杨梅开题报告

睡而北农林奇枕大学2010级硕士研究生学位论文开题报告转TaEBP基因新春9号小麦株系

分子检测与抗旱性鉴定MoleculedetectionandIdentificationof

Drought-resistanceofTransgenicWheatXinchun

No.9withTaEBPGene学院：农学院学科、专业：作物遗传育种研究方向：农业生物技术研究生：陈学虎指导教师：陈耀锋教授研究生通过开开题论证日期：2011年12月29日开题论证委员会主席签名：开题论证委员会委员签名：转TaEBP转TaEBP1选题目的和意义基因新春9号小麦株系分子检测与抗旱性鉴定干旱、盐碱和低温（冷害）等非生物逆境是限制我国农作物生产的三大主要非生物胁迫因素。其中，干旱对农作物造成的损失最大，其损失量超过其他逆境造成损失的总和（Chen2000），特别在干旱、半干旱地区，农业用水更为短缺。随着生态环境的不断恶化，水资源短缺的矛盾将会更加突出。近年来，由于灌溉水资源短缺引起的旱灾频繁发生，给我国农业生产带来了严重的损失。在50年代，我国遭受干旱灾害面积为1133万hm2,到80年代遭受干旱灾害的面积已经增加到2333万hm2,再到90年代的2667万hm2,每年因缺水而造成粮食损失700亿kg〜800亿kg以上（李原园等1997），旱灾已成为我国覆盖面最广、成灾损失最大的灾害，而且受灾面积逐年扩大，频率逐渐增加。目前，世界上干旱、半干旱区面积约占土地总面积的36%，占总耕地面积的43.19%其他湿润半湿润地区也经常遇到周期性、季节性的干旱，给农业生产带来了巨大损失，干旱严重制约着干旱、半干旱区农业的发展。我国小麦耕地的1/3属于干旱、半干旱地区，干旱缺水已成为困扰该地区小麦生产的主要限制因素，严重影响着我国小麦生产水平的提高和籽粒品质的改善，威胁着国家粮食安全。对此，人们一直通过改善灌溉设施、改进灌溉技术等措施使干旱对农作物生产的危害得到了一定程度的缓解，但由于受资金和水资源短缺的制约，单靠灌溉措施缓解干旱胁迫的可能性将越来越小，而增强作物抗旱节水能力，培育抗旱节水小麦新品种才是解决干旱危害的最直接、最经济、最有效的途径。近几年来，小麦品种的抗旱节水特性越来越受到人们重视，通过常规育种手段选育抗旱节水小麦新品种也愈受育种者们的普遍关注。然而，由于植物对非生物胁迫的抗性一般受多基因调控，表现为复杂的综合数量性状遗传特点，通过常规育种手段进行多基因的转移不仅速度慢而且易受不良连锁性状的影响，仅仅依靠传统育种方法获得优良抗旱品种十分困难。加之，常规育种长期使用同类抗性亲本，致使育成小麦品种抗性的遗传基础狭窄，小麦抗旱种质资源单一或匮乏，虽然通过远缘杂交途径可以创造种质资源，提高普通小麦的抗逆性能，但其耗费时间长、育种效率低，无法满足当前作物生产对优异种质的迫切需求。植物基因工程的发展为创造耐旱小麦新品种开创了新途径。导入在植物干旱胁迫信号传递过程中起作用的转录因子DREB基因，是近几年来植物耐旱基因工程研究的重要方面。转录因子在干旱胁迫下得到超量表达后，大大增强了转基因作物的抗干旱胁迫能力。本试验通过对转TaEBP基因新春9号小麦株系、受体材料和当地主栽品种进行分子鉴定（Southernblot>Northernblot分析TaEBP的拷贝数、表达特性等特点）以及各个生育期的抗旱性相关指标的鉴定分析，筛选出抗旱性强的转TaEBP稳定株系，以增强转基因小麦的抗逆胁迫能力，创造耐旱或耐盐新种质（新品种）。2选题的依据（理论依据、技术依据、前期工作研究依据）随着地球变暖和降水量减少，我国大部分地区旱情加重。我国主要麦区如华北冬麦区、黄淮冬麦区、西北春麦区等均属于干旱和半干旱地区，在这些地区的小麦生产中，开展节水农业、提高作物品种的耐旱能力、培育耐旱和抗旱的小麦新品种尤为重要。植物基因工程的发展为创造耐旱小麦新品种开创了新途径。2.1基因枪轰击法转化是利用高速运动的金属微粒将附着于其表面的核酸分子引入到受体细胞中的一种遗传物质导入技术。基因枪法可以在一定程度上改善采用原生质体转化时培养及再生困难的障碍，重复性较高，操作也相对简单。基因枪法诞生不久后就相继在水稻、小麦、玉米、大麦、燕麦、高粱等重要的禾谷类作物中获得了成功。2.2PCR分子检测理论利用PCR技术对目的片段进行快速扩增，实际上是一种在模板DNA、引物和4种脱氧核糖核苷酸存在的条件下，利用DNA聚合酶的酶促反应，通过三个温度依赖性步骤完成的反复循环。2.3分子杂交Southern杂交：Southernblot是一种常用的DNA定量的分子生物学方法。其原理是将待测的DNA样品固定在固相载体（硝酸纤维膜或尼龙膜）上，与标记的核酸探针进行杂交，在与探针有同源序列的固相DNA的位置上显示出杂交信号，通过检测信号的有无、强弱可以对样品定性、定量，从而计算出转入的拷贝数。Northern杂交：Northernblot是最基本、最常用的分子生物学技术之一，它可以鉴定总RNA或poyl（A+）RNA样品中特定mRNA分子的大小和丰度，即分析目的基因的表达特ttoNorthern杂交首先将RNA分子在变性琼脂糖凝胶中按其大小不同而相互分开，然后将RNA转移到固相支持物上，再与放射性或非放射性标记的DNA或RNA探针进行杂交和放射自显影，以对待测的RNA分子进行作图。2.4抗旱指标（形态指标、生理和生化指标）关于抗旱指标的理论基础，目前尚未形成一个系统的抗旱性指标鉴选技术体系和抗旱性指标评价体系。但是，关于作物抗旱性的形态指标与生理生化指标与抗旱性的关系，近年来育种者们已进行了不断的探索，并将其不同程度、不同范围的应用于抗旱育种的工作实际，已取得了一些可靠的鉴选指标。一般认为叶片较小、形状窄而长，叶片薄，叶色淡绿，叶片与茎秆夹角小，叶片具有表皮毛及蜡质，干旱时卷叶（BogdanovaandPolimbetova1998；Bogdanovaetal.1988；TownleyandHurd1979），有效分蘖多，茎秆较细、有弹性，干旱情况下植株萎蔫较轻等是抗旱的形态结构指标（张正斌和王德轩著1992）。据国内外研究结果得知有20多项生理生化指标可用于小麦的抗旱性鉴定，主要有干旱条件下的叶片水势、相对含水量、束缚水含量、种子的吸水力、发芽率、细胞渗透调节能力、叶片膨压、超弱发光和叶绿素荧光强度、光合与呼吸强度以及离体叶片失水速率、茎叶耐化学脱水性；较可靠的生化指标有干旱胁迫下根冠中平衡石淀粉的水解速度、叶片中脱落酸的积累以及超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、过氧化物酶、谷胱甘肽反应酶、ATP酶、蛋白水解酶活性等。3国内外研究概况3.1作物抗旱性机制研究抗旱性并不是一个简单的概念，不同作物乃至同一作物在不同的生育时期采用不同的抗旱策略，甚至同时采取几种策略来适应干旱性。金善宝(1993)指出作物的抗旱性是一项复杂的生物性状，它反映在一系列生理和形态变化上，以及生长发育的节奏与农业气候因素变化相配合的程度，并最终对产量产生一定影响。作物抗旱性的强弱是由多基因共同控制的，同时也是多途径的。不同作物抗旱性机理各不相同，Levitt(1980)提出旱生植物适应干旱的机理可分为：避旱性、御旱性和耐旱性，进而又归纳出避旱、高水势下耐旱、低水势下耐旱这三种抗旱类型。避旱即通过调节生长发育进程避免干旱的影响，高水势下耐旱是通过减少失水或维持吸水达到的，低水势下耐旱的途径是维持膨压或者是耐脱水或干化。3.1.1形态结构与小麦抗旱性研究根系是小麦的重要器官，它在小麦的生长发育、生理功能和物质代谢过程中发挥着重要作用。发达的根系对干旱下植物吸水十分有利，根数、根长、根重、根冠比等与抗旱性相关；胚芽鞘长的品种抗旱性强，旱地产量较高，抗旱性弱的品种胚芽鞘较短；叶片是研究小麦抗旱性的重要形态指标，叶色、叶姿、叶片大小、腊质有无、叶片萎蔫程度均与抗旱密切相关。一般认为，干旱条件下，单株叶片较小、叶片较厚、叶色浓绿、叶片直立、叶片与茎秆夹角较小、叶片具有表皮毛和蜡质且干旱时不卷叶，植株萎蔫较轻等抗旱性强;干旱对株高影响显著，理想的抗旱小麦品种应该是干旱胁迫时株高不显著降低，在降水充沛时，株高不猛增，因此，可把干旱胁迫条件下株高胁迫指数做为评价小麦抗旱性的指标。株型紧凑的品种一般比株型松散的品种更为抗旱，选择小叶直立型的品种也是抗旱鉴定的指标；茎的水分输导能力发达，作物抗旱能力越强；有人发现小麦的芒性状与小麦抗旱呈正相关；在干旱胁迫下抗旱品种颖花结实率较高，籽粒饱满度好；穗型、穗长、穗粒数、千粒重、穗节指数和穗叶距均可作为抗旱鉴定的指标。3.1.2水分状况与小麦抗旱性研究作物组织器官的水势状况体现了植物体内水分的能量状态，可与土壤、大气中的水分联系起来成为一体，决定着植物对水分的吸收、运输和散失过程，在干旱条件下维持较高的叶水势是植物抗旱性的一个重要生理机制。大部分作物受到干旱胁迫时，为调节水分亏缺，会主动降低组织水势，从而维持正常的生理活动。由于不同作物抗旱机理的不同，并不能通过测定作物组织水势在干旱胁迫下维持或改变的程度来衡量作物抗旱性。抗旱品种和非抗早品种并不能简单用叶片水势来加以区分。近年来国内外学者对含水量、相对含水量、自由水、束缚水、叶片失水率和保水力等水分指标研究比较多。张荣芝等研究认为抗旱性强的品种叶片含水量低，抗旱性弱的品种叶片含水量高、以拔节期最明显。Schonfeld(1988)等指出，与水势相比，叶片相对含水量能更加密切地反映水分供应与蒸腾之间的平衡关系。束缚水与自由水含量的比值是判断抗旱性的重要指标，其比值越大抗旱性越强。人们普遍认为失水率低，保水力强的品种比较抗旱性强。小麦抗旱性是许多生理生化反应(过程)综合于整体植株上而表现出来的综合性状，是一种可遗传的数量性状，只有结合其他相关生理生化指标才能对小麦抗旱性作出较全面的生理学评价。3.1.3渗透调节与小麦抗旱性研究作物在水供应不足的胁迫下，会产生一系列主动性响应，特别是渗透胁迫响应，如增加细胞溶质、降低渗透势、维持膨压及细胞扩张、气孔启闭等生理响应过程，均可明显增强作物抗旱能力，所以说，渗透调节是抗早性的重要组成部分，同时也是植物适应十早逆境的重要生理机制。Cohen等对260多个小麦品种的研究表明，小麦渗透调节能力与抗旱性呈显著正相关，不同生育期渗透调节能力不同，灌浆期最高，苗期次之，孕穗期最低。小麦旗叶的渗透调节强度不仅仅与抗旱呈正相关，而且与十物质积累量也呈正相关。李德全(1992)等人的研究也表明，抗旱性强的冬小麦品种渗透调节能力显著高于抗旱性弱的冬小麦品种。透调节物质包括有机物和无机离子。有机物主要有可溶性糖、游离氨基酸、(脯氨酸)、苹果酸、有机酸、甜菜碱、可溶性蛋白质和氮类化合物。同时把小麦叶片渗透调节区分为两种机理，一种以Pro及其他有机溶质为渗透调节物质，主要调节细胞质的渗透势，同时对酶、蛋白质和生物膜起保护作用；另一种是以K+和其他无机离子为渗透调节物质，主要调节液泡的渗透势，以维持膨压等生理过程。3.1.4光合作用与小麦抗旱性研究叶片是小麦的最主要的光合作用器官，水分胁迫通过抑制叶片伸展，影响或降低叶绿体光化学特性及生化特性等途径，使光合作用受到抑制。大量资料表明干旱胁迫下，小麦的光合强度下降，而抗旱性较强的品种能维持相对较高的光合速率或净光合生产率。由于光合作用的强弱直接决定着十物质产量，所以它是一个可靠的抗旱性鉴定指标。刘孟雨(1990)等报道，水分胁迫使小麦光合作用降低，不同的胁迫强度和胁迫时间引起光合作用降低的主要原因不同，在轻度水分胁迫条件下，光合下降的主要原因是气孔性限制，CO2由外界向细胞内扩散的阻力增加，使CO2供应减少，导致光合作用降低。这时叶片的净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)、细胞间隙CO2浓度(Ci)都呈下降趋势。但在较长时间轻度以上土壤干旱或严重十早下，光合作用下降的主要原因是非气孔限制，包括叶绿素含量降低、RuBP羧化酶活性显著下降，电子传递和光合磷酸化受抑制，叶绿体变形，片层结构受到破坏；严重胁迫下，叶片Pn、Gs明显下降，而Ci反而升高，提高空气中CO2浓度，在C02浓度接近饱和时，光合依然下降，因此，严重胁迫下，非气孔因素是光合作用降低的主要原因。3.1.5保护性酶活性与小麦抗旱性研究植物在干旱胁迫下的脂膜损伤和膜透性的增加是干旱伤害的本质之一。研究发现不同水分胁迫处理对耐旱性不同的小麦品种旗叶中的某些酶的影响相似于叶片衰老时部分酶活性的变化，如过氧化物酶。有些学者由此认为干旱引起膜伤害是由于生物自由基引起膜中不饱和脂肪酸过氧化和保护酶系统中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)活性下降造成的。大量的研究表明，小麦的抗旱性与水分胁迫下体内上述酶的活性呈显著正相关，耐旱性强的品种SOD活性较高。3.1.6脱落酸(人8人)与小麦抗旱性研究ABA是一种胁迫激素，它在调节植物对逆境的适应中最为重要，ABA主要通过促进气孔关闭，抑制气孔开放，促进水分吸收，提高水的通导性来增加植物的抗性。在低温、高温、干旱和盐害等多种胁迫下植物体内ABA含量大幅度升高。Lu等多人的研究结果指出，在干旱胁迫下，小麦叶片中内源ABA含量提高，而且抗旱品种比不抗旱品种积累的ABA多，从而能够刺激气孔关闭，减缓旱情，所以干旱胁迫下叶片中内源ABA含量可以作为小麦抗旱的指标。3.2提高植物耐旱性的基因工程研究3.2.1导入有渗透调节功能的关键合成酶基因的研究植物在干旱胁迫条件下会产生一些具有保水作用的小分子物质，使细胞能维持一定的膨压。这些小分子物质被称为渗透调节物质，海藻糖、甜菜碱、脯氨酸、甘露糖等是耐旱植物常常积累的物质。如来自酵母的海藻糖合成酶基因(TPS1)、来自大肠杆菌的海藻糖合成酶基因(otsA和otsB)转入烟草都能提高转基因烟草的耐旱性和保水能力(Holmstrometal，1996；Goddijneta，1997；赵恢武etal，2000)。将甜菜碱合成有关酶(胆碱氧化酶CodA)导入烟草、拟南齐、小麦等作物，发现转基因植物的耐旱性都有不同程度的提高(SakamotoAetal，1998；郭北海elat2000，李银心elat，2000)。3.2.2导入解毒酶基因的研究干旱胁迫下，由于气孔关闭，光合作用产生的电子会传递给氧，生成超氧化物自由基，对细胞有强烈的毒害。良好的抗氧化系统是植物干旱胁迫耐性的重要组成部分。人们己经对干旱胁迫下植物体内抗氧化防御系统进行了大量研究。现己确定它是由一些能清除活性氧的酶系和抗氧化物质组成，如起氧歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAD)和抗坏血酸等。在整个氧化防御系统中，SOD是所有植物在氧化胁迫中起重要作用的抗氧化酶，根据它结合的金属离子的不同，SOD可以分的Cu/Zn-SOD、Mn-SOD和Fe-SOD三种类型。McKersie将烟草Mn-SOD表达到苜蓿的叶绿体和线粒体中，使苜蓿在干旱胁迫下的产量和存活率都有了提高。GuptaA将豌豆的Cu/Zn-SOD和VmCamp将拟南芥的Fe-SOD转入烟草，转基因烟草的抗干旱能力都得到增强，这可能是SOD提高了转基因烟草的抗干旱胁迫引起的氧化胁迫能力的结果。3.2.3导入非酶类蛋白的研究LEA基因（编码胚胎发育后期丰富蛋白），Xu等将来源于大麦的LEA蛋白基因HVA1蛋白基因导入水稻后，转基因水稻在干旱条下比对照生长快，解除胁迫后恢复也快，表明通过转LEA蛋白来提高植物的耐旱性有很大潜力。脱水素（dehydrin）是LEA中研究最多的，北京大学林忠平实验室从厚叶旋蒴苣苔（Boeacrassifolia）中克隆了两种脱水素基因BDN1和Bch18，转基因烟草对干旱和寒冷有反应。3.2.4导入转录因子的研究Yamaguchi-Shinozaki等（1992）利用差示筛选法从干旱处理的拟南芥中，克隆了一批受干旱诱导的基因，其中，rd29基因编码与LEA蛋白非常相似的蛋白（Artus等1996），它对干旱、高盐及低温胁迫均可产生应答反应，对其启动子的研究发现有二个不依赖于ABRE的DRE顺式作用元件（Dehydrationresponsiveelement,DRE）（Yamaguchi-ShinozakiandShinozaki1994）。其核心序列是TACCGACAT。目前已分离克隆的与逆境耐性有关的基因，如rd17,kin1,cor6.6等基因的启动子区域内也都发现了DRE元件或DRE核心序列元件（Wang等1995,Iwasakietal1997），此外，在低温应答元件CRT（C-repeat）（Baker等1994）、LTRE（Lowtemperatureresponsiveelement）（Jiang等1996）也存在CCGAC保守序列，说明DRE元件普遍存在于逆境胁迫应答基因的启动子中，并对逆境胁迫应答起重要作用。Liu等人（1998）首次利用酵母单杂交系统，从拟南芥的cDNA表达文库中克隆到二种编码与DRE元件结合的转录因子（DRE-Bindingprotein）cDNA，分别命名为DREB1A，DREB2A。它们在氨基酸序列上没有显著的相同性，但都含有一段非常保守的由58个氨基酸组成的DNA结合区域（EREBP/AP2结构域）。目前，在许多植物中都发现这种含有EREBP/AP2结构域的转录因子，并分别与抗病、抗逆等信号传递有关（见刘强等2000）。刘强等（2000）认为，一个DREB基因可以调控多个与植物干旱、高盐及低温耐性有关的功能基因的表达。Kasuga等（1999）的研究证实，导入到拟南芥的DREB1A基因可以同时促进与逆境胁迫耐性有关的基因rd29、rd17、kin1、cor6.6、cor15a以及erd10的表达，转基因植株的抗逆性大大增强。同样，低温耐性转录因子CBF1的转基因植株的耐低温能力有显著提高（Jaglo-Ottosen等1998）。由于植物的逆境耐性是由多基因调控的复杂性状，依靠导入单个功能性蛋白基因很难实现植物抗逆性的综合提高。因此，利用一个关键性转录因子促进多个功能基因的表达，从而增强植物的抗逆性，已经成为植物抗逆基因工程的研究热点。3.3小麦抗旱性鉴定方法的研究3.3.1田间直接鉴定法将鉴定品种直接种于田间，在自然条件下控制灌水，造成不同的水分胁迫条件，比较不同水分状况下品种的产量表现和形态变化，从而评价品种的抗旱性。该方法受降水等环境条件影响大，年际间鉴定条件难以一致，鉴定结果不能重复，因此需要进行多年多点鉴定才能正确评价一个品种的抗旱性。方法简单，无需特殊设备，又有产量结果，易为育种者接受。该方法主要用于对育成品系的抗早性进行初步筛选。3.3.2干旱棚、抗旱池、或人工模拟气候箱法将鉴定品种种植于可控制水分及其其他环境条件的干旱棚、抗旱池、人工模拟气候箱法，进行研究不同生育期内对生长发育、生理过程或产量的影响，或以田间自然土壤水分状况为对照，比较抗旱指标的变化来评价作物的抗旱性。这种人工方法克服了田间鉴定的一些缺点，鉴定结果便于比较，也比较可靠。同时便于控制胁迫时间、强度和重复次数，可选择选择在任何生长发育阶段进行鉴定，但该方法需要一定设备，能源消耗大，不能大批量进行，同时干旱棚与大田的环境条件可能带来试验误差。3.3.3实验室鉴定实验室鉴定是在室内进行的鉴定的方法，它能够从生理生化角度对作物品种不同生育阶段进行深入分析，从而评价作物品种的抗旱性。非常适用大批量种质资源的鉴定筛选和抗旱生理研究。常用的有高渗溶液法、反复干旱法和分子生物学方法等。3.4小麦抗旱性鉴定的指标研究进展由于对干旱长期适应的结果，抗旱性不同的小麦品种形成了不同的形态解剖特征和生理生化特性，这些不同的形态特征和生理特性必然影响到小麦的生长发育，并最终决定产量的高低。据此，可把小麦的抗旱性鉴定指标分为形态指标、生理生化指标和产量指标三大类。一般说来，作物在干旱条件下，生长和形成产量的能力是鉴定抗旱性的可靠指标。但简单快速、可靠的形态和生理生化指标在抗旱机理研究和抗旱育种中显然具有重要的意义。3.4.1形态指标作物在水分胁迫下，体内细胞在结构、生理及生物化学上发生一系列适应性改变后，最终要体现在植株的形态上有所表现，因而有些形态指标可用于抗旱性鉴定。根系发达程度，如根数、根长、根重、根冠比等与抗旱性相关；胚芽鞘长的品种抗旱性强，旱地产量较高，抗旱性弱的品种胚芽鞘较短；叶的形态指标：叶色、叶姿、叶片大小、腊质有无、叶片萎蔫程度，株高、拔节期苗高、叶面积和十物重。据研究，小麦拔节期叶面积系数与旱地产量和抗旱指数呈极显著正相关。即拔节期叶面积系数高，旱地产量较高，抗旱性较强。籽粒饱满度、穗型、穗长、穗粒数、千粒重、穗节指数和穗叶距均可作为抗旱鉴定的指标。3.4.2生理生化指标干旱对作物的影响广泛而深刻，其影响着作物的光合作用，呼吸作用，水分和营养的吸收运输等各种生理过程。品种间在抗旱性方面所表现的差异，都有其相应的生理生化基础。目前，许多学者对于抗旱性鉴定的生理生化指标做了大量的研究。据不完全统计，研究较多的生理生化指标主要有叶水势、含水量、相对含水量、自由水、束缚水、叶片失水率、保水力、脯氨酸、甜菜碱、可溶性糖、光合速率、气孔导度、蒸腾速率、细胞间隙CO2、叶绿素含量、过氧化氢酶、过氧化物酶、超氧化物歧化酶、硝酸还原酶、可溶性蛋白含量、丙二醛、质膜透性、水分利用率、脱落酸（ABA）。3.4.3产量鉴定指标兰巨生（1990）提出了抗旱指数，抗旱指数=（Ya/Ym）（Ya/Yaa），其中Ya，Ym，Yaa分别表示基因型旱地产量，水浇地产量和鉴定试验中供鉴基因型在旱地产量的均值，从而弥补了Fischer（1978）提出的胁迫敏感指数的不足，使农作物抗旱性鉴定的产量指标在生物学意义上有了实质性的改进。3.4.4综合评价指标主要采用抗旱系数、抗旱指数、抗旱总级别值法、抗旱性隶属函数法和灰色关联度分析法等综合评价指标，使得单个指标对评定抗旱性的局限性得到其他指标的弥补和缓解，从而使评定的结果与实际结果较为接近。在作物抗旱节水鉴定评价中发挥了重要作用。但上述评价指标统计、计算、分析复杂。小麦的抗旱性是一个复杂的综合特性。小麦在不同生育时期对水分的反应不同，在不同时期抵抗干旱胁迫的内在机制也不同，因而要对一个材料全生育期抗旱性进行鉴定，不仅需将形态指标、生理生化指标及产量指标相结合，且需综合评定各生育时期的抗旱性，从而提高小麦抗旱性鉴定的可靠性和科学性。4研究内容转基因小麦株系的分子鉴定（Southernblot、Northernblot分析TaEBP的拷贝数、表达特性等特点）。优良转基因小麦株系的大田抗旱性鉴定。比较转TaEBP基因小麦与受体在小麦抗旱能力上的差异。5研究方法及技术路线5.1参试材料参试材料如表1所示。表1参试小麦品种及特性转基因株系外源基因受体亲本（ck）G9-X1123TaEREBl新春9号转基因株系外源基因受体亲本（ck）G9-X1123TaEREBl新春9号G9-X1125TaEREBl新春9号G9-X1127TaEREBl新春9号G9-X1129TaEREB2新春9号G9-X1134TaEREB2新春9号G9-X1136TaEREB2新春9号G9-X1139TaEREB2新春9号新春9号(CK)新春9号小偃22(CK)小偃22晋麦47(CK)晋麦47受体亲本特征特性春性，中热，抗病和耐干热风等，湿面筋含量高、筋力强春性，中热，抗病和耐干热风等，湿面筋含量高、筋力强春性，中热，抗病和耐干热风等，湿面筋含量高、筋力强春性，中热，抗病和耐干热风等，湿面筋含量高、筋力强春性，中热，抗病和耐干热风等，湿面筋含量高、筋力强春性，中热，抗病和耐干热风等，湿面筋含量高、筋力强春性，中热，抗病和耐干热风等，湿面筋含量高、筋力强春性，中热，抗病和耐干热风等，湿面筋含量高、筋力强弱春性，中熟，耐寒，高产稳产冬性中热品种，抗旱抗逆，优质，适应性好受体亲本申定时间受体亲本选育单位新疆自治1999年区审区农科院核生所新疆自治1999年区审区农科院核生所新疆自治1999年区审区农科院核生所新疆自治1999年区审区农科院核生所新疆自治1999年区审区农科院核生所新疆自治1999年区审区农科院核生所新疆自治1999年区审区农科院核生所新疆自治1999年区审区农科院核生所西北农林2003年国审科技大学山西省农1998年国审科院棉花研究5.2试验方法5.2.1转TaEBP新春9号小麦株系的分子鉴定小麦总DNA提取及Southernblot1）小麦总DNA提取（采用CTAB法）取新鲜叶片3-5g，在液氮冷冻下迅速研磨成粉末，然后将粉末放到1.5ml离心管中;加入600pl65°C预热的提取缓冲液（CTAB），充分混匀；将离心管置于65°C水浴中温育30-60分钟，其间温和摇动离心管数次；取出离心管，冷全室温，加入等体积的酚:氯仿:异戊醇（v/v/v=25:24:1）溶液，混匀，4C，12000rpm/10min；上清液移入另一离心管中，加入等体积氯仿，4C，12000rpm/10min；离心后将上清液移入另一离心管中，加入0.6倍体积的预冷的异丙醇，轻轻混匀，室温静置20-30min,4°C,8000rpm/10min,弃上清，将离心管倒置于吸水纸上，控十上清液，70%乙醇清洗两次，室温干燥后溶于100pl1XTE(pH8.0)中；加入川1RNA酶溶液(10mg/ml)，混匀，37C保温1-2h；加入等体积的酚一氯仿溶液，轻轻混匀后，静置10分钟，4C，8000rpm/5min；取上清液，再加入等体积的氯仿/异戊醇，轻轻混匀后，4C，10000rpm/5min；取上清液，加入1/10体积3M醋酸钠(pH4.8)或5MNaCI，混匀后加入二倍体积预冷的无水乙醇，轻轻混匀，静置30min，4C，10000rpm/5-10min，用70%乙醇清洗两次，室温干燥；根据DNA量加入适量(30^1)1XTE(pH8.0)或ddH2O溶解DNA；用紫外分光光度计测定DNA浓度，并取少量样品用于0.8%琼脂糖凝胶电泳，检测DNA质量，4C或一20C储存DNA。PCR检测PCR反应体系：弓I物：TaEREBlF：5’-CATGCCCTTGTCTGCTGGTTTCTAC-3’，Nos:5’-GCAAGACCGGCAACAGGATTCA-3。TaEREB2F：5’-CGACGACTCCGCCAACCA-3’，Nos:5’-GCAAGACCGGCAACAGGATTCA-3。对转基因植株基因组DNA进行特异引物扩增，反应体系为25^1，引物扩增体系包含加1模板DNA，0.2p1TaqDNA聚合酶，两条引物各为1.0似，10xPCRbuffer为2.5^1，dNTP混合物(2.0mmo1/L)为2.0^1，Mg2+(25mmo1/L)为2^1，加无菌水至25^1，以质粒作为阳性对照，以非转基因植株DNA为模板作为阴性对照。TaEREBl反应条件为：94C预变性5min，然后94C变性30s，68C退火30s，72C延伸45s，29个循环，最后72C延伸10min。TaEREB2反应条件为：94C预变性5min，然后94C变性30s，68C退火复性30s，72C延伸45s，29个循环，最后72C延伸10min。Southern杂交用适当的限制性内切酶消化基因组DNA样品(10瞄)。进行琼脂糖凝胶电泳(0.8%的琼脂糖胶)，40V恒压电泳12h左右。转膜：电泳完毕后，将凝胶在漠化乙锭溶液中染色10min；紫外灯下检查酶切结果并切掉多余的胶；凝胶转入0.25NHCI中脱嘿吟15min；蒸馏水冲洗2次，再用0.4NNaOH漂洗一次；将凝胶翻转后放在滤纸桥上，放上一张与凝胶大小相当的尼龙膜(Hybond-N+，Amarsharm)；赶除气泡，在膜上放3层滤纸，与尼龙膜大小相同，赶除气泡；将凝胶周围用胶片封好，放上大小相当的吸水纸，压上约500g的重物；转膜10h以上，其间更换吸水纸；转膜完成后，用2XSSC洗膜10min,用滤纸吸十，保鲜膜包好；紫外交联，4°C存放全杂交。杂交及洗膜：将Hybond-N+膜放入杂交管中，加入杂交液：5XHSB2ml，DenhardIII1ml，ssDNA（10mg/ml）0.5ml，ddH2O（PH7.0）6.5ml；将Hybond-N+膜置于杂交炉中，55-65C/6-8h；将变性探针（同位素a-32P标记）加入到杂交管中，杂交12h以上；在45C条件下洗膜，先用2XSSC/0.1%SDS，洗20min，再用1XSSC/0.1%SDS；将膜放在滤纸上晾干，用保鲜膜包好，置于X-射线摄影暗盒的增感屏上，在暗室中将X-光片放在杂交膜上，再放上另一张增感屏，压紧X-射线摄影暗盒，一70C曝光1-3周。小麦总RNA提取及Northernblot1）小麦总RNA提取（采用异硫氤酸胍法）取1〜2g小麦叶片放入研钵，加液氮研磨成粉末状，转入己加好3ml4M异硫氤酸胍（冰浴预冷）的50ml离心管中，迅速摇匀，然后在冰上静置10min；加入0.3ml2M醋酸钠（pH4-5），摇匀；加入3ml水饱和酚，摇匀；加入1ml氯仿，摇匀：待液体颜色变为褐色，于4C/8000rmp/13min上清转移至另一50ml离心管中，加入2倍体积无水乙醇沉淀，-20C沉淀l-2h或-70C沉淀30min;4C/8000rmp/13min，弃上清，倒置于吸水纸上使残留液流净，在超净台上吹十沉淀;加入1m14M氯化锂，用枪头吹打使沉淀溶解呈悬浮液状态，转移至1.5ml离心管中，13000prm离心15min（可常温），弃上清，再离心30s，用枪头吸净残留的上清；加0.4mlDEPC处理水溶解沉淀，用枪头吹打使其溶解后，加入〃2体积水饱和酚、1/2体积氯仿，混匀，13000rmp/5min（可常温）；吸取上清，加入1/10体积3M醋酸钠（pH.48）和2倍体积无水乙醇，-20C沉淀l-2h或-70C沉淀30min；4C/13000rmp/15min，弃上清，再离心30秒，用枪头吸净残留的上清，在超净台上吹十沉淀：加适量DEPC处理水溶解沉淀，-20C保存备用；测定总RNA的OD26值，确定其含量;1.2%琼脂糖凝胶（30ml凝胶中含有5ml甲醛），lXMOPs缓冲液，电泳检测。2）变性凝胶电泳电泳及转膜用具的处理：0.1NNaOH/1mMEDTA浸泡lh以上，用清水冲洗干净备用。配1.2%变性胶:48.5mlDEPC水，15ml5XMOPS/EDTA和0.9g琼脂糖；溶胶后，55“C水浴保温20一30min；加12.5ml37%的甲醛，混匀后倒胶；样品处理:10-30pg总NRA或3pgmRNA溶于5plDEPC水，加19plRNAloadingbuffer,65°C/15min，置冰上3-5min；电泳：10V/cm120V电泳至漠酚蓝距边约2cm处停止（约2h）；紫外灯下观察照像，记录带的位置；250ml10XSSC中浸泡20min去甲醛，重复一次。3）转膜在玻璃板上搭滤纸桥，两端浸入10XSSC溶液中；胶倒置于滤纸桥上，赶出胶与滤纸间的气泡；用保鲜膜封胶的四边；将尼龙膜铺于胶上赶出膜与滤纸间的气泡;加三层DEPC水浸湿的滤纸，其上在加二张滤纸；加多层吸水纸，转移16-20h，其间不断换纸；转移完成后，在膜上做好加样孔标记；取膜2XSSC浸泡5min；紫外交联；4C保存至杂交。4）Northern杂交杂交及洗膜:将Hybond-N+膜放入杂交管中，加入杂交液：5XHSB2ml，Denhardill1ml，ssDNA（10mg/ml）0.5ml，ddH2O（pH7.0）6.5ml；将Hybond-N+膜置于杂交炉中，55-65C/6-8h；将变性探针（同位素0-32P标记）加入到杂交管中，杂交12h以上；在45C条件下洗膜，先用2XSSC/0.1%SDS，55-65C洗两次，每次15min，再用1XSSC/0.1%SDS，55-65C洗两次，每次15min；将膜放在滤纸上晾干，用保鲜膜包好，置于X-射线摄影暗盒的增感屏上，在暗室中将X-光片放在杂交膜上，再放上另一张增感屏，压紧X-射线摄影暗盒，一70C曝光1-3周。5.2.2小麦抗旱相关指标及其测定方法形态指标作物在水分胁迫下，体内细胞在结构、生理及生物化学上发生一系列适应性改变后，最终要体现在植株的形态上有所表现，因而有些形态指标可用于抗旱性鉴定。1）根系：根数、根长、根重、根冠比等与抗旱性相关；2）胚芽鞘长：胚芽鞘长的品种抗旱性强，旱地产量较高，胚芽鞘较短品种抗旱性弱；3）叶的形态指标：叶色、叶姿、叶片大小、腊质有无、叶片萎蔫程度；4）株高、拔节期苗高、叶面积和干物重；5）叶面积系数：小麦拔节期叶面积系数与旱地产量和抗旱指数呈极显著正相关。即拔节期叶面积系数高，旱地产量较高，抗旱性较强；6）芒性状、颖花结实率：在干旱胁迫下抗旱品种颖花结实率较高；7）籽粒饱满度、穗型、穗长、穗粒数、千粒重、穗节指数；8）穗叶距：穗叶距可作为抗旱鉴定的指标之一。生理生化指标（大田鉴定）大田鉴定采用小区试验来进行。试验地点设于陕西杨凌国家农业高新技术产业示范区、杨凌现代农业企业孵化园，选择肥力条件较为均匀一致的田块。试验随机区组设计，每小区10行，行长8尺，行距0.75尺，株距0.1尺。其中10个材料（GX-1123、GX-1125、GX-1127、GX-1129、GX-1134、GX-1136、GX-1139、新春9号（CK）、小偃22（CK）、晋麦47（CK）），设3个处理（雨养1（即播种后全生育期靠自然降水）、灌一次水11（灌溉即在越冬前）和灌两次水III三种水分处理），每个处理3重复。于2010年10月17日带尺点播。测定的生理生化指标如下：1）拔节期测定叶片相对含水量的测定：上午8：30到9：00取样，剪取待测叶片，用吸水纸吸干表面的水分，放入铝盒中称鲜重，然后将待测组织置于去离子水中浸泡5小时使其达到饱和后，取出用吸水纸擦干样品表面水分称饱和鲜重，于105°C下杀青10min，再于80°C下连续烘干，直到物质重量不再变化为止，根据公式计算相对含水量。相对含水量（RWC）%=［（原始鲜重-十重）/（饱和鲜重-十重）］X100%叶片相对电导率的测定:在50mL离心管中加入20mL无离子水，用DDS-370A型电导仪测定电导率E0；取0.1g叶片，放入无离子水中，室温静置30min，160r/min振荡50min，测定电导率（E1）；100C恒温水浴20min，自然冷却到室温，测定电导率（E2），3次重复，计算叶片相对电导率（RCR）。RCR（%）=［（E1-E0）/（E2-E0）］X100%丙二醛（MDA）的含量：采用TBA法用硫代巴比妥酸法测定。取小麦植株上不同叶位的叶片3〜5片，洗净擦十，剪成0.5cm长的小段，混匀；称取叶片切段0.3g放入冰浴的研钵中，加入少许的石英砂和5mL5%TCA溶液（分两次加入），研磨成匀浆，并转移至离心管中，于3000xg离心15min低温（0〜4C）；取上清液2.0mL放入刻度试管，加入5mL0.5%硫代巴比妥酸溶液，摇匀。将试管放入沸水中煮沸10min（自试管中出现小气泡开始计时），然后，迅速将试管放入冷水中冷却；待试管中的溶液冷却后，3000xg离心15min，吸取上清液用于测定吸光值，以0.5%硫代巴比妥酸溶液为空白分别测定在532nm和600nm和450nm处的吸光值。结果计算：MDA（mmol•gFW-1）={6.452x（D532-D600）-0.559xD450}x{Vt/（FWxVs）}ABA含量：叶枕距3〜5cm时测定，采用高效液相色谱法测定。叶绿素含量（Chl）的测定：采用SPAD-502叶绿素仪分别测定主茎旗叶和倒二叶的SPAD值。采用日本产SPAD-502型叶绿素计测定叶片的SPAD值。随机取20张小麦叶片，每次采样时间为上午九点左右，选取长势和大小相似的叶片，用保鲜袋装好，迅速带回实验室测定小麦叶片的SPAD值（取叶片的底部、中部和顶部的平均值，测定时避开叶脉）。游离脯氨酸含量的测定：采用磺基水杨酸法测定。准确称取不同处理的待测植物叶片各0.5g，分别置大管中，然后向各管分别加入5ml3%的磺基水杨酸溶液，在沸水浴中提取10min（提取过程中要经常摇动），冷却后过滤于干净的试管中，滤液即为脯氨酸的提取液。吸取2ml提取液于另一干净的带玻塞试管中，加入2ml冰醋酸及2ml酸性茚三酮试剂，在沸水浴中加热30min，溶液即呈红色。冷却后加入4ml甲苯，摇荡30s，静置片刻，取上层液至10ml离心管中，在3000rpm下离心5min。用吸管轻轻吸取上层脯氨酸红色甲苯溶液于比色杯中，以甲苯为空白对照，在分光光度计上520nm波长处比色，求得吸光度值。可溶性蛋白含量：采用考马斯亮兰G-250染色法。称取鲜叶片0.2g，加入5mlpH7.8的磷酸缓冲液于冰上研磨成匀浆，15000rmp/min4°C离心20min。取上清夜0.lml于另一试管中，加入5ml蛋白质测定剂（0.01%（W/V）考马斯亮蓝G-250，8.5%（W/V）磷酸），充分混合，放置2min后，在595nm波长下比色，测定吸光度。以牛血清蛋白代替上清液制作标准曲线，并通过标准曲线查得蛋白质含量。蛋白质含量用mg/g.FW表示。2）孕穗-开花期：主要进行以下指标的测定：净光合速率（Pn）、蒸腾速率（Tr）、水分利用效率（WUE）、气孔导度（Gs）。用美国LI-COR公司生产的Li-6400型光合仪于晴天上午9:00〜11:00测定，穗位叶片重复3次取平均值，计算单叶水分利用率WUE=Pn/Tr。ABA含量：高效液相色谱法测定。游离脯氨酸含量的测定：采用磺基水杨酸法测定。3）灌浆期ABA含量：高效液相色谱法测定游离脯氨酸含量:采用磺基水杨酸法测定。冠层温度胁迫差（CTD）:作物冠层温度胁迫差（CTD）是指大气温度与作物冠层温度的差值，即：CTD=Tair-Tcanopy叶绿素含量（Chl）的测定：采用SPAD-502叶绿素仪分别测定主茎旗叶和倒二叶的SPAD值。采用日本产SPAD-502型叶绿素计测定叶片的SPAD值。随机取20张小麦叶片，每次采样时间为上午九点左右，选取长势和大小相似的叶片，用保鲜袋装好，迅速带回实验室测定小麦叶片的SPAD值（取叶片的底部、中部和顶部的平均值，测定时避开叶脉）；取测定过SPAD值的小麦叶片，去叶脉称重剪碎后放入带塞25mL试管中，用95%的乙醇在65°C左右恒温箱中浸提3〜4h，取出冷却后用95%的乙醇定容至刻度，摇匀后用紫外分光光度法测定叶绿素a和叶绿素b含量，二者之和为叶绿素含量。4）乳熟期游离脯氨酸含量的测定:采用磺基水杨酸法测定可溶性糖含量：用恩酮比色法测定。称取鲜叶片0.5g，剪碎后放入离心管中，加8ml蒸馏水，于沸水浴中提取30min，提取2次，提取液离心，转入25ml试管中，定容。吸取0.1ml提取液于另一试管中，加入5ml蒽酮试剂，迅速于冰水浴中冷却，各管加完后同时进行沸水浴，管口加盖玻璃球以防蒸发。自水浴重新沸起，准确煮沸10min取出，用流水冷却，室温静置10min，在620nm波长下比色，记录吸光度。以葡萄糖代替提取液制作标准曲线，计算所测定叶片中可溶性糖的百分含量。5）成熟期收获后调查株高、穗粒重、千粒重，地上生物量和产量等指标。计算各品种的抗旱指数。抗旱指数（DI）=GYS.T2・GYS.W-1・GYCK.W・（GYckt2）-iGYS.T——待测材料胁迫处理籽粒产量GYS.W——待测材料对照处理籽粒产量GYCK.W——对照品种对照处理籽粒产量GYcK.t—对照品种胁迫处理籽粒产量

5.3技术路线本研究的技术路线如下图所示:6预期结果通过分子生物学鉴定方法，利用Southernblot、Northernblot分析TaEBP的拷贝数、表达特性等特点。利用生理生化指标鉴选体系筛选抗旱性优良、农艺性突出的转TaEBP基因小麦新品系、新种质。建立实用化抗旱转基因小麦品种抗旱性筛选、评价的综合指标体系。7本研究的创新PCR、Southernblot、Northernblot分子检测跟踪外源基因。采用雨养、浇一水和浇二水三种试验处理方法，比较转TaEBP基因小麦与受体对十旱等环境的适应力及在抗旱等能力上的差异。筛选抗旱性优良、农艺性突出的转TaEBP基因小麦新种质、新品系。通过转基因小麦各生长发育阶段抗旱性相关形态、生理生化、产量指标综合评价分析，建立实用化转基因小麦品种抗旱性筛选、评价的综合指标体系。8研究所需要的主要仪器设备和试剂8.1仪器设备离心管、PCR管、PCR仪，LI-6400光合仪、移液枪、枪头、电泳装置、刀片、尼龙膜及转膜装置、吸水纸、杂交炉及杂交管、X射线摄影盒、冰箱、紫外交联仪、SPAD-502叶绿素仪、高效液相色谱仪、电子称、烘箱、电导仪、真空泵、恒温水浴锅、分光光度计、分析天平、连续进样器、试管、高速冷冻离心机、研钵、培养皿、容量瓶、漏斗。8.2试剂CTAB提取缓冲液、酚/氯仿/异戊醇、异丙醇、70%乙醇、RNA酶液、1XTE缓冲液、3M醋酸钠、无水乙醇、10XBuffer酶切缓冲液、ddHR、限制内切酶、琼脂糖、SSC、PCR试剂、DNA回收试剂盒、DR-I（和II）溶液、杂交液、洗膜液、异硫氤酸胍提取液、氯化锂、DEPC、MOPS缓冲液、甲醛、上样液（Dyemix）、RNAloadingbuffer、蒽酮、磺基水杨酸、冰醋酸、酸性茚三酮、硫代巴比妥酸（TBA）溶液、5%三氯乙酸（TCA）、NBT—Met溶液、乙二胺四乙酸（EDTA）溶液、Na2HPO4—NaH2PO4缓冲液、牛血清白蛋白溶液、愈创木酚试剂、ABA标样、葡萄糖标准液、浓硫酸。9论文工作进展安排2010.08-2010.10查阅文献，了解试验概况。2010.11设计准备试验，播种小麦。2010.12整理资料，系统安排试验，写开题报告。2011.07转基因小麦的分子鉴定、形态指标、不同生育期指标测定。2011.07-2011.12整理分析实验数据，撰写论文。2012.01-2012.06论文修改定稿，准备答辩。10实验所需的经费预算本研究的经费预算如表2所示。表2实验所需的经费预算项目费用（元）仪器使用费10000试剂购买费25000其它2000总计3700011研究工作中面临的技术难点和拟采取的解决办法在分子鉴定实验上，由于之前接触的不多，对实验中的很多细节、操作等还不熟悉，所以在做实验之前应认真查阅文献，做好各种准备（包括实验仪器设备、试剂等），熟悉实验过程；然后对于实际操作最好先看看别人做一遍自己再动手，提高实验成功率。由于抗旱性本身的复杂性以及研究者的知识储备、技术力量、实验仪器设备等诸多因素的限制，在实际工作中不能对其形态指标及其生理生化指标进行全面系统的研究，只能涉及少数几个环节。在仪器使用上：实验中所用LI-6400便携式光合测定系统、紫外分光光度计等仪器学校中数量有限，我们试用仪器时间正值试用高峰期，所以仪器的借用安排会是一个困难。因此，应积极联系有关单位，提前预约，克服困难，争取最佳状态的完成试验计划。参考文献徐兆师.小麦抗逆相关DREBE/RF转录因子基因的克隆与鉴定.XUZhao-ShiMAYou-ZhiCHENGXian-Guo.IsolationandAnalysisofTwoGenesEncodingPutativeEREBPTranscriptionFactorsinTriticumaestivumL.王建华，刘鸿先,徐同.1989.超氧化物歧化酶(SOD)在植物逆境和衰老生理中的作用.植物生理学通讯,27(1):1〜7.HanZhiping,AnLijia,HouHesheng.TheStructureandFunctionofAP2/EREBPTranscriptionFactors.ChineseAgriculturalScienceBulletin.2006(22).闽东红.小麦抗逆相关的ERF转录因子基因及功能基因的克隆及表达特性研究.NIZhi-yong,XUZhao-shi,LIULi.IsolationandCharacterizationofaTranscriptionFactorTaDREB6GenefromTriticumaestivumL..JournalofTriticeaeCrops.2008,28(3):357-363.李建平，张燕红，王冬梅等.一种改良的Southern印迹杂交方法.新疆农业科学2007,44(S3):116-118.HOUJing，MAFengming，CHENShengyong.ExtractionofgenomicDNAfromsugarbeetandSouthernanalysis.JournalofNortheastAgriculturalUniversity.39(12):14〜18.陈毓荃.2002.生物化学实验方法和技术.北京：科学出版社：171〜172.芦春斌.转基因拟南芥中外源基因的Southernblot检测.种子(Seed).葛宝宇，林轶，侯和胜.ERF类转录因子的结构与功能.安徽农学通报.2007,13(20).关周博，王士强.2009.模拟干旱胁迫下冬小麦胚芽鞘长度变化及与抗旱性的关系研究.干旱地区农业研究,27(4)：125〜129.张年辉.植物RNA分离与Northern杂交方法的改进及质体信号对核基因表达和叶片形态建成的影响.郝再彬，苍晶.2004.植物生理实验.哈尔滨：哈尔滨工业出版社：104〜106.蒋春志，张艳敏.2002.转BADH基因小麦的水分生理特性研究.华北农学报，17(4):140〜141.景蕊莲.1999.作物抗旱研究的现状与思考.干旱地区农业研究，17(2):79〜85.金善宝.1996.中国小麦学.北京：中国农业出版社:754〜758.李德全，邹琦.1992.土壤干旱下不同抗旱性小麦品种的渗透调节和渗透调节物质.植物生理学报，1:34〜37.刘孟雨，陈培元.1990.水分胁迫条件下气孔与非气孔因素对小麦光合的限制.植物生理学通讯,04:6〜10.邵宏波，梁宗锁,邵明安.2006.小麦抗旱生理生化和分子生物学研究进展与趋势.草业学报，15(3):5〜17.山仑.2003逆境生物学研究如何为发展我国旱地农业服务.河南大学学报(自然科学版)，33(3):1〜3.山仑，邓西平.2006.生物节水研究现状及展望.中国科学基金,2:66〜71.山仑，黄占斌,张岁岐.2000.节水农业.北京:清华大学出版社：12〜13.孙群，胡景江.2006.植物生理学研究技术.杨凌：西北农林科技大学出版社136〜138.王玮，邹琦.1997.渗透胁迫对不同抗旱性小麦品种胚芽鞘生长的影响.植物生理学通讯,33(3):168〜171.张灿军，冀天会.2007.小麦抗旱性鉴定方法及评价指标研究I鉴定方法及评价指标，中国农学通报，23(9):226〜230.张木清，陈如凯.2005.作物抗旱分子生理与遗传改良.北京：科学出版社:369〜394.张荣芝，卢建祥.1991.旱地冬小麦抗旱性的形态特征及生理特性的初步研究.河北农业大学学报年,02:25〜30.邹琦.2000.植物对水分胁迫的响应及其在旱作农业和抗旱育种中的应用.见:吴平,陈昆松.植物分子生理学进展.杭州：浙江大学出版社:207〜215.AbbatePE，DardanelliJL，CantareroMG，MaturanoM，etal2004.ClimaticandWaterAvailabilityEffectsOnWater-UseEfficiencyinWheat.CropScience44(2):474〜478.ChandarBR,PathanM，Blum,Aetal.1999.Comparisonofmeasurementmethodsofosmoticadjustmentinricecultivars.CropSci，39:15〜158