高效液相色谱分析(环境BG)解析课件

第三章

高效液相色谱分析3.1高效液相色谱仪2022/11/22第三章

高效液相色谱分析3.1高效液相色谱仪2022/113.1高效液相色谱法（HPLC）特点

高效液相色谱是一种以高压输出的液体为流动相的色谱技术，在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器。同气相色谱法（GC）相比，高效液相色谱法（HPLC）具有以下特点：GC只能分析气体和沸点较低的化合物；对于那些沸点高、热稳定性差、摩尔质量大的有机物，目前主要采用HPLC进行分析。GC的流动相是惰性气体，仅起运载作用；HPLC的流动相可选择不同极性的液体，对组分有一定的亲和力，可通过改变固定相和流动相提高HPLC的分离效率。GC一般在较高温度下进行分离和测定，其应用范围收到了很大的限制；HPLC一般在室温下进行分析，不受样品挥发性和高温下稳定性的限制注意：GC更快、更灵敏、更方便，而且耗费低，因此能用GC分析的样品一般不用HPLC。2022/11/223.1高效液相色谱法（HPLC）特点高效液相色谱是一种23.2高效液相色谱仪

高效液相色谱仪是由高压输液系统、进样系统、分离系统、和检测系统、数据记录与处理系统等五个主要部分构成，此外还配有辅助装置，如脱气机、梯度洗脱、自动进样等。其结构示意图如下：2022/11/223.2高效液相色谱仪高效液相色谱仪是由高压输液系统、进3高效液相色谱仪的结构和工作流程工作流程：高压泵将贮液瓶中的溶剂送入色谱柱中，然后从检测器的出口流出，当待测样品从注射器注入时，流经进样器的流动相将其带入色谱柱中进行分离，然后依次进入检测器，由记录仪将检测器送出的信号记录下来得到色谱图。2022/11/22高效液相色谱仪的结构和工作流程工作流程：高压泵将贮液瓶中的溶4一、高压输液系统由于HPLC所用的固定相颗粒极细，因此对流动相的阻力很大，为使流动相有较大的流速，必须配备高压输液系统。高压输液系统一般由贮液器、高压泵、脱气机、梯度洗脱等装置组成。2022/11/22一、高压输液系统由于HPLC所用的固定相颗粒极细，因此对流动51、溶剂脱气装置（脱气机）脱气装置的作用目的是：为了防止流动相从高压柱流出时，释放出的气泡（溶解在溶剂中的N2、O2等）进入检测器而使噪声剧增，甚至不能检测。溶剂脱气方式有氦气鼓泡、超声波脱气、真空脱气等。2、高压泵高压泵的作用：保证输出的流动相具有恒定的流速。高压泵输出流动相的压力，一般为150×105～350×105Pa，高压泵应无脉动或脉动极小。2022/11/221、溶剂脱气装置（脱气机）2022/10/2363、梯度洗脱梯度洗脱：流动相中含有两种或更多不同极性的溶剂，在分离过程中按一定的程序连续改变流动相中溶剂的配比和极性，通过流动相中极性的变化来改变被分离组分的容量因子k和选择性因子a，以提高分离效果。为什么要进行梯度洗脱？在进行多组分的复杂样品分离时，经常会碰到前面的一些成分分离不完全，而后面的一些成分分离度太大，且出峰时间很晚、峰形较差。为使保留值相差很大的多种成分在合理的时间内全部洗脱并达到分离且有良好的峰形，往往要用到梯度洗脱技术。其作用相当于气相色谱中的程序升温。2022/11/223、梯度洗脱2022/10/237根据溶剂的混合方式，可分为低压梯度和高压梯度。低压梯度：在常压下预先按一定的程序将溶剂用比例阀混合后再用泵输入色谱柱，也称为外梯度。优点：只需要一个单元泵，成本低，使用方便。高压梯度：将溶剂分别用高压泵增压后输入色谱系统的梯度混合室，加以混合后送入色谱柱，又称为内梯度。优点：通过梯度程序控制器控制每台单元泵的输出，就能获得任意形式的梯度曲线，而且精度高。缺点：需要两台或多台泵，成本高。2022/11/22根据溶剂的混合方式，可分为低压梯度和高压梯度。2022/1082022/11/222022/10/239进样口检测器色谱图色谱柱溶剂高压泵混合器二元泵高压洗脱系统2022/11/22进样口检测器色谱图色谱柱溶剂高压泵混合器二元泵高压洗脱系统210由一个单元泵和比例阀组成的四元梯度洗脱系统2022/11/22由一个单元泵和比例阀组成的四元梯度洗脱系统2022/10/211二、进样系统柱外展宽：指色谱柱外的因素引起的峰展宽，主要包括进样系统、连接管道及检测器中存在的死体积引起的峰展宽。柱外展宽可分为柱前展宽和柱后展宽。进样系统是引起柱前展宽的主要因素，因此对进样系统要求比较严格。进样要求：将试样“浓缩”地瞬时注入色谱柱上端柱担体的中心成一个小点。如果注入柱担体前的流动相中，通常会使溶质以扩散形式进入柱顶，会导致试样组分分离效能的降低进样装置一般有隔膜注射器进样、停流进样、高压定量进样阀和自动进样器进样。2022/11/22二、进样系统柱外展宽：指色谱柱外的因素引起的峰展宽，主要包括121、隔膜注射器进样与气相色谱类似。在色谱柱顶端装一耐压弹性隔膜，进样时用微量注射器刺穿隔膜将样品注入色谱柱。优点：装置简单、价廉、死体积小；缺点：允许进样量小，重现性差；不能承受高压，当压力超过150×105Pa后，由于密封垫的泄漏，带压进样实际上成为不可能。2022/11/221、隔膜注射器进样2022/10/23132、停流进样方法：打开流动相泄流阀，使柱前压力下降为零，注射器进样（同隔膜注射器进样法）后，关闭阀门使流动相压力恢复，把试样带入色谱柱。优点：停流后再进样，以防止泄漏，可用于高压。缺点：停流进样方式无法取得精确的保留时间，峰形的重现性亦较差。2022/11/222、停流进样2022/10/23143、高压定量进样阀（六通阀进样）六通阀进样是目前最常用的手动进样方式。2022/11/223、高压定量进样阀（六通阀进样）2022/10/2315特点：注射器要取比定量管容积大3~5倍的试样溶液，多余的试样通过连接6的管道溢出。由于进样可由定量管的体积严格控制，因此进样准确，重复性好，适用于定量分析，更换不同体积的定量管，可调整进样量。也可采用较大体积的进样管进少量试样，进样量由注射器控制。注意：六通阀的内部管道很细，样品液中绝不应带有固体微粒，以免堵塞通道；另外，样品液的浓度也不宜太高，以防止其在进样阀内结晶析出。应经常清洗进样阀的通道：阀的扳手放在进样位置，使冲洗液从废液口5流出。2022/11/22特点：2022/10/23164、自动进样器进样由计算机自动控制定量阀，按预先编制好的程序进样，可自动完成几十或上百个样品的分析。在进行大量样品的分析时，使用自动进样器操作可节省大量的人力和时间，但此装置成本高。2022/11/224、自动进样器进样2022/10/2317三、分离系统——色谱柱色谱柱包括柱管和固定相两部分。常用的标准柱型是内径为4.6mm或3.9mm，长度为15~30cm的直型不锈钢柱，填料颗粒度5~10mm。一个重要的发展趋势是减小填料颗粒度（3~5mm），以采用更短的柱（数厘米），加快分析速度。2022/11/22三、分离系统——色谱柱色谱柱包括柱管和固定相两部分。202218液相色谱柱的分离效能，主要取决于柱填料的性能和柱床的结构（柱子的装填）柱子的装填对柱效能影响很大，装柱方法有干法和湿法两种。干法：填料粒度大于20mm（和气相色谱法装料方法相同）湿法（匀浆法）：通常采用匀浆法填充HPLC色谱柱，先将填料配成悬浮液，在高压泵的作用下，快速将其压入装有洗脱液的色谱柱内，经冲洗后，即可备用。2022/11/22液相色谱柱的分离效能，主要取决于柱填料的性能和柱床的结构（柱19注意：色谱柱装填料之前是没有方向的，但装填好固定相后柱子是有方向的。使用时，应使流动相的方向与柱子的填充方向一致。通常在柱子的管外用箭头标示出流动相方向，安装色谱柱时应注意。2022/11/22注意：色谱柱装填料之前是没有方向的，但装填好固定相后柱子是有20四、检测系统液相色谱检测器有紫外光度检测器、荧光检测器、示差折光检测器、电导检测器、蒸发光散射检测器。应用最广泛的液相色谱检测器是紫外检测器和示差折光检测器。注意：液相色谱中，没有一个即通用，还可用于梯度洗脱的检测器。2022/11/22四、检测系统液相色谱检测器有紫外光度检测器、荧光检测器、示差211、紫外光度检测器HPLC中应用最广泛的一种检测器，有70%的样品可以使用这种检测器。原理：基于被分析试样组分对特定波长紫外线的选择性吸收，组分浓度与吸光度的关系遵守比尔定律。优点：灵敏度高，最小检测浓度可达10-9g·mL-1，对温度、流速不敏感、可用于梯度洗脱缺点：不适用于对紫外光完全不吸收的试样，溶剂的选用受限制（紫外光不透过的溶剂如苯等不能用）2022/11/221、紫外光度检测器2022/10/23222、荧光检测器原理：荧光检测器是利用某些样品具有荧光特性来检测的。许多有机化合物具有天然荧光活性，其中带有芳香基团的化合物具有荧光活性很强。在一定条件下，荧光强度与物质浓度成正比。特性：选择性强（适合于稠环芳烃、甾族化合物、酶、氨基酸、维生素、色素、蛋白质等荧光物质的测定）、对温度、流速不敏感，可用于梯度洗脱。优点：灵敏度高，检出限可达10-12~10-13g/mL，比紫外检测器高2~3个数量级。缺点：仅适用于发荧光的物质。2022/11/222、荧光检测器2022/10/23233、示差折光检测器借连续测定流通池中溶液折射率的方法来测定试样浓度。原理：溶液的折射率是纯溶剂（流动相）和纯溶质（试样）的折射率乘以各物质的浓度之和。因此溶有试样的流动相和纯流动相之间折射率之差，可表示试样在流动相中的浓度。优点：几乎各种物质都有各自不同的折射率，因此都可用示差折光检测器检测，是通用型的浓度型检测器。缺点：对温度变化敏感，不可用于梯度洗脱。2022/11/223、示差折光检测器2022/10/23244、电导检测器原理：根据物质在某些介质中解离后所产生电导变化来测定解离物质含量。电导检测器属电化学检测器，是离子色谱法中使用最广泛的检测器。5、蒸发光散射检测器蒸发光散射检测器是基于不挥发性溶质对光的散射现象，是一种通用性较强的检测器。2022/11/224、电导检测器2022/10/2325特点：与示差折光检测器相比，具有灵敏度高，响应信号不受溶剂和温度的影响，可用于梯度洗脱。但不宜采用非挥发性缓冲溶液为流动相。应用：广泛用于检测糖类、表面活性剂、聚合物、酯类等无紫外吸收或紫外吸收系数较小的物质。此外，蒸发光散射检测器的响应值与试样质量成正比，即对所有样品的响应因子接近一致，因此可以在没有标准品的情况下，采用内标法测定未知物的近似含量。。2022/11/22特点：与示差折光检测器相比，具有灵敏度高，响应信号不受溶剂和26第三章

高效液相色谱分析3.3高效液相色谱法的主要类型及其分离原理2022/11/22第三章

高效液相色谱分析3.3高效液相色谱法的主要类型及271、液液分配色谱法及化学键合液相色谱概述：固定相和流动相均为液体（互不相溶）基本原理：组分在固定相和流动相上的分配（同气相色谱）分配系数液液分配色谱与气液分配色谱相似之处分离的顺序取决于分配系数的大小，分配系数大的组分保留值大，出峰晚

液液分配色谱与气液分配色谱不同之处气相色谱中流动相的性质对分配系数影响不大，而液相色谱法中流动相的种类对分配系数却有较大的影响2022/11/221、液液分配色谱法及化学键合液相色谱2022/10/2328在液液色谱中，为防止固定液的流失，一般亲水性固定液采用疏水性流动相，疏水性固定液采用亲水性流动相。正相色谱法：固定相的极性大于流动性的极性，样品中极性小的组分先流出，极性大的组分后流出反相色谱法：固定相的极性小于流动性的极性，样品中极性大的组分先流出，极性小的组分后流出化学键合固定相：为了更好的解决固定液从载体上流失的问题，将各种不同的有机基团通过化学反应共价键健合到硅胶（担体）表面的游离羟基上，代替机械涂渍的液体固定相，从而产生了化学键合固定相，是目前液相色谱法应用最广泛的一个分支。2022/11/22在液液色谱中，为防止固定液的流失，一般亲水性固定液采用疏水性292、液固色谱法概述：流动相为液体，固定相为吸附剂。基本原理：其作用机制是溶质分子（X）和溶剂分子（S）对吸附剂活性表面的竞争吸附。常用的固体吸附剂，如硅胶，氧化铝等。较常用的是5~10mm的硅胶吸附剂。适用：分离相对分子质量中等的油溶性试样，对具有不同官能团的化合物和异构体有较高的选择性。缺点：非线性等温吸附引起峰的拖尾现象。2022/11/222、液固色谱法2022/10/23303、离子对色谱法各种强极性的有机酸、有机碱的分离分析是液相色谱法中的重要课题，用吸附或分配色谱一般需要强极性的洗脱液，并容易发生严重的拖尾现象，利用离子交换色谱需要选择合适的pH条件，此外以高分子材料为基体的树脂填料一般不能承受高压，传质性能也较差。若用离子对色谱法，则分离效能高，分析速度快，操作简便。2022/11/223、离子对色谱法2022/10/2331基本原理：将一种（或多种）与溶质分子电荷相反的离子（称为对离子或反离子）加到流动相或固定相中，使其与溶质离子结合成疏水型离子对化合物，从而控制溶质离子的保留行为对离子（反离子）：用于阴离子分离的对离子是烷基铵类，如氢氧化四丁基铵、氢氧化十六烷基三甲铵等；用于阳离子的对离子是烷基磺酸类，如己烷磺酸钠等。2022/11/22基本原理：将一种（或多种）与溶质分子电荷相反的离子（称为对离32理论依据（以反相离子对色谱法为例）：X+——待分离的有机离子，Y-——带反电荷的对离子对离子的浓度是控制反相离子对色谱溶质保留值的主要因素，可在较大范围内改变分离的选择性；平衡常数取决于对离子和有机相的性质。2022/11/22理论依据（以反相离子对色谱法为例）：对离子的浓度是控制反相离33分类根据流动相和固定相的性质可分为正相离子对色谱法和反相离子对色谱法。在反相离子对色谱法中（更为常用的离子对色谱法），采用：非极性的疏水固定相，含有对离子的甲醇—水（或乙腈—水）作为极性流动相。注意：对离子浓度是控制反相离子对色谱溶质保留值的主要因素，可在较大范围内改变分离的选择性。2022/11/22分类2022/10/2334适用：各种强极性的有机酸、有机碱；特别是反相离子对色谱法解决了以往难分离混合物的分离问题，诸如酸、碱和离子、非离子的混合物，特别是一些生化试样如核酸、核苷、儿茶酚胺、生物碱以及药物等的分离。另外：借助离子对的生成给试样引入紫外吸收或发荧光的基团，提高检测的灵敏度。2022/11/22适用：各种强极性的有机酸、有机碱；2022/10/23354、离子交换色谱法是利用离子交换原理和液相色谱技术的结合来测定溶液中阳离子和阴离子的一种分离分析方法．基本原理：以离子交换树脂为固定相，其上可解离的离子与流动相中具有相同电荷的溶质离子进行可逆交换，根据这些离子对交换剂具有不同的亲和力而将它们分离。亲和力大，保留时间长，出峰晚。适用：凡在溶剂中能够电离的物质（无机和有机阴阳离子）通常都可以用离子交换色谱法来进行分离。2022/11/224、离子交换色谱法2022/10/23365、离子色谱法产生背景：离子交换色谱淋洗液几乎都是强电解质，电导比待测离子高两个数量级，电导检测器难以检测。多数无机离子没有紫外吸收，不能检测。1975年，美国DowChemical公司H.Small等人引入抑制柱（SuppressorColumn).

分离柱+抑制柱+电导检测器=离子色谱双柱离子色谱2022/11/225、离子色谱法产生背景：1975年，美国DowChemic37基本原理：以离子交换树脂为固定相，电解质溶液为流动相，利用离子交换原理连续对共存的多种阴离子或阳离子进行分离后，导入检测装置进行分析测量。通常以电导检测器为通用检测器，为消除流动相中强电解质背景离子对电导检测器的干扰，设置了抑制柱。双柱离子交换色谱仪结构：输液系统（淋洗液贮器、高压泵）→进样系统→分离系统（分离柱）→检测系统（抑制柱、检测器）→数据处理记录系统（记录仪、积分仪、计算机）2022/11/22基本原理：以离子交换树脂为固定相，电解质溶液为流动相，利用离38离子色谱仪器淋洗液

泵色谱柱检测器

泵液分离

检测

记录F-NO3-SO42-Cl-NO2-Br-HPO42-进样阀抑制器检测池进样2022/11/22离子色谱仪器淋洗液泵色谱柱检测器泵液分离检测记录F-39分离柱：填充低容量同性离子交换树脂；如分析阴离子则装填低容量R—OH，分析阳离子则装填低容量R—H作用：是基于低容量离子交换树脂对不同的同性离子的亲和力不同而使之彼此分开抑制柱：填充高容量异性离子交换树脂；如分析阴离子则装填高容量R—H，分析阳离子则装填高容量R—OH作用：削减洗脱液造成的本底电导，提高被测组分的灵敏度2022/11/22分离柱：填充低容量同性离子交换树脂；如分析阴离子则装填低容量40抑制器的作用废液BackGround：Na2CO3/NaHCO3

(700μS)NaF,NaCl,NaNO3Na2HPO4,Na2SO4～～RetentiontimeConductivityNaFNaClNaNO3Na2HPO4Na2SO4BackGround：Na2CO3/NaHCO3

(700μS)～～RetentiontimeConductivityHFHClHNO3H3PO4H2SO4RetentiontimeBackGround：H2CO3(15μS)Conductivity分离柱：ROH；分离NaF、NaCl、NaNO3、Na2HPO4、Na2SO4抑制柱：RH；H+与洗脱液（NaHCO3、Na2CO3）中和，降低背景电导2022/11/22抑制器的作用废液BackGround：Na2CO3/41以分析阴离子为例，说明为什么要加抑制柱？当待测阴离子从柱中被洗脱下来进入电导池时，要求能检测出洗脱液中电导的改变，但洗脱液中的氢氧根浓度要比试样中的阴离子浓度大得多才能使分离柱正常工作，因此与洗脱液的电导值相比，由于试样进入洗脱液而引起的电导改变就非常小，结果是用电导检测器直接测定试样中的阴离子灵敏度极差，故需加抑制柱以消除洗脱液的本底电导以提高待测离子的检测灵敏度。2022/11/22以分析阴离子为例，说明为什么要加抑制柱？2022/10/2342适用：水溶液中阴离子分析的最佳方法，是目前唯一快速、灵敏和准确的多组分分析的方法；应用范围也在扩散，从无机和有机阴离子到金属阳离子，从有机阳离子到糖类、氨基酸、核苷酸等均可用离子色谱法进行分析。单柱型离子色谱法：如果采用低电导洗脱液（如苯甲酸盐或邻苯二甲酸盐等稀溶液），不仅能有效分离、洗脱各个阴离子，而且背景电导较低，不需抑制柱，称为单柱型离子色谱法。2022/11/22适用：水溶液中阴离子分析的最佳方法，是目前唯一快速、灵敏和准436、排阻色谱色谱

size-exclusionchromatography

固定相：凝胶(具有一定大小孔隙分布)；

原理：按分子大小分离。小分子可以扩散到凝胶空隙，由其中通过，出峰最慢；中等分子只能通过部分凝胶空隙，中速通过；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶剂分子小，故在最后出峰。全部在死体积前出峰；可对相对分子质量在100-105范围内的化合物按质量分离2022/11/226、排阻色谱色谱

size-exclusionchro44固定相：凝胶（具有一定大小孔隙分布）流动相：水（凝胶过滤色谱）、有机溶剂（凝胶渗透色谱）特点：溶剂分子通常是非常小，它们最后被洗脱，故试样峰全部在溶剂的保留时间（死时间tM）前出峰，它们在柱内停留时间短，故柱内峰扩展比其它分离方法小得多，所得峰较窄，利于检测适用：分离相对分子量大的化合物（约为2000以上）；在合适的条件下，也可分离相对分子量小至100的化合物，故相对分子量为100~8×105的任何类型的化合物，只要在流动相中是可溶的，都可用排阻色谱法进行分离。2022/11/22固定相：凝胶（具有一定大小孔隙分布）2022/10/2345局限性：不能分离大小相似、相对分子质量接近的分子，例如异构体等。只能分离相对分子质量差别在10%以上的分子。另外：对于一些高聚物，由于其组分相对分子量的变化是连续的，虽然不能用排阻色谱进行分离，但可测定其相对分子质量的分布（分级）情况，这正是我们想知道的。2022/11/22局限性：不能分离大小相似、相对分子质量接近的分子，例如异构体467、亲和色谱(AC)

Affinitychromatograph

原理：利用生物大分子和固定相表面存在的某种特异性亲和力，进行选择性分离。

先在载体表面键合上一种具有一般反应性能的所谓间隔臂(环氧、联胺等)，再连接上配基(酶、抗原等)，这种固载化的配基将只能和具有亲和力特性吸附的生物大分子作用而被保留。改变淋洗液后洗脱。2022/11/227、亲和色谱(AC)

Affinitychromato47离子与非离子酸性液相色谱分离方法选择分子量<2000水溶性化合物分子量>2000水不溶性化合物不离解离解分子量较大的酚、醚、胺非水溶性高聚物水溶性高聚物分子尺寸不同碱性分配性能有差异多官能团反相离子对色谱阴离子交换色谱阳离子交换色谱凝胶过滤色谱液－液分配色谱吸附色谱凝胶渗透色谱凝胶过滤色谱凝胶渗透色谱非极性极性反相色谱正相色谱2022/11/22离子与非离子酸性液相色谱分离方法选择分子量<2000水溶48第三章

液相色谱分析法3.4

液相色谱的固定相highperformanceliquidchromatographstationaryphaseofHPLC2022/11/22第三章

液相色谱分析法3.4

液相色谱的固定相highpe49一、液相色谱固定相

stationaryphasesofLC

1.液-液色谱法、键合相色谱法及离子对色谱法固定相（1）全多孔型担体

由氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多孔球体；早期采用100μm的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳已不多见；现采用10μm以下的小颗粒，化学键合制备柱填料；（2）表层多孔型担体（薄壳型微珠担体）

30～40μm的玻璃微球，表面附着一层厚度为1～2μm的多孔硅胶。表面积小，柱容量底；2022/11/22一、液相色谱固定相

stationaryp50（3）化学键合固定相化学键合固定相:目前应用最广、性能最佳的固定相；

a.硅氧碳键型：≡Si—O—C（常用、见图）

b.硅氧硅碳键型：≡Si—O—Si—C

稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广；

c.硅碳键型：≡Si—C

d.硅氮键型：≡Si—N2022/11/22（3）化学键合固定相化学键合固定相:目前应用51化学键合固定相的特点（1）传质快，表面无深液坑，比一般液体固定相传质快；（2）寿命长，化学键合，无固定液流失，耐流动相冲击；（3）选择性好，可键合不同官能团，提高选择性，应用于多种色谱类型及试样的分析；（5）有利于梯度洗脱；存在着双重分离机制：(键合基团的覆盖率决定分离机理)高覆盖率：分配为主；低覆盖率：吸附为主；

2022/11/22化学键合固定相的特点（1）传质快，表面无深液坑，比一般液体固522.液-固吸附分离固定相

种类：硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等；结构类型：全多孔型和薄壳型；粒度：5～10μm；

2022/11/222.液-固吸附分离固定相种类：硅胶、氧化铝、分533.离子交换色谱分离固定相结构类别：（1）薄壳型离子交换树脂薄壳玻璃珠为担体，表面涂约1%的离子交换树脂；（2）离子交换键合固定相薄壳键合型；微粒硅胶键合型（键合离子交换基团）

树脂类别：（1）阳离子交换树脂（强酸性、弱酸性）（2）阴离子交换树脂（强碱性、弱碱性）2022/11/223.离子交换色谱分离固定相结构类别：2022/1544.空间排阻分离固定相（1）软质凝胶葡聚糖凝胶、琼脂凝胶等。多孔网状结构；水为流动相。适用于常压排阻分离。（2）半硬质凝胶苯乙烯-二乙烯基苯交联共聚物，有机凝胶；非极性有机溶剂为流动相，不能用丙酮、乙醇等极性溶剂（3）硬质凝胶多孔硅胶、多孔玻珠等；化学稳定性、热稳定性好、机械强度大，流动相性质影响小，可在较高流速下使用。可控孔径玻璃微球，具有恒定孔径和窄粒度分布。2022/11/224.空间排阻分离固定相（1）软质凝胶2022/10/23553.5液相色谱的流动相

mobilephasesofLC1.流动相特性

（1）液相色谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱剂。流动相组成改变，极性改变，可显著改变组分分离状况；（2）亲水性固定液常采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定相的极性，称为正相液液色谱法，极性柱也称正相柱。（3）若流动相的极性大于固定液的极性，则称为反相液液色谱，非极性柱也称为反相柱。组分在两种类型分离柱上的出峰顺序相反。2022/11/223.5液相色谱的流动相

mobileph562.流动相类别

按流动相组成分：单组分和多组分；

按极性分：极性、弱极性、非极性；

按使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗。

常用溶剂：己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。2022/11/222.流动相类别按流动相组成分：单组分和多573.流动相选择

在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。采用正相液-液分配分离时：首先选择中等极性溶剂，若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加。也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使保留时间缩短。

常用溶剂的极性顺序：水(最大)>甲酰胺>乙腈>甲醇>乙醇>丙醇>丙酮>二氧六环>四氢呋喃>甲乙酮>正丁醇>乙酸乙酯>乙醚>异丙醚>二氯甲烷>氯仿>溴乙烷>苯>四氯化碳>二硫化碳>环己烷>己烷>煤油(最小)2022/11/223.流动相选择在选择溶剂时，溶剂的极性是选584.选择流动相时应注意的几个问题（1）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。（2）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。（3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积。（4）溶剂的黏度小些为好，否则会降低试样的扩散系数，造成传质速率缓慢，柱效下降。同时，在同一温度下，柱压随溶剂黏度增加而增加。（5）流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。2022/11/224.选择流动相时应注意的几个问题（1）尽量使用高纯度试剂作59第五章

高效液相色谱法5.2液相色谱中的固定相和流动相2022/11/22第五章

高效液相色谱法5.2液相色谱中的固定相和流动相2060一、固定相高效液相色谱中的固定相主要采用了8~10mm的微粒固定相，使用微粒填料有利于减小涡流扩散，缩短溶质在两相间的传质过程，提高色谱柱的分离效率。高效液相色谱柱的固定相填料可按材料、性质和形状进行分类：1、按固相材料的刚性程度分类：刚性固体、硬质凝胶刚性固体：以硅胶为基体，能承受较高的压力，可应用于任何一种液相色谱方法。可作为液固色谱的固定相，也可作为液相色谱的担体，还可用于化学键和相色谱的基质材料等。硬质凝胶：由聚苯乙烯与二乙烯苯交联而成的略具弹性的多孔颗粒，根据它在高压下弹性形变程度的大小不同，选择在不同压力下使用，这类固定相只应用于离子交换色谱和凝胶色谱中。2022/11/22一、固定相高效液相色谱中的固定相主要采用了8~10mm的微粒612、按固相填料的疏松程度分类：薄壳型微珠载体、全多孔型载体薄壳型微珠载体：在玻璃珠上沉积一层活性材料，如硅胶、氧化铝或分子筛等。也称为表面多孔型载体，其特点：①多孔层厚度小、孔浅、柱效能高；②分配过程在载体表面进行，出峰快；③颗粒大，装柱容易，适合常规分析；④但最大运行进样量因表面积较小而受到限制。全多孔型载体：用硅胶、氧化铝或硅藻土的微粒凝聚而成。其特点：颗粒较细，整个微粒全都是多孔性物质，表面积大，负荷量大。由于组分进入颗粒内部，所以会引起峰加宽和拖尾现象。且颗粒形状不均匀，柱效能没有均匀的球形高。但由于其颗粒细，孔浅、传质速度快、所以仍能实现高速、高效分离，适合于复杂混合物分离和痕量分析。2022/11/222、按固相填料的疏松程度分类：薄壳型微珠载体、全多孔型载体2623、根据固定相的几何形状分类：球形、无定形球形载体的渗透性是无定形的两倍。球形载体在装填时，容易做到均匀装柱，因此它的柱效能比无定形的高无定形载体在装柱后的结构没有填充良好的球形载体的结构稳定，因而在高压下使用一段时间后，常常出现柱效能降低的现象。对于液液色谱来说，固定相由固定液和载体构成，其表面积的大小决定了涂渍固定液的多少。可供选择的固定液很多，但许多固定液常被溶剂流动相所溶解，因此具有实用价值的固定液并不多。4、化学键和固定相是通过化学键和的方式把有机分子结合到载体表面，形成一种新型固定相，它可以避免因机械涂布固定液，导致色谱分离中使固定液流失的缺陷。2022/11/223、根据固定相的几何形状分类：球形、无定形2022/10/263一、流动相液相色谱中的流动相，又称冲洗剂、洗脱剂。它有两个作用：一是携带样品前进；二是给样品一个分配相，进而条件选择性，以达到混合物的分离。与气相色谱相比，液相色谱可供选择的流动相溶剂要多得多，不仅使用纯溶剂，还可使用混合溶剂。因而流动相的性质、组成对柱效能、选择性的影响很大，通过改善溶剂的性质及组成可以提高HPLC的分离度及分析速度。2022/11/22一、流动相液相色谱中的流动相，又称冲洗剂、洗脱剂。它有两个作64流动相应满足以下要求：合适的溶解力与极性。对于待测样品，流动相溶剂必须有良好的选择性和合适的极性，同时要有一定的溶解能力，且对固定液的溶解度尽可能小；化学稳定性好，与固定相和被测组分不发生化学反应；与检测器相匹配。紫外吸收检测器是液相色谱中应用最广泛的检测器，因此，流动相应当在使用的紫外波长下没有吸收或吸收很小。而当使用示差折光检测器时，应选择折射率与样品中组分的折射率有尽可能大的差别的流动相，以提高灵敏度。溶剂的纯度要高，纯度不高时会导致基线不稳定和产生干扰等。实验中至少使用分析纯试剂，一般使用色谱纯试剂。溶剂的流动性要好，黏度要低。流动相粘度大，一方面液相传质慢，柱效能低；令一方面柱压降增加。因此应选择低沸点的溶剂，但黏度过低又常常会在色谱柱内形成气泡，影响分离。2022/11/22流动相应满足以下要求：2022/10/2365酸性液相色谱分离方法选择分子量<2000水溶性化合物分子量>2000水不溶性化合物不离解离解分子量较大的酚、醚、胺非水溶性高聚物水溶性高聚物分子尺寸不同碱性分配性能有差异多官能团阴离子交换色谱阳离子交换色谱凝胶过滤色谱液－液分配色谱吸附色谱凝胶渗透色谱凝胶过滤色谱凝胶渗透色谱非极性极性反相色谱正相色谱2022/11/22酸性液相色谱分离方法选择分子量<2000水溶性化合物分子66第三章

高效液相色谱分析3.1高效液相色谱仪2022/11/22第三章

高效液相色谱分析3.1高效液相色谱仪2022/1673.1高效液相色谱法（HPLC）特点

高效液相色谱是一种以高压输出的液体为流动相的色谱技术，在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器。同气相色谱法（GC）相比，高效液相色谱法（HPLC）具有以下特点：GC只能分析气体和沸点较低的化合物；对于那些沸点高、热稳定性差、摩尔质量大的有机物，目前主要采用HPLC进行分析。GC的流动相是惰性气体，仅起运载作用；HPLC的流动相可选择不同极性的液体，对组分有一定的亲和力，可通过改变固定相和流动相提高HPLC的分离效率。GC一般在较高温度下进行分离和测定，其应用范围收到了很大的限制；HPLC一般在室温下进行分析，不受样品挥发性和高温下稳定性的限制注意：GC更快、更灵敏、更方便，而且耗费低，因此能用GC分析的样品一般不用HPLC。2022/11/223.1高效液相色谱法（HPLC）特点高效液相色谱是一种683.2高效液相色谱仪

高效液相色谱仪是由高压输液系统、进样系统、分离系统、和检测系统、数据记录与处理系统等五个主要部分构成，此外还配有辅助装置，如脱气机、梯度洗脱、自动进样等。其结构示意图如下：2022/11/223.2高效液相色谱仪高效液相色谱仪是由高压输液系统、进69高效液相色谱仪的结构和工作流程工作流程：高压泵将贮液瓶中的溶剂送入色谱柱中，然后从检测器的出口流出，当待测样品从注射器注入时，流经进样器的流动相将其带入色谱柱中进行分离，然后依次进入检测器，由记录仪将检测器送出的信号记录下来得到色谱图。2022/11/22高效液相色谱仪的结构和工作流程工作流程：高压泵将贮液瓶中的溶70一、高压输液系统由于HPLC所用的固定相颗粒极细，因此对流动相的阻力很大，为使流动相有较大的流速，必须配备高压输液系统。高压输液系统一般由贮液器、高压泵、脱气机、梯度洗脱等装置组成。2022/11/22一、高压输液系统由于HPLC所用的固定相颗粒极细，因此对流动711、溶剂脱气装置（脱气机）脱气装置的作用目的是：为了防止流动相从高压柱流出时，释放出的气泡（溶解在溶剂中的N2、O2等）进入检测器而使噪声剧增，甚至不能检测。溶剂脱气方式有氦气鼓泡、超声波脱气、真空脱气等。2、高压泵高压泵的作用：保证输出的流动相具有恒定的流速。高压泵输出流动相的压力，一般为150×105～350×105Pa，高压泵应无脉动或脉动极小。2022/11/221、溶剂脱气装置（脱气机）2022/10/23723、梯度洗脱梯度洗脱：流动相中含有两种或更多不同极性的溶剂，在分离过程中按一定的程序连续改变流动相中溶剂的配比和极性，通过流动相中极性的变化来改变被分离组分的容量因子k和选择性因子a，以提高分离效果。为什么要进行梯度洗脱？在进行多组分的复杂样品分离时，经常会碰到前面的一些成分分离不完全，而后面的一些成分分离度太大，且出峰时间很晚、峰形较差。为使保留值相差很大的多种成分在合理的时间内全部洗脱并达到分离且有良好的峰形，往往要用到梯度洗脱技术。其作用相当于气相色谱中的程序升温。2022/11/223、梯度洗脱2022/10/2373根据溶剂的混合方式，可分为低压梯度和高压梯度。低压梯度：在常压下预先按一定的程序将溶剂用比例阀混合后再用泵输入色谱柱，也称为外梯度。优点：只需要一个单元泵，成本低，使用方便。高压梯度：将溶剂分别用高压泵增压后输入色谱系统的梯度混合室，加以混合后送入色谱柱，又称为内梯度。优点：通过梯度程序控制器控制每台单元泵的输出，就能获得任意形式的梯度曲线，而且精度高。缺点：需要两台或多台泵，成本高。2022/11/22根据溶剂的混合方式，可分为低压梯度和高压梯度。2022/10742022/11/222022/10/2375进样口检测器色谱图色谱柱溶剂高压泵混合器二元泵高压洗脱系统2022/11/22进样口检测器色谱图色谱柱溶剂高压泵混合器二元泵高压洗脱系统276由一个单元泵和比例阀组成的四元梯度洗脱系统2022/11/22由一个单元泵和比例阀组成的四元梯度洗脱系统2022/10/277二、进样系统柱外展宽：指色谱柱外的因素引起的峰展宽，主要包括进样系统、连接管道及检测器中存在的死体积引起的峰展宽。柱外展宽可分为柱前展宽和柱后展宽。进样系统是引起柱前展宽的主要因素，因此对进样系统要求比较严格。进样要求：将试样“浓缩”地瞬时注入色谱柱上端柱担体的中心成一个小点。如果注入柱担体前的流动相中，通常会使溶质以扩散形式进入柱顶，会导致试样组分分离效能的降低进样装置一般有隔膜注射器进样、停流进样、高压定量进样阀和自动进样器进样。2022/11/22二、进样系统柱外展宽：指色谱柱外的因素引起的峰展宽，主要包括781、隔膜注射器进样与气相色谱类似。在色谱柱顶端装一耐压弹性隔膜，进样时用微量注射器刺穿隔膜将样品注入色谱柱。优点：装置简单、价廉、死体积小；缺点：允许进样量小，重现性差；不能承受高压，当压力超过150×105Pa后，由于密封垫的泄漏，带压进样实际上成为不可能。2022/11/221、隔膜注射器进样2022/10/23792、停流进样方法：打开流动相泄流阀，使柱前压力下降为零，注射器进样（同隔膜注射器进样法）后，关闭阀门使流动相压力恢复，把试样带入色谱柱。优点：停流后再进样，以防止泄漏，可用于高压。缺点：停流进样方式无法取得精确的保留时间，峰形的重现性亦较差。2022/11/222、停流进样2022/10/23803、高压定量进样阀（六通阀进样）六通阀进样是目前最常用的手动进样方式。2022/11/223、高压定量进样阀（六通阀进样）2022/10/2381特点：注射器要取比定量管容积大3~5倍的试样溶液，多余的试样通过连接6的管道溢出。由于进样可由定量管的体积严格控制，因此进样准确，重复性好，适用于定量分析，更换不同体积的定量管，可调整进样量。也可采用较大体积的进样管进少量试样，进样量由注射器控制。注意：六通阀的内部管道很细，样品液中绝不应带有固体微粒，以免堵塞通道；另外，样品液的浓度也不宜太高，以防止其在进样阀内结晶析出。应经常清洗进样阀的通道：阀的扳手放在进样位置，使冲洗液从废液口5流出。2022/11/22特点：2022/10/23824、自动进样器进样由计算机自动控制定量阀，按预先编制好的程序进样，可自动完成几十或上百个样品的分析。在进行大量样品的分析时，使用自动进样器操作可节省大量的人力和时间，但此装置成本高。2022/11/224、自动进样器进样2022/10/2383三、分离系统——色谱柱色谱柱包括柱管和固定相两部分。常用的标准柱型是内径为4.6mm或3.9mm，长度为15~30cm的直型不锈钢柱，填料颗粒度5~10mm。一个重要的发展趋势是减小填料颗粒度（3~5mm），以采用更短的柱（数厘米），加快分析速度。2022/11/22三、分离系统——色谱柱色谱柱包括柱管和固定相两部分。202284液相色谱柱的分离效能，主要取决于柱填料的性能和柱床的结构（柱子的装填）柱子的装填对柱效能影响很大，装柱方法有干法和湿法两种。干法：填料粒度大于20mm（和气相色谱法装料方法相同）湿法（匀浆法）：通常采用匀浆法填充HPLC色谱柱，先将填料配成悬浮液，在高压泵的作用下，快速将其压入装有洗脱液的色谱柱内，经冲洗后，即可备用。2022/11/22液相色谱柱的分离效能，主要取决于柱填料的性能和柱床的结构（柱85注意：色谱柱装填料之前是没有方向的，但装填好固定相后柱子是有方向的。使用时，应使流动相的方向与柱子的填充方向一致。通常在柱子的管外用箭头标示出流动相方向，安装色谱柱时应注意。2022/11/22注意：色谱柱装填料之前是没有方向的，但装填好固定相后柱子是有86四、检测系统液相色谱检测器有紫外光度检测器、荧光检测器、示差折光检测器、电导检测器、蒸发光散射检测器。应用最广泛的液相色谱检测器是紫外检测器和示差折光检测器。注意：液相色谱中，没有一个即通用，还可用于梯度洗脱的检测器。2022/11/22四、检测系统液相色谱检测器有紫外光度检测器、荧光检测器、示差871、紫外光度检测器HPLC中应用最广泛的一种检测器，有70%的样品可以使用这种检测器。原理：基于被分析试样组分对特定波长紫外线的选择性吸收，组分浓度与吸光度的关系遵守比尔定律。优点：灵敏度高，最小检测浓度可达10-9g·mL-1，对温度、流速不敏感、可用于梯度洗脱缺点：不适用于对紫外光完全不吸收的试样，溶剂的选用受限制（紫外光不透过的溶剂如苯等不能用）2022/11/221、紫外光度检测器2022/10/23882、荧光检测器原理：荧光检测器是利用某些样品具有荧光特性来检测的。许多有机化合物具有天然荧光活性，其中带有芳香基团的化合物具有荧光活性很强。在一定条件下，荧光强度与物质浓度成正比。特性：选择性强（适合于稠环芳烃、甾族化合物、酶、氨基酸、维生素、色素、蛋白质等荧光物质的测定）、对温度、流速不敏感，可用于梯度洗脱。优点：灵敏度高，检出限可达10-12~10-13g/mL，比紫外检测器高2~3个数量级。缺点：仅适用于发荧光的物质。2022/11/222、荧光检测器2022/10/23893、示差折光检测器借连续测定流通池中溶液折射率的方法来测定试样浓度。原理：溶液的折射率是纯溶剂（流动相）和纯溶质（试样）的折射率乘以各物质的浓度之和。因此溶有试样的流动相和纯流动相之间折射率之差，可表示试样在流动相中的浓度。优点：几乎各种物质都有各自不同的折射率，因此都可用示差折光检测器检测，是通用型的浓度型检测器。缺点：对温度变化敏感，不可用于梯度洗脱。2022/11/223、示差折光检测器2022/10/23904、电导检测器原理：根据物质在某些介质中解离后所产生电导变化来测定解离物质含量。电导检测器属电化学检测器，是离子色谱法中使用最广泛的检测器。5、蒸发光散射检测器蒸发光散射检测器是基于不挥发性溶质对光的散射现象，是一种通用性较强的检测器。2022/11/224、电导检测器2022/10/2391特点：与示差折光检测器相比，具有灵敏度高，响应信号不受溶剂和温度的影响，可用于梯度洗脱。但不宜采用非挥发性缓冲溶液为流动相。应用：广泛用于检测糖类、表面活性剂、聚合物、酯类等无紫外吸收或紫外吸收系数较小的物质。此外，蒸发光散射检测器的响应值与试样质量成正比，即对所有样品的响应因子接近一致，因此可以在没有标准品的情况下，采用内标法测定未知物的近似含量。。2022/11/22特点：与示差折光检测器相比，具有灵敏度高，响应信号不受溶剂和92第三章

高效液相色谱分析3.3高效液相色谱法的主要类型及其分离原理2022/11/22第三章

高效液相色谱分析3.3高效液相色谱法的主要类型及931、液液分配色谱法及化学键合液相色谱概述：固定相和流动相均为液体（互不相溶）基本原理：组分在固定相和流动相上的分配（同气相色谱）分配系数液液分配色谱与气液分配色谱相似之处分离的顺序取决于分配系数的大小，分配系数大的组分保留值大，出峰晚

液液分配色谱与气液分配色谱不同之处气相色谱中流动相的性质对分配系数影响不大，而液相色谱法中流动相的种类对分配系数却有较大的影响2022/11/221、液液分配色谱法及化学键合液相色谱2022/10/2394在液液色谱中，为防止固定液的流失，一般亲水性固定液采用疏水性流动相，疏水性固定液采用亲水性流动相。正相色谱法：固定相的极性大于流动性的极性，样品中极性小的组分先流出，极性大的组分后流出反相色谱法：固定相的极性小于流动性的极性，样品中极性大的组分先流出，极性小的组分后流出化学键合固定相：为了更好的解决固定液从载体上流失的问题，将各种不同的有机基团通过化学反应共价键健合到硅胶（担体）表面的游离羟基上，代替机械涂渍的液体固定相，从而产生了化学键合固定相，是目前液相色谱法应用最广泛的一个分支。2022/11/22在液液色谱中，为防止固定液的流失，一般亲水性固定液采用疏水性952、液固色谱法概述：流动相为液体，固定相为吸附剂。基本原理：其作用机制是溶质分子（X）和溶剂分子（S）对吸附剂活性表面的竞争吸附。常用的固体吸附剂，如硅胶，氧化铝等。较常用的是5~10mm的硅胶吸附剂。适用：分离相对分子质量中等的油溶性试样，对具有不同官能团的化合物和异构体有较高的选择性。缺点：非线性等温吸附引起峰的拖尾现象。2022/11/222、液固色谱法2022/10/23963、离子对色谱法各种强极性的有机酸、有机碱的分离分析是液相色谱法中的重要课题，用吸附或分配色谱一般需要强极性的洗脱液，并容易发生严重的拖尾现象，利用离子交换色谱需要选择合适的pH条件，此外以高分子材料为基体的树脂填料一般不能承受高压，传质性能也较差。若用离子对色谱法，则分离效能高，分析速度快，操作简便。2022/11/223、离子对色谱法2022/10/2397基本原理：将一种（或多种）与溶质分子电荷相反的离子（称为对离子或反离子）加到流动相或固定相中，使其与溶质离子结合成疏水型离子对化合物，从而控制溶质离子的保留行为对离子（反离子）：用于阴离子分离的对离子是烷基铵类，如氢氧化四丁基铵、氢氧化十六烷基三甲铵等；用于阳离子的对离子是烷基磺酸类，如己烷磺酸钠等。2022/11/22基本原理：将一种（或多种）与溶质分子电荷相反的离子（称为对离98理论依据（以反相离子对色谱法为例）：X+——待分离的有机离子，Y-——带反电荷的对离子对离子的浓度是控制反相离子对色谱溶质保留值的主要因素，可在较大范围内改变分离的选择性；平衡常数取决于对离子和有机相的性质。2022/11/22理论依据（以反相离子对色谱法为例）：对离子的浓度是控制反相离99分类根据流动相和固定相的性质可分为正相离子对色谱法和反相离子对色谱法。在反相离子对色谱法中（更为常用的离子对色谱法），采用：非极性的疏水固定相，含有对离子的甲醇—水（或乙腈—水）作为极性流动相。注意：对离子浓度是控制反相离子对色谱溶质保留值的主要因素，可在较大范围内改变分离的选择性。2022/11/22分类2022/10/23100适用：各种强极性的有机酸、有机碱；特别是反相离子对色谱法解决了以往难分离混合物的分离问题，诸如酸、碱和离子、非离子的混合物，特别是一些生化试样如核酸、核苷、儿茶酚胺、生物碱以及药物等的分离。另外：借助离子对的生成给试样引入紫外吸收或发荧光的基团，提高检测的灵敏度。2022/11/22适用：各种强极性的有机酸、有机碱；2022/10/231014、离子交换色谱法是利用离子交换原理和液相色谱技术的结合来测定溶液中阳离子和阴离子的一种分离分析方法．基本原理：以离子交换树脂为固定相，其上可解离的离子与流动相中具有相同电荷的溶质离子进行可逆交换，根据这些离子对交换剂具有不同的亲和力而将它们分离。亲和力大，保留时间长，出峰晚。适用：凡在溶剂中能够电离的物质（无机和有机阴阳离子）通常都可以用离子交换色谱法来进行分离。2022/11/224、离子交换色谱法2022/10/231025、离子色谱法产生背景：离子交换色谱淋洗液几乎都是强电解质，电导比待测离子高两个数量级，电导检测器难以检测。多数无机离子没有紫外吸收，不能检测。1975年，美国DowChemical公司H.Small等人引入抑制柱（SuppressorColumn).

分离柱+抑制柱+电导检测器=离子色谱双柱离子色谱2022/11/225、离子色谱法产生背景：1975年，美国DowChemic103基本原理：以离子交换树脂为固定相，电解质溶液为流动相，利用离子交换原理连续对共存的多种阴离子或阳离子进行分离后，导入检测装置进行分析测量。通常以电导检测器为通用检测器，为消除流动相中强电解质背景离子对电导检测器的干扰，设置了抑制柱。双柱离子交换色谱仪结构：输液系统（淋洗液贮器、高压泵）→进样系统→分离系统（分离柱）→检测系统（抑制柱、检测器）→数据处理记录系统（记录仪、积分仪、计算机）2022/11/22基本原理：以离子交换树脂为固定相，电解质溶液为流动相，利用离104离子色谱仪器淋洗液

泵色谱柱检测器

泵液分离

检测

记录F-NO3-SO42-Cl-NO2-Br-HPO42-进样阀抑制器检测池进样2022/11/22离子色谱仪器淋洗液泵色谱柱检测器泵液分离检测记录F-105分离柱：填充低容量同性离子交换树脂；如分析阴离子则装填低容量R—OH，分析阳离子则装填低容量R—H作用：是基于低容量离子交换树脂对不同的同性离子的亲和力不同而使之彼此分开抑制柱：填充高容量异性离子交换树脂；如分析阴离子则装填高容量R—H，分析阳离子则装填高容量R—OH作用：削减洗脱液造成的本底电导，提高被测组分的灵敏度2022/11/22分离柱：填充低容量同性离子交换树脂；如分析阴离子则装填低容量106抑制器的作用废液BackGround：Na2CO3/NaHCO3

(700μS)NaF,NaCl,NaNO3Na2HPO4,Na2SO4～～RetentiontimeConductivityNaFNaClNaNO3Na2HPO4Na2SO4BackGround：Na2CO3/NaHCO3

(700μS)～～RetentiontimeConductivityHFHClHNO3H3PO4H2SO4RetentiontimeBackGround：H2CO3(15μS)Conductivity分离柱：ROH；分离NaF、NaCl、NaNO3、Na2HPO4、Na2SO4抑制柱：RH；H+与洗脱液（NaHCO3、Na2CO3）中和，降低背景电导2022/11/22抑制器的作用废液BackGround：Na2CO3/107以分析阴离子为例，说明为什么要加抑制柱？当待测阴离子从柱中被洗脱下来进入电导池时，要求能检测出洗脱液中电导的改变，但洗脱液中的氢氧根浓度要比试样中的阴离子浓度大得多才能使分离柱正常工作，因此与洗脱液的电导值相比，由于试样进入洗脱液而引起的电导改变就非常小，结果是用电导检测器直接测定试样中的阴离子灵敏度极差，故需加抑制柱以消除洗脱液的本底电导以提高待测离子的检测灵敏度。2022/11/22以分析阴离子为例，说明为什么要加抑制柱？2022/10/23108适用：水溶液中阴离子分析的最佳方法，是目前唯一快速、灵敏和准确的多组分分析的方法；应用范围也在扩散，从无机和有机阴离子到金属阳离子，从有机阳离子到糖类、氨基酸、核苷酸等均可用离子色谱法进行分析。单柱型离子色谱法：如果采用低电导洗脱液（如苯甲酸盐或邻苯二甲酸盐等稀溶液），不仅能有效分离、洗脱各个阴离子，而且背景电导较低，不需抑制柱，称为单柱型离子色谱法。2022/11/22适用：水溶液中阴离子分析的最佳方法，是目前唯一快速、灵敏和准1096、排阻色谱色谱

size-exclusionchromatography

固定相：凝胶(具有一定大小孔隙分布)；

原理：按分子大小分离。小分子可以扩散到凝胶空隙，由其中通过，出峰最慢；中等分子只能通过部分凝胶空隙，中速通过；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶剂分子小，故在最后出峰。全部在死体积前出峰；可对相对分子质量在100-105范围内的化合物按质量分离2022/11/226、排阻色谱色谱

size-exclusionchro110固定相：凝胶（具有一定大小孔隙分布）流动相：水（凝胶过滤色谱）、有机溶剂（凝胶渗透色谱）特点：溶剂分子通常是非常小，它们最后被洗脱，故试样峰全部在溶剂的保留时间（死时间tM）前出峰，它们在柱内停留时间短，故柱内峰扩展比其它分离方法小得多，所得峰较窄，利于检测适用：分离相对分子量大的化合物（约为2000以上）；在合适的条件下，也可分离相对分子量小至100的化合物，故相对分子量为100~8×105的任何类型的化合物，只要在流动相中是可溶的，都可用排阻色谱法进行分离。2022/11/22固定相：凝胶（具有一定大小孔隙分布）2022/10/23111局限性：不能分离大小相似、相对分子质量接近的分子，例如异构体等。只能分离相对分子质量差别在10%以上的分子。另外：对于一些高聚物，由于其组分相对分子量的变化是连续的，虽然不能用排阻色谱进行分离，但可测定其相对分子质量的分布（分级）情况，这正是我们想知道的。2022/11/22局限性：不能分离大小相似、相对分子质量接近的分子，例如异构体1127、亲和色谱(AC)

Affinitychromatograph

原理：利用生物大分子和固定相表面存在的某种特异性亲和力，进行选择性分离。

先在载体表面键合上一种具有一般反应性能的所谓间隔臂(环氧、联胺等)，再连接上配基(酶、抗原等)，这种固载化的配基将只能和具有亲和力特性吸附的生物大分子作用而被保留。改变淋洗液后洗脱。2022/11/227、亲和色谱(AC)

Affinitychromato113离子与非离子酸性液相色谱分离方法选择分子量<2000水溶性化合物分子量>2000水不溶性化合物不离解离解分子量较大的酚、醚、胺非水溶性高聚物水溶性高聚物分子尺寸不同碱性分配性能有差异多官能团反相离子对色谱阴离子交换色谱阳离子交换色谱凝胶过滤色谱液－液分配色谱吸附色谱凝胶渗透色谱凝胶过滤色谱凝胶渗透色谱非极性极性反相色谱正相色谱2022/11/22离子与非离子酸性液相色谱分离方法选择分子量<2000水溶114第三章

液相色谱分析法3.4

液相色谱的固定相highperformanceliquidchromatographstationaryphaseofHPLC2022/11/22第三章

液相色谱分析法3.4

液相色谱的固定相highpe115一、液相色谱固定相

stationaryphasesofLC

1.液-液色谱法、键合相色谱法及离子对色谱法固定相（1）全多孔型担体

由氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多孔球体；早期采用100μm的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳已不多见；现采用10μm以下的小颗粒，化学键合制备柱填料；（2）表层多孔型担体（薄壳型微珠担体）

30～40μm的玻璃微球，表面附着一层厚度为1～2μm的多孔硅胶。表面积小，柱容量底；2022/11/22一、液相色谱固定相

stationaryp116（3）化学键合固定相化学键合固定相:目前应用最广、性能最佳的固定相；

a.硅氧碳键型：≡Si—O—C（常用、见图）

b.硅氧硅碳键型：≡Si—O—Si—C

稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广；

c.硅碳键型：≡Si—C

d.硅氮键型：≡Si—N2022/11/22（3）化学键合固定相化学键合固定相:目前应用117化学键合固定相的特点（1）传质快，表面无深液坑，比一般液体固定相传质快；（2）寿命长，化学键合，无固定液流失，耐流动相冲击；（3）选择性好，可键合不同官能团，提高选择性，应用于多种色谱类型及试样的分析；（5）有利于梯度洗脱；存在着双重分离机制：(键合基团的覆盖率决定分离机理)高覆盖率：分配为主；低覆盖率：吸附为主；

2022/11/22化学键合固定相的特点（1）传质快，表面无深液坑，比一般液体固1182.液-固吸附分离固定相

种类：硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等；结构类型：全多孔型和薄壳型；粒度：5～10μm；

2022/11/222.液-固吸附分离固定相种类：硅胶、氧化铝、分1193.离子交换色谱分离固定相结构类别：（1）薄壳型离子交换树脂薄壳玻璃珠为担体，表面涂约1%的离子交换树脂；（2）离子交换键合固定相薄壳键合型；微粒硅胶键合型（键合离子交换基团）

树脂类别：（1）阳离子交换树脂（强酸性、弱酸性）（2）阴离子交换树脂（强碱性、弱碱性）2022/11/223.离子交换色谱分离固定相结构类别：2022/11204.空间排阻分离固定相（1）软质凝胶葡聚糖凝胶、琼脂凝胶等。多孔网状结构；水为流动相。适用于常压排阻分离。（2）半硬质凝胶苯乙烯-二乙烯基苯交联共聚物，有机凝胶；非极性有机溶剂为流动相，不能用丙酮、乙醇等极性溶剂（3）硬质凝胶多孔硅胶、多孔玻珠等；化学稳定性、热稳定性好、机械强度大，流动相性质影响小，可在较高流速下使用。可控孔径玻璃微球，具有恒定孔径和窄粒度分布。2022/11/224.空间排阻分离固定相（1）软质凝胶2022/10/231213.5液相色谱的流动相

mobilephasesofLC1.流动相特性

（1）液相色谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱剂。流动相组成改变，极性改变，可显著改变组分分离状况；（2）亲水性固定液常采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定相的极性，称为正相液液色谱法，极性柱也称正相柱。（3）若流动相的极性大于固定液的极性，则称为反相液液色谱，非极性柱也称