载体系统课件

第六节载体系统一、质粒载体二、噬菌体载体三、cosmid克隆载体四、噬菌粒载体五、酵母人工染色体载体六、细菌人工染色体载体第六节载体系统一、质粒载体一、质粒载体（一）质粒的一般生物学特性（二）基因工程中质粒载体的构建（三）pBR322质粒载体（四）pUC质粒载体（五）质粒载体的稳定性问题一、质粒载体（一）质粒的一般生物学特性（一）质粒的一般生物学特性1质粒的概念质粒（plasmid）是独立于染色体外、具有自主复制能力的遗传单位，其本质是较小的核酸分子，大小范围在1kb-200kb以上不等。（一）质粒的一般生物学特性1质粒的概念2细菌质粒的一般生物学特性：1）很多细菌中已发现；2）是独立于细菌染色体之外的辅助性遗传单位，基因组绝大部分为双链环状DNA，不同质粒大小各异；3）大多数质粒的宿主范围较窄；2细菌质粒的一般生物学特性：4）已发展进化出多种机制以维持其在细菌宿主中的稳定的拷贝数；在不同的宿主细胞中拷贝数可能不同。5）复制转录的进行依赖于宿主编码的酶和蛋白质；6）常含有一些编码对细菌宿主有利的酶的基因。4）已发展进化出多种机制以维持其在细菌宿主中的稳定的拷贝数；单链切割连接单链切割连接共价闭合环形DNA（SC型）开环DNA（oc型）线性DNA（L型）环形双链的质粒DNA分子具有三种不同构型单链切割连接单链切割连接共价闭合环形DNA开环DNA线性DN3质粒的命名用小写字母p代表质粒（plasmid），在p字母后用两个大写字母代表发现这一质粒的作者或实验室名称，再加上质粒编号。如：pBR322：p表示一种质粒，而“BR”则是分别取自该质粒的两位主要构建者F.Bolivar和R.L.Rodriguez，322为编号。3质粒的命名用小写字母p代表质粒（plasmid）4质粒给宿主细胞的标记

(1)氨苄青霉素(Ampicillin)

(2)卡那霉素(Kanamycin)

(3)四环素（Tetracycline）

(4)氯霉素(Chloramphenicol)

(5)链霉素（Streptomycin）(6）潮霉素（Hygromycin）4质粒给宿主细胞的标记(1)氨苄青霉素(Ampic5质粒的复制类型据质粒DNA复制与宿主之间的关系分为：（1）“严紧型”复制控制的质粒(stringentplamid)：拷贝数少；（2）“松弛型”复制控制的质粒(relaxedplasmid)：拷贝数多。5质粒的复制类型据质粒DNA复制与宿主之间的关系分为：6质粒DNA的转移质粒的类型据能否自我转移可分为:

接合型（conjugativeplasmid)

非接合型（non-conjugativeplasmid)(2)F质粒(fertilityfactor)

F+又叫雄性决定因子，所以F+细胞又叫雄性细胞，相应的F–又叫雌性细胞。F质粒(94kb)在寄主细胞中有三种不同存在方式：①F+②F`③Hfr。6质粒DNA的转移质粒的类型据能否自我转移可分为:7质粒的转化

转化（transformation）：是将异源DNA分子引入另一细胞品系，使受体细胞获得新遗传性状的一种手段。质粒转化细菌常用方法：热激法、电击法7质粒的转化转化（transformation）：（二）基因工程中的质粒载体克隆载体(cloningvector)

:

使目的片段能在细菌细胞中复制的载体;表达载体（ExpressionVector）:

使目的基因能在细菌细胞表达为RNA或蛋白质的载体。（二）基因工程中的质粒载体克隆载体(cloningvect克隆载体必备条件（1）具有复制起点（2）具有抗菌素抗性基因（3）具有若干限制酶单一识别位点（4）具有较小的相对分子质量和较高的拷贝数。克隆载体必备条件（1）具有复制起点表达载体的必备条件(1)能自主复制(2)具有方便、灵活的克隆位点和筛择标记(3)具有能为大肠杆菌RNA聚合酶所识别的强大启动子(4)启动子应可受诱导调控(5)具有强终止子(6)具有翻译起始信号表达载体的必备条件(1)能自主复制1天然质粒用作载体的局限性天然质粒相对分子质量拷贝数单一酶切位点选择性标记复制类型pSC1015.8×1061~3EcoRItetr严紧ColE14.2×10620EcoRI大肠杆菌素松弛RSF21247.4×10610EcoRI(BamHI)ampr松弛局限性：分子量高、拷贝数低、合适的单一酶切位点少、选择标记不合适1天然质粒用作载体的局限性天然质粒相对分子质量拷贝数单2质粒载体的选择标记选择标记的应用：利用质粒编码的可选择标记选择目标菌落。常用的选择标记：

抗氨苄青霉素、抗四环素、抗氯霉素和抗卡那霉素等基因。2质粒载体的选择标记选择标记的应用：（三）pBR322质粒载体（三）pBR322质粒载体pBR322质粒载体的形体图pBR322质粒载体的形体图pBR322质粒载体的结构来源TetrAmprOripBR322质粒载体的结构来源TetrAmprOripBR322质粒载体的优点：♣具有较小的相对分子质量(4363bp)♣具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择记号(Ampr和Tetr)♣具有较高的拷贝数（松弛型）pBR322质粒载体的优点：DNA连接酶pBR322质粒载体tetr基因插入失活效应DNA连接酶pBR322质粒载体tetr基因插入失活效应（四）pUC质粒载体（四）pUC质粒载体pUC18pUC19含四个部分：（1）来自pBR322的质粒复制起点（ori）；（2）ampr;（3）大肠杆菌β半乳糖苷酶基因（lacZ）的启动子及其编码α-肽链的DNA序列；（4）多克隆位点（MCS）lacZ`OriAmprMCSpUC18pUC19含四个部分：lacZ`OriAmprMCBlueWhiteampramprInsertInsertNoinsertLacZ`LacZ`Blue♣具更小的分子质量(2.69kb)和更

高的拷贝数

♣适于组织化学方法检测重组体

♣具多克隆位点MCS区段pUC质粒载体的优点♣具更小的分子质量(2.69kb)和更

高的拷贝数

♣其它重要的质粒载体改造过的质粒载体非常多其它重要的质粒载体改造过的质粒载体非常多能在体外转录克隆基因的质粒载体能在体外转录克隆基因的质粒载体穿梭质粒载体（shuttleplasmidvector）是一类由人工构建的具有两种不同复制起点和选择记号，因而可在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体。穿梭质粒载体大肠杆菌-酿酒酵母穿梭质粒载体大肠杆菌-酿酒酵母穿梭质粒载体（五）质粒载体的稳定性问题（1）不稳定性类型♣分离不稳定性♣结构不稳定性（2）影响稳定性主要因素♣新陈代谢负荷♣拷贝数差度（五）质粒载体的稳定性问题（1）不稳定性类型二、噬菌体载体1噬菌体的结构及其核酸类型2噬菌体的生命周期λ噬菌体载体4M13噬菌体载体二、噬菌体载体1噬菌体的结构及其核酸类型1噬菌体的结构及其核酸类型不同种类的噬菌体颗粒，在结构上有很大差别。

三种不同基本类型：♣无尾部的二十面体型♣具尾部的二十面体型（大多数噬菌的构形）♣线状体型1噬菌体的结构及其核酸类型不同种类的噬菌体颗粒，在结构T2噬菌体结构示意图T2噬菌体结构示意图

♣双链线性DNA（最常见）

♣双链环形DNA♣单链环形DNA♣单链线性DNA♣单链RNA噬菌体的核酸：♣双链线性DNA（最常见）

♣双链环形DNA2噬菌体的生命周期（1）溶菌生长周期噬菌体（烈性噬菌体）（2）溶源生长周期噬菌体（温和噬菌体）2噬菌体的生命周期（1）溶菌生长周期噬菌体（烈性噬菌体）（1）烈性噬菌体的生活周期（1）烈性噬菌体的生活周期t=0噬菌体吸附到寄主菌的细胞壁，大约在吸附的2秒钟内就会发生噬菌体DNA的注入；t=1寄主DNA、RNA和蛋白质的合成反应被全部关闭；t=2第一个噬菌体mRNA开始合成；t=3细菌DNA开始降解；t=5噬菌体DNA合成开始启动；t=9“晚期”噬菌体mRNA开始合成；t=12出现完整的头部和尾部结构；t=15出现头一个完整的噬菌体颗粒；t=22细菌发生溶菌作用，释放出约300个左右的噬菌体时粒E.coliT4噬菌体的生命周期（以分钟记）t=0噬菌体吸附到寄主菌的细胞壁，大约在吸附的2秒（2）温和噬菌体（2）温和噬菌体裂解循环溶源态（2）温和噬菌体的生活周期裂解循环溶源态（2）温和噬菌体的生活周期3λ噬菌体载体（1）λ噬菌体的分子生物学概述（2）λ噬菌体载体3λ噬菌体载体（1）λ噬菌体的分子生物学概述（1）λ噬菌体的分子生物学概述λ噬菌体（温和型）颗粒中的DNA是一线性双链DNA分子，长48502bp，两端各有12个碱基的5`凸出黏性末端是互补的。进入细胞的λDNA通过两端的黏性末端环化。λ噬菌体上有些基因可被取代而不影响其生活周期。（1）λ噬菌体的分子生物学概述λ噬菌体（温和型）颗粒中的D第六节载体系统课件第六节载体系统课件第六节载体系统课件第六节载体系统课件λ噬菌体DNA的核酸内切限制酶的限制图（Kb）λ噬菌体DNA的核酸内切限制酶的限制图（Kb）（2）λ噬菌体载体

主要有如下特点：1)筛选简便；2)可克隆的片段大，最大可达23kb，而质粒最大仅10kb左右；3)转化效率高。（2）λ噬菌体载体λ噬菌体载体可分为：

插入型载体

替换型载体λ噬菌体载体可分为：第六节载体系统课件第六节载体系统课件注意：λ噬菌载体作为载体，其重组噬菌体DNA大小只能：38kb~52kb。体外包装：λ噬菌载体+尾部蛋白+头部蛋白λ噬菌体载体是主要用于cDNA文库构建，也经常用于外源目的基因的克隆。注意：λ噬菌载体作为载体，其重组噬菌体DNA大小只能：384M13噬菌体载体

6.4kb单链环状正链DNA基因组。作载体的优点：

(1)RFDNA和SSDNA都可感染E.coli，产生噬菌斑；(2)无包装限制问题（可6倍于M13基因组）；

(3)复制以双链环形DNA为中间媒介；(4）易测出外源DNA的插入方向；(5）可产生能直接测序的单链DNA分子。4M13噬菌体载体6.4kb单链环状正链DNA基三、cosmid克隆载体cosmid（cossite-carringplasmid）人工构建的含有λDNA的cos位点序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体。三、cosmid克隆载体cosmid（cossitepHC79柯斯质粒载体pHC79的形体图由pBR322质粒DNA与λ噬菌体DNA的cos位点及其控制包装作用的序列构成pHC79柯斯质粒载体pHC79的形体图部分柯斯质粒的基本特性部分柯斯质粒的基本特性柯斯质粒载体的特点：1）具有λ噬菌体的特性（但因不含全部必需基因，因此不能通过溶菌周期，无法形成子代噬菌体颗粒）；2）具有质粒的特性（有质粒复制子及抗菌素基因）；3）具有高容量的克隆能力（本身仅5-7kb,克隆极限可达45kb左右）；4）具有与同源序列质粒进行重组的能力。广泛应用于基因组DNA文库的构建。柯斯质粒载体的特点：柯斯克隆（cosmidcloning）理论依据是：1）在线性噬菌体DNA分子的每一端，都具有一段彼此互补的单链突出序列（cos位点)。2）在λ噬菌体的正常生命周期中，会产生出由数百个λDNA拷贝组成的多连体分子。在此种分子中，前后两个λDNA基因组之间都是通过cos位点连接起来的。3）λ噬菌体具有的一种位点特异的切割体系(site-specificcuttingsystem),又叫Ter体系，能识别两个相距适宜的cos位点(38-45kb)，将多连体分子切割成λ单位长度的片段，并将它们包装到λ噬菌体头部中去。柯斯克隆（cosmidcloning）理论依据是：(如EcoRI)38kb~52kb(如EcoRI)38kb~52kb四噬菌粒载体（phagemidvector)由质粒载体和单链噬菌体载体结合而成的新型载体系列，称为噬菌粒（phagemid或phasmid）四噬菌粒载体（phagemidvector)由噬菌体质粒单链噬菌体辅助噬菌体大肠杆菌寄主菌株pEMBL8pUC8f1IR171/18pRSA101πVXM13M13变异株XS127，XS101pUC118/pUC119pUC18/pUC19M13M13K07MV1184pBSpUCf1M13K07XL-Blue几种常用的噬菌粒载体的一般特征噬菌体质粒单链噬菌体辅助噬菌体大肠杆菌寄主菌株pEMBL8ppUC119(MCS)pUC118(MCS)puC118和pUC119噬菌粒载体的分子结构pUC119(MCS)pUC118(MCS)puC118和ppBluescriptSK(+/-)2958bppBluescriptSK(+/-)噬菌粒载体的分子结构图pBluescriptSK(+/-)pBluescrip噬菌粒载体的