胶；流动相是各种溶剂。被分离混合物由流动相液体推动进入色谱柱。根据各组分在固定相及流动相中的吸附能力、分配系数、离子交换作用或分子尺寸大小的差异进行分离。

第六十八页，共八十八页。6817.4高效液相色谱法的分离机理及分类吸附色谱分配色谱尺寸排斥色谱离子交换色谱吸附能，氢键疏水分配作用溶质分子大小库仑力

类型

主要分离机理第六十九页，共八十八页。691.吸附色谱（液-固吸附色谱）以固体吸附剂为固定相，如硅胶、氧化铝等，较常使用的是5～10μm的硅胶吸附剂。流动相可以是各种不同极性的一元或多元溶剂。2.分配色谱（液-液分配色谱）早期通过在担体上涂渍一薄层固定液制备固定相,现多为化学键合固定相，即用化学反应的方法通过化学键将固定液结合在担体表面。第七十页，共八十八页。703.离子交换色谱固定相为离子交换树脂，流动相为无机酸或无机碱的水溶液。各种离子根据它们与树脂上的交换基团的交换能力的不同而得到分离。4.凝胶色谱（空间排阻色谱）

以凝胶为固定相。凝胶是一种经过交联的、具有立体网状结构和不同孔径的多聚体的通称。如葡聚糖凝胶、琼脂糖等软质凝胶；多孔硅胶、聚苯乙烯凝胶等硬质凝胶；第七十一页，共八十八页。7117.4.1

分配色谱partitionchromatography

样品分子在流动相和固定相间的溶解度不同（分配作用）而实现分离的液相色谱分离模式优点：1.均一性和稳定性好2.不易流失3.柱效高4.重现性好5.流动相和固定相选择范围广6.分离性能好第七十二页，共八十八页。7217.4.1

分配色谱partitionchromatography液-液分配色谱：固定液易流失（物理吸附）liquid-liquid键合相色谱：化学键bondedphase第七十三页，共八十八页。7317.4.1

分配色谱partitionchromatography第七十四页，共八十八页。74OHOHOHOOO+C18H37SiCl3SiC18H37

分配色谱一、化学键合固定相第七十五页，共八十八页。75非极性键合固定相：键合在载体表面的功能分子是烷基（C8和C18）

、苯基等非极性有机分子。（极性很小）极性键合固定相：键合在载体表面的功能分子是具有丙氨基、二醇基、氰乙基、氨基等极性基团的有机分子。

分配色谱一、化学键合固定相如最常用的ODS（Octa-decyltrichloroSilane）柱或C18柱就是最典型的代表，其极性很小。第七十六页，共八十八页。76

分配色谱1.反相HPLC（reversedphaseHPLC）：非极性固定相：如ODS柱或C18柱等极性流动相：如水、甲醇、乙腈等2.正相HPLC（normalphaseHPLC）：极性固定相：

如氰乙基、氨基等非极性（或弱极性）流动相：如正己烷等第七十七页，共八十八页。77一般地，正相色谱是固定液的极性大于流动相的极性，而反相色谱是固定相的极性小于流动相的极性。正相色谱适宜于分离极性化合物，反相色谱则适宜于分离非极性或弱极性化合物。

分配色谱第七十八页，共八十八页。78二、固定相和流动相的选择各种分析物质功能基的极性按下列顺序增加：烷烃＜醚＜酯＜酮＜醛＜酰胺＜胺＜醇，水的极性最大。液相色谱中常用流动相的性质（表17-2）

分配色谱第七十九页，共八十八页。79举例：反相液相色谱法流动相的选择水甲醇或乙腈弱酸、弱碱或缓冲盐（PH:2~8）第八十页，共八十八页。802.选择色谱柱类型的方式：第一，固定相的极性与分析物质的极性粗略匹配，用极性明显不同的流动相洗脱；第二，流动相的极性与分析物质的极性相匹配，用极性明显不同的固定相；第三，固定相与分析物质的极性极为相似，仅由流动相极性差异使分析物质沿柱移动。

分配色谱二、固定