常用的定量PCR荧光探针-生物化学与分子生物学课件

生物系统中mRNA或DNA等目标核酸分子的分析鉴定必须回答如下三个基本问题：目标核酸分子是否存在于实验标本中。实验标本中目标核酸分子的含量是多少。实验标本中目标核酸分子的序列如何；以及与其他实验标本中的情况比较，目标核酸分子的序列是否有变化。核酸实验研究技术进展－11生物系统中mRNA或DNA等目标核酸分子的分析鉴定核酸实验研证明目标核酸分子是否存在于实验标本中的基本实验方法：1）杂交法，2）PCR法，3）测序法。核酸实验研究技术进展－12证明目标核酸分子是否存在于实验标本中的基本实验方法：核酸实验杂交法：序列已知，同时还要合成一个标记了的特异性探针。Dotblotting：不经过电泳，直接把检测样本点在一个适宜载体上，针对目标DNA分子或RNA分子进行杂交检测。Southernblotting：在电泳后，针对目标DNA分子的杂交检测。Northernblotting：在电泳后，针对目标RNA分子的杂交检测。目标DNA分子原位杂交检测。目标RNA分子原位杂交检测。核酸实验研究技术进展－13杂交法：序列已知，同时还要合成一个标记了的特异性探针。核酸实杂交法的优点与缺点：优点：Dotblotting：简单实用，适于进行大样本数同时检测。Northernblotting：如果检测结果阳性，其可信度要远远高于RT-PCR，因此被誉为评价基因转录的GoldenMarker。Southernblotting：对DNA病毒类病原体等的检测实用性很强。缺点：Dotblotting：由于在同一斑点位置，除了目标核酸分子外，同时还存在其它的成千上万种不同的核酸分子，而这些核酸分子有可能会与探针分子部分结合，这会促进探针分子与目标核酸分子的结合，因此将可能导致阳性结果放大，甚至是假阳性结果。Northernblotting：对低拷贝mRNA有时检测不出来，容易导致假阴性结果。核酸实验研究技术进展－14杂交法的优点与缺点：核酸实验研究技术进展－14例一：cDNAmicroarray检测SHEEC食管癌细胞NGAL基因mRNA转录实验结果反向Dotblotting核酸实验研究技术进展－15例一：反向Dotblotting核酸实验研究技术进展－1例二：Northernblotting检测SHEEC食管癌细胞NGAL基因转录mRNA实验结果NGAL化学发光法核酸实验研究技术进展－16例二：NGAL化学发光法核酸实验研究技术进展－16例三：Northernblotting检测缺氧复氧条件下心肌细胞EGR1基因转录mRNA实验结果EGR1同位素法核酸实验研究技术进展－17例三：EGR1同位素法核酸实验研究技术进展－17确保杂交法实验成功的八个关键点：关键点1：确保实验方案设计合理。关键点2：确保探针的特异性充分。关键点3：确保检测的灵敏度足够高。关键点4：确保样本质量合格。关键点5：确保实验试剂质量合格。关键点6：确保实验过程规范。关键点7：对于编码序列的cDNA，要确保没有RNA的干扰。关键点8：几种杂交法，或杂交法与其它方法联合使用，相互印证，确保实验结果可靠。核酸实验研究技术进展－18确保杂交法实验成功的八个关键点：核酸实验研究技术进展－18PCR法：序列已知，同时还要合成一对特异性引物。核酸实验研究技术进展－1优点：实验的灵敏度很高，理论上可检测实验生物系统中所存在的1个拷贝目标核酸分子。阴性结果的可信度很高。缺点：由于容易存在样本污染情况，与此同时，毕竟在实验过程中存在着目标核酸分子拷贝数人为放大这样一个事实，因此，其阳性结果的可信度不如Northernboltting或Southernboltting。9PCR法：序列已知，同时还要合成一对特异性引物。核酸实验研究例子：RT-PCR检测SHEEC食管癌细胞NGAL基因转录mRNA实验结果NGAL600bpSMS:食管癌细胞SHEECM:DNAmarker核酸实验研究技术进展－110例子：NGALSMS:食管癌细核酸实验研究技术进展－1确保PCR法实验成功的八个关键点：关键点1：确保实验方案设计合理。关键点2：确保引物的特异性充分。关键点3：确保样本质量合格。关键点4：确保实验试剂质量。关键点5：确保实验过程规范。关键点6：确保PCR变性、退火和延伸温度适度。关键点7：对于编码序列cDNA，要确保没有RNA的干扰。关键点8：几种PCR法，或PCR法与其它方法联合使用，相互印证，确保实验结果可靠。11核酸实验研究技术进展－1确保PCR法实验成功的八个关键点：1核酸实验研究技术进展－1测序法：通过电泳等手段已知实验生物系统中目标核酸的大致大小，而且是对照生物系统中不存在，或者两者相比在含量上可能有显著差别，然而序列未知。优点：可信度最高。对于解析鉴定未知核酸分子序列片段是必需的手段。缺点：目标片段边缘序列的测定结果有时不准确，在读原初测序图时要格外小心。12核酸实验研究技术进展－1测序法：通过电泳等手段已知实验生物系核酸实验研究技术进展－1目标片段边缘序列的测定结果有时不准确例子13核酸实验研究技术进展－1目标片段边缘序列的测定结果有时不准确PolyAtail核酸实验研究技术进展－114PolyAtail核酸实验研究技术进展－114核酸实验研究技术进展－115核酸实验研究技术进展－115核酸实验研究技术进展－1测定实验标本中目标核酸分子的含量16核酸实验研究技术进展－1测定实验标本中目标核酸分子的含量16核酸实验研究技术进展－1通过Dotblotting，结合斑点光密度扫描分析，测定实验标本中目标mRNA分子、目标cDNA分子或目标DNA分子的含量17核酸实验研究技术进展－1通过Dotblotting，结合A永生化食管上皮细胞SHEEB食管癌细胞SHEEC例子：cDNAmicroarray（反向Dotblotting）检测SHEEC食管癌细胞与永生化食管上皮细胞SHEE中NGAL基因转录mRNA相对含量实验结果判断标准：B/A2或0.5为显著性差异表达实际情况：B/A＝3.53核酸实验研究技术进展－118AB例子：cDNAmicroarray（反向Dotb核酸实验研究技术进展－1通过RT-PCR，结合条带光密度扫描分析，测定实验标本中目标mRNA分子或目标cDNA分子的含量19核酸实验研究技术进展－1通过RT-PCR，结合条带光密度扫例子：RT-PCR检测SHEEC食管癌细胞与永生化食管上皮细胞SHEE中NGAL基因转录mRNA相对含量实验结果NGAL600bpABMA:永生化食管上皮细胞SHEEB:食管癌细胞SHEECM:DNAmarkerABMGAPDH226bp核酸实验研究技术进展－120例子：RT-PCR检测SHEEC食管癌细胞与永生化食管上皮两个问题：

反转录PCR实验是否需要探针？

反转录PCR的特异性如何保证？

核酸实验研究技术进展－121两个问题：

反转录PCR实验是否需要探针？

反转录PCR核酸实验研究技术进展－1通过Northernblotting，结合条带光密度扫描分析，测定实验标本中目标mRNA分子的含量22核酸实验研究技术进展－1通过Northernblotti例一：Northernblotting检测SHEEC食管癌细胞与永生化食管上皮细胞SHEE中NGAL基因转录mRNA相对含量实验结果（化学发光）NGALABA:食管癌细胞SHEECB:永生化食管上皮细胞SHEEABGAPDHABAB500-400-300-200-100-100-80-60-40-20-核酸实验研究技术进展－123例一：Northernblotting检测SHEEC食管核酸实验研究技术进展－1例二：Northernblotting检测缺氧复氧条件下心肌细胞EGR1基因转录mRNA相对含量实验结果(同位素标记法)1正常2缺氧复氧3缺氧复氧＋溶剂对照4缺氧复氧＋F25缺氧复氧＋钙离子拮抗剂1234512345EGR1-Actin24核酸实验研究技术进展－1例二：Northernblotti核酸实验研究技术进展－1通过Southernblotting，结合条带光密度扫描分析，测定实验标本中目标DNA分子的含量25核酸实验研究技术进展－1通过Southernblotti核酸实验研究技术进展－1通过Southernblotting，结合条带光密度扫描分析，测定实验标本中目标DNA分子的含量26核酸实验研究技术进展－1通过Southernblotti核糖核酸酶保护分析（RibonucleaseProtectionAssay，RPA）是一种较好的mRNA定量检测技术。RPA的各项实验指标均优于NorthernBlotting。运用RPA可实现对目标RNA分子的高通量定量检测。核糖核酸酶保护分析RibonucleaseProtectionAssay(RPA)核酸实验研究技术进展－127核糖核酸酶保护分析核酸实验研究技术进展－127原理：以目标基因DNA为模板，利用32P-（放射法）或生物素（非放射法）作为标记信号，体外转录合成反义RNA探针。将过量的反义RNA探针与样品总RNA杂交，然后进行核糖核酸酶处理。未与探针杂交的单链RNA和过量的游离探针被降解，而目标RNA则因与探针结合形成双链而被‘保护’。杂交双链进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，用放射自显影或化学发光等方法确定目标RNA的量。核酸实验研究技术进展－128原理：核酸实验研究技术进展－128核酸实验研究技术进展－129核酸实验研究技术进展－129核酸实验研究技术进展－1适时荧光定量PCRRealtimefluorescentquantitationPCR30核酸实验研究技术进展－1适时荧光定量PCR30适时荧光定量PCR与常规PCR的本质区别常规PCR技术：对PCR扩增反应的终产物进行定性定量或半定量分析适时荧光定量PCR技术：通过一个特殊的荧光探针，对PCR扩增反应中每一次循环的产物进行适时跟踪定量分析

核酸实验研究技术进展－131适时荧光定量PCR与常规PCR的本质区别核酸实验研究技术进展realtimePCR的扩增曲线核酸实验研究技术进展－132realtimePCR的扩增曲线核酸实验研究技术进展－PE公司在同一台PCR仪上对相同模板进行96次扩增的扩增曲线图Ct值极具重现性核酸实验研究技术进展－133PE公司在同一台PCR仪上对相同模板进行96次扩增的扩增曲线Ct与初始模板的关系固定循环数后，荧光信号值与模板数成正比固定荧光信号值后，循环数与初始模板数成反比。初始模板数越多,荧光信号达到阈值时所需要的循环数(Ct值)越少起始模板浓度的对数与Ct呈线性关系，根据样品的Ct值就可计算出样品中所含的初始模板数。Threshold104103102核酸实验研究技术进展－134Ct与初始模板的关系固定循环数后，荧光信号值与模板数成正比T常用的定量PCR荧光探针SYBRGreenITaqman水解探针分子信标核酸实验研究技术进展－135常用的定量PCR荧光探针核酸实验研究技术进展－135SYBRGreenI结合到双链DNA的小沟部位只有和双链DNA结合后才发荧光核酸实验研究技术进展－136SYBRGreenI核酸实验研究技术进展－136SYBRGreenI工作原理未结合的SYBRgreenI核酸实验研究技术进展－137SYBRGreenI工作原理未结合的SYBRgreeSYBRGreenI的优点价格相对便宜使用简便可以用于不同的模板灵敏度很高SYBRGreenI的缺点特异性较差核酸实验研究技术进展－138SYBRGreenI的优点核酸实验研究技术进展－138TaqManProbes荧光素淬灭剂

与目标序列互补FAMTETJOEHEXVIC

TAMRADABCYL核酸实验研究技术进展－139TaqManProbes荧光素淬灭剂与目标序列互补FAMTaqManProbes工作原理探针与目标序列配对，荧光基团与荧光淬灭剂相邻，不发生特异荧光光能量转移Taq游离的探针荧光基团

淬灭剂

延伸时，Taq酶水解探针，荧光基团与荧光淬灭剂分离，发出特异荧光。Taq发出特异荧光光另一波长的荧光核酸实验研究技术进展－140TaqManProbes工作原理探针与目标序列配对，荧光TaqManProbes的优点：定量关系准确。随着扩增循环数增加，TaqMan探针释放出来的荧光基团成倍增加，荧光强度与扩增产物的数量呈正比关系。TaqMan探针特别适合于病毒定量、基因转录水平定量、癌细胞基因微突变检测等。敏感性高。特异性高。TaqManProbes的缺点：只适合于一个特定目标的检测。核酸实验研究技术进展－141TaqManProbes的优点：核酸实验研究技术进展－14分子信标(发夹型杂交探针)荧光基团茎由互补配对的序列组成环与目标序列互补

淬灭剂

茎(5-7bp)

环（15-30bp）FAMTexasRed核酸实验研究技术进展－142分子信标(发夹型杂交探针)荧光基团茎由互补配对的序列组成环分子信标工作原理探针与DNA模板杂交光发出荧光荧光基团单链DNA模板淬灭剂

茎

环光＋核酸实验研究技术进展－143分子信标工作原理探针与DNA模板杂交光发出荧光荧光基团单链D分子信标优点：分子信标能特异性地检测目标DNA分子信标可用于单核苷酸多态性的检测特别适用于检测点突变分子信标的缺点只能用于一个特定的目标设计困难价格较高核酸实验研究技术进展－144分子信标优点：核酸实验研究技术进展－144ABIPrism7700可以在同一反应体系中同时对多个靶DNA或cDNA分子进行扩增检测一次可以测定96个样本速度较快，一批样本的完成只需要2～3小时可应用水解探针、双链DNA结合染料和分子信标等不能实时对扩增结果进行分析，只能在全部扩增结束后再进行数据分析核酸实验研究技术进展－145ABIPrism7700可以在同一反应体系中同时对多个靶生物系统中mRNA或DNA等目标核酸分子的分析鉴定必须回答如下三个基本问题：目标核酸分子是否存在于实验标本中。实验标本中目标核酸分子的含量是多少。实验标本中目标核酸分子的序列如何；以及与其他实验标本中的情况比较，目标核酸分子的序列是否有变化。核酸实验研究技术进展－146生物系统中mRNA或DNA等目标核酸分子的分析鉴定核酸实验研证明目标核酸分子是否存在于实验标本中的基本实验方法：1）杂交法，2）PCR法，3）测序法。核酸实验研究技术进展－147证明目标核酸分子是否存在于实验标本中的基本实验方法：核酸实验杂交法：序列已知，同时还要合成一个标记了的特异性探针。Dotblotting：不经过电泳，直接把检测样本点在一个适宜载体上，针对目标DNA分子或RNA分子进行杂交检测。Southernblotting：在电泳后，针对目标DNA分子的杂交检测。Northernblotting：在电泳后，针对目标RNA分子的杂交检测。目标DNA分子原位杂交检测。目标RNA分子原位杂交检测。核酸实验研究技术进展－148杂交法：序列已知，同时还要合成一个标记了的特异性探针。核酸实杂交法的优点与缺点：优点：Dotblotting：简单实用，适于进行大样本数同时检测。Northernblotting：如果检测结果阳性，其可信度要远远高于RT-PCR，因此被誉为评价基因转录的GoldenMarker。Southernblotting：对DNA病毒类病原体等的检测实用性很强。缺点：Dotblotting：由于在同一斑点位置，除了目标核酸分子外，同时还存在其它的成千上万种不同的核酸分子，而这些核酸分子有可能会与探针分子部分结合，这会促进探针分子与目标核酸分子的结合，因此将可能导致阳性结果放大，甚至是假阳性结果。Northernblotting：对低拷贝mRNA有时检测不出来，容易导致假阴性结果。核酸实验研究技术进展－149杂交法的优点与缺点：核酸实验研究技术进展－14例一：cDNAmicroarray检测SHEEC食管癌细胞NGAL基因mRNA转录实验结果反向Dotblotting核酸实验研究技术进展－150例一：反向Dotblotting核酸实验研究技术进展－1例二：Northernblotting检测SHEEC食管癌细胞NGAL基因转录mRNA实验结果NGAL化学发光法核酸实验研究技术进展－151例二：NGAL化学发光法核酸实验研究技术进展－16例三：Northernblotting检测缺氧复氧条件下心肌细胞EGR1基因转录mRNA实验结果EGR1同位素法核酸实验研究技术进展－152例三：EGR1同位素法核酸实验研究技术进展－17确保杂交法实验成功的八个关键点：关键点1：确保实验方案设计合理。关键点2：确保探针的特异性充分。关键点3：确保检测的灵敏度足够高。关键点4：确保样本质量合格。关键点5：确保实验试剂质量合格。关键点6：确保实验过程规范。关键点7：对于编码序列的cDNA，要确保没有RNA的干扰。关键点8：几种杂交法，或杂交法与其它方法联合使用，相互印证，确保实验结果可靠。核酸实验研究技术进展－153确保杂交法实验成功的八个关键点：核酸实验研究技术进展－18PCR法：序列已知，同时还要合成一对特异性引物。核酸实验研究技术进展－1优点：实验的灵敏度很高，理论上可检测实验生物系统中所存在的1个拷贝目标核酸分子。阴性结果的可信度很高。缺点：由于容易存在样本污染情况，与此同时，毕竟在实验过程中存在着目标核酸分子拷贝数人为放大这样一个事实，因此，其阳性结果的可信度不如Northernboltting或Southernboltting。54PCR法：序列已知，同时还要合成一对特异性引物。核酸实验研究例子：RT-PCR检测SHEEC食管癌细胞NGAL基因转录mRNA实验结果NGAL600bpSMS:食管癌细胞SHEECM:DNAmarker核酸实验研究技术进展－155例子：NGALSMS:食管癌细核酸实验研究技术进展－1确保PCR法实验成功的八个关键点：关键点1：确保实验方案设计合理。关键点2：确保引物的特异性充分。关键点3：确保样本质量合格。关键点4：确保实验试剂质量。关键点5：确保实验过程规范。关键点6：确保PCR变性、退火和延伸温度适度。关键点7：对于编码序列cDNA，要确保没有RNA的干扰。关键点8：几种PCR法，或PCR法与其它方法联合使用，相互印证，确保实验结果可靠。56核酸实验研究技术进展－1确保PCR法实验成功的八个关键点：1核酸实验研究技术进展－1测序法：通过电泳等手段已知实验生物系统中目标核酸的大致大小，而且是对照生物系统中不存在，或者两者相比在含量上可能有显著差别，然而序列未知。优点：可信度最高。对于解析鉴定未知核酸分子序列片段是必需的手段。缺点：目标片段边缘序列的测定结果有时不准确，在读原初测序图时要格外小心。57核酸实验研究技术进展－1测序法：通过电泳等手段已知实验生物系核酸实验研究技术进展－1目标片段边缘序列的测定结果有时不准确例子58核酸实验研究技术进展－1目标片段边缘序列的测定结果有时不准确PolyAtail核酸实验研究技术进展－159PolyAtail核酸实验研究技术进展－114核酸实验研究技术进展－160核酸实验研究技术进展－115核酸实验研究技术进展－1测定实验标本中目标核酸分子的含量61核酸实验研究技术进展－1测定实验标本中目标核酸分子的含量16核酸实验研究技术进展－1通过Dotblotting，结合斑点光密度扫描分析，测定实验标本中目标mRNA分子、目标cDNA分子或目标DNA分子的含量62核酸实验研究技术进展－1通过Dotblotting，结合A永生化食管上皮细胞SHEEB食管癌细胞SHEEC例子：cDNAmicroarray（反向Dotblotting）检测SHEEC食管癌细胞与永生化食管上皮细胞SHEE中NGAL基因转录mRNA相对含量实验结果判断标准：B/A2或0.5为显著性差异表达实际情况：B/A＝3.53核酸实验研究技术进展－163AB例子：cDNAmicroarray（反向Dotb核酸实验研究技术进展－1通过RT-PCR，结合条带光密度扫描分析，测定实验标本中目标mRNA分子或目标cDNA分子的含量64核酸实验研究技术进展－1通过RT-PCR，结合条带光密度扫例子：RT-PCR检测SHEEC食管癌细胞与永生化食管上皮细胞SHEE中NGAL基因转录mRNA相对含量实验结果NGAL600bpABMA:永生化食管上皮细胞SHEEB:食管癌细胞SHEECM:DNAmarkerABMGAPDH226bp核酸实验研究技术进展－165例子：RT-PCR检测SHEEC食管癌细胞与永生化食管上皮两个问题：

反转录PCR实验是否需要探针？

反转录PCR的特异性如何保证？

核酸实验研究技术进展－166两个问题：

反转录PCR实验是否需要探针？

反转录PCR核酸实验研究技术进展－1通过Northernblotting，结合条带光密度扫描分析，测定实验标本中目标mRNA分子的含量67核酸实验研究技术进展－1通过Northernblotti例一：Northernblotting检测SHEEC食管癌细胞与永生化食管上皮细胞SHEE中NGAL基因转录mRNA相对含量实验结果（化学发光）NGALABA:食管癌细胞SHEECB:永生化食管上皮细胞SHEEABGAPDHABAB500-400-300-200-100-100-80-60-40-20-核酸实验研究技术进展－168例一：Northernblotting检测SHEEC食管核酸实验研究技术进展－1例二：Northernblotting检测缺氧复氧条件下心肌细胞EGR1基因转录mRNA相对含量实验结果(同位素标记法)1正常2缺氧复氧3缺氧复氧＋溶剂对照4缺氧复氧＋F25缺氧复氧＋钙离子拮抗剂1234512345EGR1-Actin69核酸实验研究技术进展－1例二：Northernblotti核酸实验研究技术进展－1通过Southernblotting，结合条带光密度扫描分析，测定实验标本中目标DNA分子的含量70核酸实验研究技术进展－1通过Southernblotti核酸实验研究技术进展－1通过Southernblotting，结合条带光密度扫描分析，测定实验标本中目标DNA分子的含量71核酸实验研究技术进展－1通过Southernblotti核糖核酸酶保护分析（RibonucleaseProtectionAssay，RPA）是一种较好的mRNA定量检测技术。RPA的各项实验指标均优于NorthernBlotting。运用RPA可实现对目标RNA分子的高通量定量检测。核糖核酸酶保护分析RibonucleaseProtectionAssay(RPA)核酸实验研究技术进展－172核糖核酸酶保护分析核酸实验研究技术进展－127原理：以目标基因DNA为模板，利用32P-（放射法）或生物素（非放射法）作为标记信号，体外转录合成反义RNA探针。将过量的反义RNA探针与样品总RNA杂交，然后进行核糖核酸酶处理。未与探针杂交的单链RNA和过量的游离探针被降解，而目标RNA则因与探针结合形成双链而被‘保护’。杂交双链进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，用放射自显影或化学发光等方法确定目标RNA的量。核酸实验研究技术进展－173原理：核酸实验研究技术进展－128核酸实验研究技术进展－174核酸实验研究技术进展－129核酸实验研究技术进展－1适时荧光定量PCRRealtimefluorescentquantitationPCR75核酸实验研究技术进展－1适时荧光定量PCR30适时荧光定量PCR与常规PCR的本质区别常规PCR技术：对PCR扩增反应的终产物进行定性定量或半定量分析适时荧光定量PCR技术：通过一个特殊的荧光探针，对PCR扩增反应中每一次循环的产物进行适时跟踪定量分析

核酸实验研究技术进展－176适时荧光定量PCR与常规PCR的本质区别核酸实验研究技术进展realtimePCR的扩增曲线核酸实验研究技术进展－177realtimePCR的扩增曲线核酸实验研究技术进展－PE公司在同一台PCR仪上对相同模板进行96次扩增的扩增曲线图Ct值极具重现性核酸实验研究技术进展－178PE公司在同一台PCR仪上对相同模板进行96次扩增的扩增曲线Ct与初始模板的关系固定循环数后，荧光信号值与模板数成正比固定荧光信号值后，循环数与初始模板数成反比。初始模板数越多,荧光信号达到阈值时所需要的循环数(Ct值)越少起始模板浓度的对数与Ct呈线性关系，根据样品的Ct值就可计算出样品中所含的初始模板数。Threshold104103102核酸实验研究技术进展－179Ct与初始模板的关系固定循环数后，荧光信号值与模板数成正比T常用的定量PCR荧光探针SYBRGreenITaqman水解探针分子信标核酸实验研究技术进展－180常用的定量PCR荧光探针核酸实验研究技术进展－135SYBRGreenI结合到双链DNA