没食子酸抑制人神经母细胞瘤增殖的动物实验

没食子酸抑制人神经母细胞瘤增殖的动物实验何文飞何大维基金项目：国家自然科学基金资助（30772274）；基金项目：国家自然科学基金资助（30772274）；重庆市卫生局医学科研基金资助（2008-1-35）；作者单位：400014，重庆，重庆医科大学附属儿童医院泌尿外科通讯作者：何大维，TelE-mail:dw.he@163.com重庆医科大学附属儿童医院泌尿外科400014目的研究没食子酸抑制人神经母细胞瘤增殖作用，以及对化疗药物的协同作用。方法建立人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞株免疫活性C57BL/6j小鼠移植瘤模型，随机区组设计分配成4组：①PBS荷瘤对照组，0.5ml每鼠，腹腔注射，作为阴性对照；②GA组，按250mg•kg-1，两天一次给药，连续二周；③CP组GA、CP各代表什么？，按75mg•kg-1给药，每周两次，连续二周，作为阳性对照；④CP+GA组，GA在CP给药前24h给药，GA与CP独立给药，剂量和时间同前，每组6只C57BL/6j小鼠，所有药物均早晨九点腹腔注射给药，每周监测相对肿瘤体积（RTV），治疗时间共二周，次日处死小鼠，称体质量、称瘤重（Wt）、计算抑瘤率(IR)，BrdU标记检测移植瘤细胞增殖。结果GA组、CP组、GA+CP组在2w时的移植瘤平均Wt非通用缩写，还是用中文好，字数也不多分别为：4251±416.6mg、1374±335.4mg、230.2±83.65mg，平均IR同批注2分别为48.02%、83.20%、97.19%，与PBS组比较有显著性差异（p<0.0001），CP+GA组Wt值与CP组比较有显著性差异（p<0.01）。各给药组肿瘤增殖指数分别为：0.1238±0.02302、0.1082±0.01638、0.04111±0.01379。与PBS组肿瘤增殖指数0.2297±0.0803比较有显著性差异（p<0.0001），同时CP+GA组与GA组或CP组比较有统计学差异（p<0.01或p<0.05）。结论没食子酸具有抑制人神经母细胞移植瘤增殖、协同CP抗肿瘤生长的作用。GA、CP各代表什么？非通用缩写，还是用中文好，字数也不多同批注2关键词没食子酸；人神经母细胞瘤；肿瘤增殖指数；环磷酰胺；ExperimentalstudyofinhibitoryeffectsofgallicacidonhumanneuroblastomaxenograftmodelHEWen-Fei,HEDa-Wei,MA-Chao,ZHAODan,ZHANGYong-bo,BIANZe-dong.DepartmentofPediatricUrology,Children'sHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing,400014.Objective:TostudyinhibitoryeffectsofproliferativeeffectofGallicacidonhumanneuroblastoma,andthesynergisticeffectofchemotherapy.Methods:The3-week-oldimmunocompetentC57BL/6miceweretransplantedwithSK-N-SHcells,distributionofrandomizedblockdesigninto4groups,6ofeach:①PBStumor-bearingcontrolgroup,0.5mlpermouse,intraperitoneally(i.p),asanegativecontrol;②GAgroup,administeredgallicacid250mg/kgi.p.injection,everyotherday,continuoustwoweeks;③CPgroup,75mg•kg-1,i.p.injection,twiceaweek,totaltwoweeks,asapositivecontrol;④CPplusGAgroup,GAandCPindependentadministration,doseandtimewiththeabove,alldrugsareadministratedat9:00.Monitoringtherelativetumorvolumegrowthcurves(RTV),weekly.Theaverageweightofthetransplantedtumorsandthetumorinhibitationrateweretestedat21daysaftertransplantation.Tumorcellproliferationwasdetectedbybromouracildeoxyribosidelabeling(BrdU).Results:Theaverageweightofthetransplantedtumors,obtainedat21daysaftertransplantation,intheofmiceGA-treated,CP-treated,andCPplusGA-treatedgroupswere4251±416.6mg,1374±335.4mg,230.2±83.65mg,theaverageIRwere48.02%,83.20%,97.19%,respectively.ComparedwiththePBSgroupwassignificantdifference(p<0.0001),theaveragetumorweightofthemicetreatedwithCPcombinedwithGAwassignificantlysmallerthanthatoftheCPgroup(p<0.01).Thetumorproliferationindex(LI)inthetumortissuesofmicetreatedwithPBS-treated,GA-treated,CP-treated,andCPplusGA-treatedgroupswere0.2297±0.0803,0.1238±0.02302,0.1082±0.01638,0.04111±0.01379,respectively.ComparedwiththePBSgroupwassignificantdifference(p<0.0001).TheLIofthemicetreatedwithCPcombinedwithGAwassignificantlysmallerthanthattheCPorGAgroup(p<0.01orp<0.05).Conclusions:gallicacidcaninhibittumorproliferaKeywordgallicacid,humanneuroblastoma,tumorproliferationindex,Cyclophosphamide前言没食子酸（gallicacid，GA），化学名3，4，5-三羟基苯甲酸，是一种天然的多酚类化合物，广泛存在于中草药和水果类植物中，包括：叶下珠、五倍子、余甘子、葡萄、甜茶、报春黄甙叶等提取物。文献报告在体内外GA具有抑制部分肿瘤生长，如人前列腺癌ADDINKyMedRef2008REF:REF[1]、人结肠腺癌ADDINKyMedRef2008REF:REF[2]，但是，GA对儿童极度恶性的神经母细胞瘤是否有抑制作用，以及对化疗药物是否具有协同作用，尚无相关文献报道。为此，本实验应用人神经母细胞瘤C57BL/6j小鼠移植瘤模型，研究GA对人神经母细胞瘤移植瘤相对肿瘤体积、瘤重、抑瘤率和肿瘤细胞增殖水平的影响，探讨GA抑制人神经母细胞瘤作用，以及对化疗药物的协同作用。材料与方法动物及细胞株SPF级正常3w龄C57BL/6j系小鼠28只，雌雄性随机，重量（15±1.5g），动物及饲料购自重庆医科大学动物实验中心。人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞株哪来的？前期实验准备。哪来的？试剂 DMEM培养基为Hyclone公司产品，优级胎牛血清够于天津灏洋生物制品科技有限公司优级胎牛血清购于天津灏洋生物制品科技有限公司，胰酶购于invitrogen公司，GA和BrdU试剂购自美国Sigma公司，小鼠抗大鼠BrdU单克隆抗体（MS-1058）购自美国Thermo公司，SP-9002山羊抗小鼠免疫组化试剂盒购自北京中杉金桥生物工程有限公司，注射用环磷酰胺（CP）试剂购自山西普德药业公司，自己配制0.01M无菌磷酸盐缓冲液（PBS）。动物模型取含对数生长期人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞，0.25%胰酶消化形成细胞悬液，计数调整细胞浓度1×107/ml。用1ml注射针抽取单细胞悬液0.2ml接种于C57BL/6j小鼠右前肢腋下。接种后7天潜伏期肉眼可见瘤块，定人每周游标卡尺测量肿瘤的长（L）、宽（W）及高（H），按公式V=L×W×H×π/6计算肿瘤生长体积。肿瘤体积达到或超过100mm3，默认建模成功即为建模成功，选择瘤体积在100至200mm3进行后续实验研究。实验分组及给药 根据成瘤情况，将荷瘤鼠随机区组设计分配成4组：①PBS荷瘤对照组，0.5ml每鼠，腹腔注射，作为阴性对照；②GA组，按250mg•kg-1，两天一次给药，连续二周，；③CP组，按75mg•kg-1给药，每周两次，连续二周，作为阳性对照；④CP+GA组，GA在CP给药前24h给药，GA与CP独立给药，剂量和时间同前，每组6只C57BL/6j小鼠，所有药物均早晨九点腹腔注射给药。计算相对肿瘤体积、抑瘤率 根据测量的结果计算出相对肿瘤体积（RTV），计算公式为：RTV=Vt/V0。其中V0为分笼给药时测量所得肿瘤体积，Vt为每一次测量时的肿瘤体积。停药后次日量瘤体积、颈椎脱臼处死小鼠，剥瘤块称瘤重（Wt）、称体质量，在15分钟内收集标本，取肿瘤未坏死区域，部分液氮保存，部分4%中性甲醛固定，供后续实验用，按肿瘤抑瘤率计算公式：抑瘤率（IR）=（1-实验组平均瘤重/对照组平均瘤重）×100%。肿瘤组织增殖指数检测 处死C57BL/6j小鼠前2小时腹腔注射BrdU100mg•kg-1，组织经脱水及石蜡包埋后切片，经HCL处理后，胰蛋白酶修复抗原，山羊血清封闭，加抗BrdU一抗（1：200，MS-1058），4℃过夜；滴加生物素化山羊抗小鼠IgG工作液，辣根酶标记链霉卵白素工作液（S-A/HRP），DAB显色。苏木素轻度复染。脱水，透明，封片。Brdu标记移植瘤增殖指数结果判定：BrdU主要表达位于细胞核，故以细胞核出现棕黄色染色为阳性表达，每个标本随机计数1000个细胞，以BrdU标记细胞所占比例计为肿瘤增殖指数（LI）。统计学分析 应用SPSS16.0软件做统计分析，计量资料值采用One-wayANOVA统计分析及重复测量的方差分析统计分析，以P<0.05为有差异，P<0.01为有显著性差异，P<0.001为有极显著性差异。结果GA对神经母细胞移植瘤RTV、Wt、IR的影响在GA治疗2周，GA组RTV值较PBS组小，而大于CP组，GA组、PBS组、CP组RTV值均呈上升趋势，但是，联合GA+CP组RTV值最低，呈下降趋势（图1）。GA组、CP组、GA+CP组治疗2周，人神经母细胞瘤移植瘤的平均Wt分别为：4251±416.6mg、1374±335.4mg、230.2±83.65mg，平均IR分别为48.02%、83.20%、97.19%（表1），各给药组Wt值与PBS组比较有显著性差异（p<0.0001），GA组Wt值与CP组和CP+GA组比较有显著性差异（p<0.0001），CP+GA组Wt值与CP组比较有差异（p<0.01）（表1）。结果可见：GA单独治疗以及联合环磷酰胺化疗治疗神经母细胞瘤移植瘤均有不同程度的抑制作用，GA与CP具有协同抑制肿瘤作用。表1：治疗2周时神经母细胞瘤移植瘤Wt、IR的变化组别Wt（mg，±s）IR（%）PBS组8178±724.6●--GA组4251±416.6◆48.02CP组1374±335.4■83.20CP+GA组230.2±83.65▲97.19●分别与◆、■、▲比较，◆与■，◆与▲，p<0.0001；■与▲，P<0.01GA抑制神经母细胞瘤细胞增殖BrdU检测结果可见：具有增殖能力的肿瘤细胞核呈棕黄色颗粒样，GA组阳性细胞数明显少于PBS组，与CP组比较无明显差异，GA+CP组仅有少许阳性细胞处于增殖状态，阳性细胞数明显少于GA组、CP组（图2）。GA组、CP组、CP+GA组肿瘤增殖指数分别为：0.1238±0.02302、0.1082±0.01638、0.04111±0.01379（图3）。与PBS组肿瘤增殖指数0.2297±0.0803比较有显著性差异（p<0.0001，图3），同时CP+GA组与单独用GA组或CP组比较有差异（p<0.01或p<0.05，图3）。结果可见：GA以及CP单独治疗均能抑制移植瘤细胞增殖，且GA与CP具有协同抑制肿瘤细胞增殖效应。AABCD图2：各组肿瘤细胞增殖情况。A：PBS组，B：GA组，C：CP组，D：CP+GA组。GA治疗对荷瘤C57BL/6j小鼠体重影响经过7天潜伏期，根据默认荷瘤成功，有4只小鼠接种失败，成瘤率85.71%（24/28）。PBS组荷瘤C57BL/6j小鼠出现活动减少、呆滞。CP组小鼠也活动减少，精神萎靡，在治疗2周，小鼠体重明显低于PBS组和GA组，统计学有差异（p<0.05），与CP+GA组比较无差异（p>0.05）(图4)。GA对荷瘤C57BL/6j小鼠未见不良反应，各组均未见宿主死亡各组均未见动物死亡。讨论由于化学合成的抗肿瘤药物的毒副作用大，患者常因化疗的毒副作用而不能完成治疗，或者大剂量化疗药物治疗，虽然患者生存，但是，导致一些器官远期功能障碍，如心肌功能损害、性腺生殖功能损害而不育或子代畸形。因此，选择毒副作用低或无毒副作用的肿瘤药物治疗策略，是临床不断探索而未解决的难题。近年，中药治疗肿瘤已经成为肿瘤治疗领域的重要措施，GA是中药中较为常见的多酚类化合物，而GA抗肿瘤作用以其天然、高效、低毒而备受关注。在体外GA抑制人肝癌细胞株Bele74044、人胃癌细胞株SGC7901、小鼠肝癌细胞株H22和小鼠肉瘤细胞株S180ADDINKyMedRef2008REF:REF[3]、人前髓细胞性白血病HL-60细胞株ADDINKyMedRef2008REF:REF[4]、人肥大细胞瘤P-815细胞株、人黑色素瘤细胞等ADDINKyMedRef2008REF:REF[5]，也有文献报道在体外GA具有抑制人胶质细胞瘤细胞活性、增殖、浸润、血管生成ADDINKyMedRef2008REF:REF[6,7]、抗氧化作用ADDINKyMedRef2008REF:REF[8,9]。但是，不同文献对GA抗肿瘤效果仍有争议ADDINKyMedRef2008REF:REF[10,11]，且是否GA具有抑制人神经母细胞瘤作用，及其疗效如何，未见报道。我们前期已成功建立人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞株C57BL/6j免疫活性小鼠移植瘤模型，其生物学行为更近似人神经母细胞ADDINKyMedRef2008REF:REF[12,13]。本研究选用儿童最常见恶性的神经母细胞瘤SK-N-SH细胞株建立移植瘤模型为研究对象，以临床常用化疗药物CP作为阳性对照，PBS作为阴性对照，动态监测GA、CP及GA+CP治疗后的移植瘤RTV、Wt和IR的变化，结果发现GA能够抑制肿瘤RTV生长，单用GA抑瘤率达48.02%，而联合CP其高达97.19%，GA具有减少Wt，提高IR，与阳性对照组化疗效果比较，GA疗效不如CP明显，但是，具有协同提高CP治疗效果。同时我们利用BrdU标记检测了GA治疗2周的移植瘤细胞的增殖指数，结果表明GA能有效抑制其增殖，联合CP较单用CP具有极显著抑制细胞增殖作用，充分支持GA具有抑制肿瘤生长，并具有协同CP抗肿瘤作用。此外，监测GA对宿主一般情况和体重的影响，结果未发现GA毒副作用，与CP联合化疗减缓宿主体重下降联合化疗减缓动物体重下降，GA可能具有减轻CP毒副作用。故我们可以在治疗肿瘤过程中，利用GA协同CP治疗作用而降低CP剂量，从而降低CP化疗毒副作用。本研究结果表明GA可能有效抑制人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞株移植瘤增殖，协同CP疗效，减轻CP毒副作用。GA抑制肿瘤细胞增殖其机制涉及到多方面，可能包括抑制肿瘤生长相关的鸟氨酸脱羧酶、DNA聚合酶、核苷酸还原酶和环氧合酶等ADDINKyMedRef2008REF:REF[4,5]。抗氧化过氧化氢酶和N-乙酰半胱氨酸清除肿瘤细胞产生的活性氧族以及调控线粒体凋亡，激活Chk1andChk2和抑制Cdc25CandCdc2活性，抑制肿瘤细胞停留在G2/M期ADDINKyMedRef2008REF:REF[14]，增加瘤组织氧化活性族物质过氧化氢、超氧负离子等ADDINKyMedRef2008REF:REF[15-18]，以及可能与细胞信号转到途径相关。但其抑制人神经母细胞瘤增殖、以及对CP协同机制有待更进一步研究。本实验所采用的3w龄人神经母细胞瘤模型C57BL/6j移植瘤模型，其宿主具有正常的免疫原性动物具有正常的免疫原性，更类似人类神经母细胞瘤的生物学行为，以此模型为基础的研究结果更接近临床ADDINKyMedRef2008REF:REF[19-21]。本实验证实，GA具有抑制人神经母细胞瘤增殖作用，与低剂量CP联合化疗疗效显著，具有协同CP抗肿瘤作用，减轻CP毒副作用。GA可以作为一种天然的抗肿瘤的中草药。ADDINKyMedRef2008REF:DOC参考文献[1] 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