高三生物一轮复习：微生物培养技术及应用

.2微生物的培养技术及应用一.微生物的基本培养技术（提供营养，确保无其他杂菌）（一）培养基的配制1.培养基概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。2.种类a.按物理性质分固体培养基（加琼脂）：用于实验室菌种的分离.鉴定.计数等液体培养基（不含凝固剂）：用于工业生产（扩大培养）b.按用途分选择培养基：从众多微生物中分离所需要的微生物鉴别培养基：鉴别不同种类的微生物c.按成分分天然培养基（有些成分未知）：用于工业生产合成培养基（各成分已知并按一定比例配制的）：用于实验室分离.鉴定.计数比较概念举例选择培养基培养基中加入某种化学物质以促进所需要的微生物生长，抑制不需要的微生物生长培养基中加入青霉素：培养酵母菌和霉菌，抑制细菌生长加入高浓度食盐，培养耐盐菌，如金黄色葡萄球菌鉴别培养基根据微生物的代谢特点在培养基中加入某种指示剂或化学药品在培养基中加入伊红-亚甲蓝：鉴别饮用水中是否含有大肠杆菌（菌落呈深紫色，并带有金属光泽）3.培养基的成分a.1000ml牛肉膏蛋白胨培养基的营养构成组分含量提供的主要营养牛肉膏5g碳源.磷酸盐和维生素等蛋白胨10g氮源和维生素等NaCl5g无机盐H2O定容至1000ml水b.营养成分：虽然各种培养基的具体配方不同，但一般都含有水.碳源.氮源.无机盐等营养物质此外，培养基还需满足微生物生长对PH.特殊营养物质以及O2的需求例如培养乳酸杆菌—维生素；细菌—培养基调至中性或弱碱霉菌—培养基调至酸性；厌氧微生物—提供无氧条件碳源无机碳：CO2，NaHCO3—培养自养生物有机碳：葡萄糖，脂肪酸，花生粉，饼，石油等—提供异养生物氮源无机氮：N2,NH3,铵盐，硝酸盐有机氮：蛋白胨，尿素等（二）无菌技术1.获得纯净培养物的关键是：防止外来杂菌的入侵消毒：是指使用较为温和的物理.化学或生物等方法杀死物体表面或内部一部分微生物灭菌：是指使用强烈的理化方法杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢（抗逆性休眠体）和孢子（无性生殖细胞）对于操作的空间.操作者的衣着和手进行清洁和消毒用于微生物培养的器皿.接种用具和培养基等进行灭菌为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行应避免已经灭菌处理的材料用具与周围物品相接触2.常用方法消毒煮沸消毒：100℃煮沸5~6min巴氏消毒：不耐高温的液体，如牛奶在62-65℃消毒30min或80-90℃处理30s-1min可杀死牛奶中绝大多数微生物，并且不破坏牛奶的营养成分化学药剂消毒：酒精擦拭双手，用氯气消毒水源等紫外线消毒：接种室，接种箱或超净工作台在使用前可用紫外线照射30min在照射前，适量喷洒石碳酸或煤酚皂溶液等消毒液生物消毒法：利用生物或其代谢物除去环境中部分微生物灭菌湿热灭菌：用沸水.流通蒸汽或高压蒸汽进行灭菌的方法，其中高压蒸汽灭菌效果最好。压力100kpa，温度121℃，维持15-30min（培养基灭菌）干热灭菌：能耐高温的，需要保持干燥的，如玻璃器皿（吸管，培养皿和金属用具等）。温度160-170℃的热空气中维持2-3h。灼烧灭菌：接种工具如涂布器.接种环.接种针或其他金属用具.直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧，试管口.瓶口也可以灼烧灭菌。（三）微生物的纯培养1.相关概念：培养物：将接种于培养基内，在合适条件下形成的含特定种类微生物的群体纯培养物：由一个单体繁殖所获得的微生物群体纯培养：获得纯培养物的过程2.常用接种方法：平板划线法和稀释涂布平板法平板划线法：是通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作目的是：将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。在数次划线后培养，可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体，这就是菌落。稀释涂布平板法：则是将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面进行培养。在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个菌落。3.实践：酵母菌的纯培养P12（1）原理：微生物群分散成单个细胞在适宜的固体培养基表面或内部可以繁殖形成肉眼可见的，有一定形态结构的子细胞群体，这就是群落。（2）方法：采用平板划线法和稀释涂布平板法将单个微生物分散在固体培养基上，之后经培养得到的单一菌落一般是由单个微生物繁殖形成的纯培养物。（3）步骤制备培养基配制培养基：马铃薯切块+水煮软烂过滤滤液+葡萄糖+琼脂灭菌培养基：湿热灭菌（高压蒸汽灭菌），压力100kpa，温度121℃培养皿：干热灭菌，温度160-170℃灭菌2h倒平板：50℃左右，在酒精灯火焰附近倒平板接种和分离酵母菌：用平板划线法接种，未接种的平板倒置培养酵母菌待菌液被培养基吸收，将接种后的平板和一个放入28℃左右的恒温培养箱中培养24-48h（4）实验结果的分析a.培养未接种的培养基的目的：是检测培养基是否被杂菌污染（或检测培养基制备是否合格）未接种的培养基表面若有菌落生长，则说明培养基被污染，应重新制备；若无菌落生长，则说明未被污染b.在接种酵母菌的培养基上可观察到独立的菌落，这些菌落在颜色.形状和大小上相似，酵母菌落一般表面光滑，多呈乳白色c.若在培养基中观察到不同形态的菌落，原因可能是菌液不纯，混入其他杂菌，或在实验操作过程中被杂菌污染附：平板划线法操作步骤1）取菌液:灼烧接种环冷却并拔棉塞试管口通过火焰蘸取一环菌液瓶口通过火焰并塞上棉塞2）第一次划线：用接种环在培养基表面划三至五条平行线3）重复划线简答：1.平板冷却后为什么要将平板倒置？可以防止皿盖上的水珠落入培养基造成污染2.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线结束时，仍然需要灼烧接种环？为什么？灼烧时期目的取菌种前杀死接种环上原有微生物每次划线前杀死上次划线时残留菌种，使下一次划线的菌种直接来源上次划线的末端，从而使每次划线时菌种数目逐渐减少，直至得到单个细胞接种结束后杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者3.若要按照如图d进行划线，那么在接种划线的操作过程中，共灼烧了几次接种环？图中共划了5个区域，在每次划线前后均需要对接种环灼烧灭菌，因此共需要灼烧接种环6次。4.在第二次以及其后的划线操作时，总是从上一次划线的末端开始划线的原因是？划线后，线条末端酵母菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使酵母菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细胞繁殖而来的菌落。二.微生物的选择培养与计数1.选择培养基（1）自然界中目的菌的筛选a.实例：聚合酶链式反应（PCR）中用到的耐高温的DNA聚合酶，就是从热泉中筛选出来的水生栖热菌中提取出来的。b.依据：水生栖热菌能在70-80℃的高温条件下生产，而绝大多数微生物在此条件下不能生存（生物与环境相适应）（2）实验室中目的菌的筛选a.原理：人为提供有利于目的菌生长的条件（包括营养.温度和PH等）同时抑制或阻止其他微生物的生长。b.方法：利用选择培养基分离选择培养基：允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基2.微生物的选择培养取菌液：取0.1ml菌液滴加到培养基上涂布器消毒：涂布器浸在酒精中涂布器灭菌：灼烧涂布器，待酒精燃尽，冷却再涂布涂布平板取菌液：取0.1ml菌液滴加到培养基上涂布器消毒：涂布器浸在酒精中涂布器灭菌：灼烧涂布器，待酒精燃尽，冷却再涂布涂布平板（2）稀释涂布平板法的操作过程1）铲去土样2）等比稀释（梯度稀释）3）涂布平板（3）培养：待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入恒温箱中培养1~2d3.微生物的数量测定（1）稀释涂布平板法—活菌计数法（结果偏小：是菌落数而不是活菌数）a.原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌b.计数原则1）为保证结果准确，一般选择菌落数为30-300的平板进行计数2）在设计试验时，在同一稀释度下，应至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值3）统计的菌落数往往比活菌的实际数目少，这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。因此，统计结果一般用菌落数而不是用活菌数来表示。（2）显微镜直接计数法（结果偏大：活菌+死菌）一种常用的，快速直观的测定微生物数量的方法。该方法利用特定的细菌计数板或血细胞计数板（比细菌计数板厚，常用于相对较大的酵母菌细胞，霉菌孢子等的计数P18）（3）计算公式每克样品中的菌株数=稀释的倍数·某一稀释度下平板上生长的平均菌落数/涂布平板时所用的稀释液的体积（ml）即=C平M倍/V涂一般V涂=0.1ml简答：用平板划线法能否达到对细菌进行计数的目的？为什么？不能，平板划线法最开始的划线很可能菌类会长成一片，导致无法计数，此外灼烧接种环时，也会杀死一部分菌类。实践（一）土壤中分解尿素的细菌的分离与计数1.实验目的:（1）从土壤中分离出能分解尿素的细菌（2）统计每克土壤样品中究竟有多少这样的细菌2.背景：土壤中的细菌之所以能分解尿素，是因为能合成脲酶CO(NH2)2+H2O脲酶CO2+2NH3NH3会使培养基的碱性增强.PH升高.以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某种细菌后，如果PH升高，指示剂将变红，我们就可以准确地鉴定该菌种能够分解尿素3.筛选菌株：配制以尿素为唯一氮源的选择培养基4.设置对照：目的是排出非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。如a.培养物中是否含有杂菌污染—可设置未涂布的平板做空白对照（或接种无菌水）b.选择培养基是否筛选出菌落—可用牛肉膏蛋白胨培养基做对照如果牛肉膏蛋白胨培养基上菌落数目明显大于选择培养基数目，说明选择培养基已筛选出一些菌落。5.实验流程土壤取样梯度稀释涂布平板微生物的培养与观察注：土壤取样时，一般要铲去表层土，因为细菌适宜在酸碱度接近中性的潮湿土壤中生长，绝大多数分布在距地表3~8cm的土壤层在实际操作中，通常选用一定稀释范围的样品进行培养，细菌一般选104.105.106的稀释液进行平板培养，目的是以保证获得菌落数在30-300之间，适于计数的平板细菌一般在30-37℃温度下培养1~2d，每隔24h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果，原因是这样可以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目菌落特征包括：菌落的形状.大小.隆起度和颜色等简答：利用尿素作为唯一氮源的培养基分离出的微生物都是能分解尿素的微生物吗？不一定，因为有些微生物可以利用尿素分解菌的代谢产物进行生长繁殖。（二）分解纤维素的微生物的分离一.基础知识（1）纤维素和纤维素酶纤维素酶是一种复合酶，至少包括三种组分，即C1酶.CX酶.葡萄糖苷酶。纤维素C1酶.CX酶纤维二糖葡萄糖苷酶葡萄糖（2）纤维素分解菌的筛选—刚果红染色法原理：刚果红染料能与纤维素这样的多糖形成红色复合物，当纤维