HBx蛋白对NLRP3炎性小体的激活及机制研究

HBx蛋白对NLRP3炎性小体的激活及机制研究汪玉兰，陈伟庆*作者单位：400010重庆，重庆医科大学附属第二医院，消化内科*通讯作者：陈伟庆，400010重庆，重庆医科大学附属第二医院，消化内科Tel:+8613983695334Email：chenwq20140809@163.com[摘要]目的了解HBV编码的x蛋白（HBx）及其截短体对NLRP3炎性小体活性的影响并初步探讨其作用机制。方法利用HBx及其羧基端截短体表达质粒pEGFP-N1-X、pEGFP-N1-X1-127、pEGFP-N1-X1-101，瞬时转染肝癌细胞株HepG2，Westernblot检测各HBx蛋白表达水平。以LPS与内源性危险信号ATP刺激转染后肝癌细胞为阳性对照，Westernblot检测各组NLRP3蛋白的表达；ELISA法检测各组上清中IL-1β和IL-18的分泌；流式细胞仪法检测各组HepG2细胞内ROS的表达水平。结果在转染后肝癌细胞中，Westernblot法能检测到全长HBx蛋白及其截短体HBx1-127、HBx1-101的表达，与全长HBx蛋白组相比，截短体组的表达水平明显降低。全长HBx蛋白能促进NLRP3蛋白的表达，进而促进IL-1β和IL-18的分泌，截短体HBx1-127、HBx1-101则不能。NLRP3抑制剂格列本脲能明显抑制IL-1β和IL-18的分泌。全长HBx蛋白组肝癌细胞内ROS水平明显高于截短体组，ROS特异性抑制剂APDC能明显抑制L-1β和IL-18的分泌。结论在肝癌细胞中HBx蛋白通过诱导细胞内ROS的产生激活NLRP3炎性小体，在原发性肝癌的发生发展过程中可能具有重要的作用。[关键词]乙型肝炎病毒X蛋白；HBx截短体；NLRP3炎性小体；IL-1β；IL-18；ROSTheeffectsofHBxonNLRP3inflammasomeactivationandrelatedmechanismWangYulan,ChenWeiqing*1DepartmentofGastroenterology,SecondAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400010,China*CorrespondingAuthor:WeiqingChen,M.D.DepartmentofGastroenterology,SecondAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400010,ChinaTel:+8613983695334chenwq20140809@163.com[Abstract]ObjectiveToinvestigatetheeffectsofhepatitisBvirusXprotein（HBx）encodedbyHBVanditstruncationsonNLRP3inflammasomeactivityandexploretherelatedmechanisms.MethodsHepatocytesHepG2weretransientlytransfectedwithpEGFP-N1-X，pEGFP-N1-X1-127andpEGFP-N1-X1-101whichrespectivelyexpressesHBxproteinanditstruncations.TheexpressionofHBxproteinandNLRP3proteinwasassayedbyWesternblotanalysis.ThelevelofIL-1βandIL-18secretedwasassayedbyELISA.ThelevelofROSinHepG2wasassayedbyflowcytometry.ResultsFull-lengthHBxprotein,COOH-terminallytruncatedmutationsHBx1-127andHBx1-101wereabletobeassayedbyWesternblotanalysisintransfectedhepatocytesHepG2.thelevelofHBx1-127andHBx1-101weresignificantlylowerthanthatofthefull-lengthHBx.Full-lengthHBxproteincouldup-regulatetheexpressionofNLRP3proteinandthelevelofIL-1βandIL-18secreted,butHBx1-127andHBx1-101couldn’t.NLRP3inhibitor,glyburide,couldinhibitthelevelofIL-1βandIL-18secretedsignificantly.ThelevelofROSinHepG2wassignificantlyincreasedinfull-lengthHBxgroupthanthatofitstruncationsgroups.ROSspecificinhibitorammoniumpyrrolidinedithiocarbamate(APDC)couldinhibitthelevelofIL-1βandIL-18secretedsignificantly.ConclusionsHBxactivetheNLRP3inflammasomethroughincreasingthelevelofROSinHepG2,whichmayplayanimportantroleintheoccurrenceanddevelopmentofHCC.[Keywords]hepatitisBvirusX;HBxtruncations;NLRP3inflammasome;IL-1β;IL-18;ROS原发性肝癌（hepatocellularcarcinoma，HCC）严重威胁着人类健康，是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一[1,2]。目前国内外研究表明HCC的发生与年龄、性别、饮酒、乙肝病毒（hepatitisBvirus，HBV）感染和黄曲霉素等病因及危险因素有关，其中HBV感染是HCC发生的首要危险因素，但发病机制目前仍不完全明确[3]。越来越多的研究认为HBV基因组X区编码的HBx蛋白与HBV相关性HCC的发生发展密切相关[4,5]。HBx基因于整合后的病毒DNA中最常见，且大多数存在X基因羧基端的缺失突变，可编码出多种HBx蛋白截短体，如：HBx1-122、HBx1-127、HBx1-128、HBx1-139等[6]。而HBx蛋白的羧基端是发挥反式激活功能的重要部位，在调节HBVDNA的转录活性，病毒复制以及控制细胞增殖和分化方面起着重要的作用[4]。因此，HBx的羧基端缺失将引起HBx蛋白反式作用的改变，这可能是HBx蛋白导致HBV相关性HCC的发生发展的重要机制[7]。近年来，炎性小体作为一种新近发现的由多种分子共同构成的高分子量、多蛋白复合体，在固有免疫系统中起着至关重要的作用，已经成为人们关注的热点。其中，NLRP3炎性小体是研究最多的也是迄今为止结构和功能最为明确的炎性小体。NLRP3炎性小体经过装配激活后，刺激半胱天冬氨酸酶-1（Caspase-1）前体剪切活化为具有酶活性的Caspase-1，Caspase-1对具有其依赖性的白介素-1β（IL-1β）和白介素-18（IL-18）等相关炎性因子的前体形式进行切割，促其成熟并释放至胞外，发挥广泛地生物学效应[8]。然而，炎性小体在肿瘤中的研究十分有限。对不同肿瘤而言，炎性小体可能会引起截然不同的效应[9]。炎性因子IL-1β可作为一个肿瘤生长因子在肿瘤的发生发展过程中起重要的作用。研究表明，HBV的感染和肝细胞的损伤可促进IL-1β水平的升高，最终导致HCC的发生[10]。肝癌患者的血清IL-18水平显著升高，高水平的IL-18可用于判断肿瘤的侵袭与分期，可作为诊断肝癌患者独立的预测因子。同时，HBx蛋白可上调IL-18启动子的转录活性，促进IL-18基因表达[11,12]。而IL-1β和1L-18等相关炎性因子的产生主要依赖于炎性小体的激活，特别是NLRP3炎性小体。最新研究认为，HBV能激活NLRP3炎性小体，参与各种慢性肝病过程中肝损伤的发生发展[13]。那么，HBx蛋白能否调节IL-1β和IL-18的产生？HBx蛋白能否激活NLRP3炎性小体及其机制如何？本文将首次探讨HBx蛋白对NLRP3炎性小体的调节作用。活性氧（reactiveoxygenspecies，ROS）的产生在HBV相关性HCC的发生发展中具有重要作用。Yin[14]等研究表明HBx蛋白可与线粒体外孔蛋白结合而降低线粒体电位差，增加线粒体ROS水平。Jung[15]等研究表明HBx可通过诱导线粒体ROS的产生参与HCC的发生发展，且HBx蛋白的羧基端是线粒体ROS的产生必不可少的。而R0S的产生是调控NLRP3活化的关键信号，可作为激活NLRP3炎性小体的共同信号分子。Zhou[16]等研究表明，在细胞接受刺激时，线粒体来源的ROS，可引起线粒体损伤和线粒体功能失调，进而促进NLRP3炎性小体的激活。那么，HBx蛋白是否可以通过调节细胞内ROS的表达影响NLRP3炎性小体的活性呢?本文基于相关问题进行了初步探讨。1材料与方法1.1实验试剂1.1.1质粒全长HBx表达质粒pEGFP-N1-X，羧基端缺失27个氨基酸的HBx截短体表达质粒pEGFP-N1-X1-127，羧基端缺失43个氨基酸的HBx截短体表达质粒pEGFP-N1-X1-101以及pEGFP-N1空载质粒均由上海生工生物工程技术服务有限公司提供。1.1.2细胞株人肝细胞癌细胞株HepG2细胞为重庆医科大学附属第二医院消化内科实验室提供。1.1.3主要试剂DMEM高糖培养基购自Hyclone公司；胎牛血清购自杭州四季青公司；LipofectamineTM2000、opti-MEM购自Invitrogen公司；蛋白酶抑制剂PMSF、RIPA细胞裂解液（中性）、SDS-PAG凝胶配制试剂盒、活性氧试剂盒均购自碧云天科技生物公司；抗绿色荧光蛋白（greenfluorescentprotein，GFP）抗体、抗NLRP3抗体购自Santa公司；兔抗GAPDH、羊抗兔IgG购自北京中杉金桥公司；LPS、ATP、APDC、格列本脲购自Sigma公司；人IL-1β和IL-18试剂盒购自上海沪尚生物公司。1.2方法1.2.1细胞培养与转染HepG2细胞置于37℃、5%CO2培养孵箱中，用含10%的胎牛血清的DMEM高糖培养基常规培养传代。实验分为5组：空白对照组；空载体组（转染pEGFP-N1空载质粒）；全长HBx蛋白组（转染pEGFP-N1-X质粒）；HBx1-127组（转染pEGFP-N1-X1-127质粒）；HBx1-101组（转染pEGFP-N1-X1-101质粒）。取对数生长期的HepG2细胞，按每孔1.0x106细胞铺于6孔板中培养16-24小时，待细胞融合率达70%-80%时进行转染。将2.5ug质粒和10ulLipofectamineTM2000稀释到300ul无血清培养基opti-MEM中制备转染复合物，轻轻混匀后室温孵育20min。用无血清培养基opti-MEM清洗细胞三次后，加入无血清培养基opti-MEM200ul至每孔。将转染复合物分别加入每孔，轻轻摇匀后置于CO2恒温培养箱。4-6h后用500ul含10%的胎牛血清的DMEM培养基替换转染混合液。48h后根据GFP表达情况评估细胞转染效率。1.2.2Westernblot检测HBx蛋白的表达水平用RIPA裂解液裂解细胞,提取转染48h后细胞总蛋白，用BCA法测定蛋白浓度。取40ug细胞总蛋白进行12%SDS-PADE凝胶电泳，湿转印于PVDF膜上，用含5%脱脂奶粉室温封闭1h，分别加入兔抗GFP抗体、兔抗GAPDH抗体4℃孵育过夜。MPBST洗膜40min后，将HRP酶标记的羊抗兔IgG室温孵育1h，洗涤后ECL显影，GAPDH作为内参对照。用Image-ProPlus对图像进行分析，每个样本中HBx蛋白的光密度值与GAPDH的光密度值的比值代表HBx蛋白相对表达量。NLRP3蛋白的表达水平提取转染48h后全长HBx（X）组、HBx1-127（X1-127）组、HBx1-101（X1-101）组、炎性刺激（LPS+ATP）组（LPS100ng/ml预激18h+ATP5mmol/L4h）、HepG2空白对照（HepG2）组细胞总蛋白，用BCA法测定蛋白浓度。取40ug细胞总蛋白进行12%SDS-PADE凝胶电泳，湿转印于PVDF膜上，用含5%脱脂奶粉室温封闭1h，分别加入兔抗NLRP3抗体、兔抗GAPDH抗体4℃孵育过夜。MPBST洗膜，然后将HRP酶标记的羊抗兔IgG室温孵育1h，洗涤后ECL显影，GAPDH作为内参对照。用Image-ProPlus对图像进行分析，每个样本中NLRP3蛋白的光密度值与GAPDH的光密度值的比值代表NLRP3蛋白相对表达量。1.2.3ELISA检测IL-1β和IL-18的表达收集全长X组、X1-127组、X1-101组、LPS+ATP组、HepG2组、格列本脲（50mg/ml18h）+X组、格列本脲（50mg/ml18h）+LPS+ATP组、APDC（50umol/L1h）+X组和APDC（50umol/L1h）+LPS+ATP组上清，ELISA检测IL-1β和IL-18的表达。按照试剂盒说明书进行操作，置于酶标仪450nm波长处进行读数，测定OD值。根据标准品绘制标准曲线，按照标准曲线计算出相应样品的蛋白含量。1.2.4流式细胞仪检测细胞ROS的表达用无血清培养基opti-MEM1：1000液稀释DCFH-DA，终浓度为10umol/L。去除HepG2组、X组、X1-127组、X1-101组、LPS+ATP组细胞培养基，加入稀释好的DCFH-DA，37℃培养箱内孵育20min。无血清培养基opti-MEM洗涤三次。细胞消化后计数，将约1x104个细胞悬液置入1.5mlEP管中，2500rpm离心5min，弃上清然后加入200ulPBS重悬于流式管内。利用流式细胞仪（激发光波长525nm）对样本进行检测，直方图分析DCF的平均荧光强度。1.3统计学分析采用SPSS13.0软件进行分析，计量资料均数±标准差表示，组内比较采用t检验。P<0.01表示差异有统计学意义。2结果2.1全长HBx蛋白及其截短体的表达融合EGFP的全长HBx蛋白及其截短体瞬时转染HepG2细胞，48h后收集细胞总蛋白，Westernblot检测发现，X组及其截短体组均有HBx蛋白表达，羧基端截短体HBx1-127、HBx1-101均低于全长HBx的表达，HBx1-127、HBx1-101的表达相当（图1）。提示HBx羧基端的缺失将影响HBx蛋白在细胞内的稳定性，可能与HBx蛋白半衰期的改变有关。2.2肝癌细胞内NLRP3蛋白的表达各实验组均有NLRP3蛋白的表达。炎性刺激组强阳性表达，说明肝癌细胞能够感受内源性危险性信号，参与炎症反应。X组与LPS+ATP组表达相当，羧基端截短体X1-127、X1-101组均明显低于X组的表达，说明HBx蛋白能够上调NLRP3蛋白的表达，但HBx羧基端的缺失则不能，提示HBx羧基端对促进NLRP3蛋白的表达可能具有重要的作用（图2）。2.3HBx蛋白能够促进肝癌细胞内NLRP3炎性小体的活化虽然HBx蛋白能够促进NLRP3蛋白的表达，但HBx蛋白能否使肝癌细胞内的NLRP3炎性小体正常活化仍不明确。我们经ELISA检测了IL-1β和IL-18的表达，结果显示：全长HBx蛋白能够促进IL-1β和IL-18的分泌，羧基端截短体HBx1-127、HBx1-101则不能（图3）。提示HBx蛋白能够激活NLRP3炎性小体，分泌炎症启动的重要细胞因子IL-1β和IL-18，而羧基端对NLRP3炎性小体的活化可能具有重要的作用。2.4肝癌细胞内IL-1β和IL-18的分泌确实是依赖炎性小体活化而产生IL-1β和IL-18的合成和分泌还有非炎症体依赖的途径。为了进一步验证在肝癌细胞内IL-1β和IL-18的分泌确实是依赖炎性小体活化而产生，我们使用NLRP3蛋白的抑制剂格列本脲进行抑制实验，结果显示：格列本脲能明显抑制肝癌细胞内IL-1β和IL-18的表达（图4）。提示IL-1β和IL-18的分泌确实是依赖炎性小体活化而产生。2.5HBx蛋白激活NLRP3炎性小体的机制与细胞内ROS水平有关为了明确HBx蛋白激活NLRP3炎性小体的机制，我们通过流式细胞仪检测了肝癌细胞内ROS的水平。结果显示：全长HBx蛋白能够上调细胞内ROS水平，羧基端截短体X1-127、X1-101组均明显低于X组的表达（图5）。提示HBx蛋白激活NLRP3炎性小体的机制可能与细胞内ROS水平有关，而HBx羧基端是细胞内ROS产生的必要条件。为了进一步明确HBx蛋白激活NLRP3炎性小体的机制是否与细胞内ROS水平有关，我们使用了ROS特异性抑制剂APDC进行抑制实验，检测IL-1β和IL-18的分泌是否有改变。结果显示：APDC能明显抑制肝癌细胞内IL-1β和IL-18的表达（图4）。提示HBx蛋白激活NLRP3炎性小体的机制与细胞内ROS水平有关。3讨论固有免疫是机体抵御病原微生物入侵和感受危险信号的第一道防线。自2002年首次发现并报道炎性小体以来，有关炎性小体在病原微生物感染中的作用已成为相关学者关注的热点，炎性小体在固有免疫系统中起着至关重要的作用。目前已发现的炎性小体主要有4种，即NLRP1、NLRP3、IPAF和AIM2炎性小体。其中，NLRP3炎性小体能被各种细菌、病毒等病原微生物激活，是研究最多的也是迄今为止结构和功能最为深入、明确的炎性小体。NLRP3炎性小体经过装配激活后，能够刺激Caspase-1前体剪切活化为具有酶活性的Caspase-1,Caspase-1对具有Caspase-1依赖性的IL-1β和IL-18等炎性因子的前体形式进行切割，促其成熟并释放至胞外，引起炎症反应[10]。HCC在全球常见的癌症中居第五位，肿瘤致死率中居第三，严重威胁着人类健康。已有研究表明HBV相关慢性肝病患者发生HCC的风险将较普通人群增加100倍，但其发病机制尚未完全阐明[2]。HBV基因组为不完全双链环状结构，包含4个部分重叠的开放读码框架，分别为S、C、P、X区[17]。近年来，越来越多的研究认为HBV基因组X区编码的HBx蛋白作为一种多功能的调节蛋白，与HBV相关性HCC的发生发展及侵袭转移密切相关[5]。HBx蛋白的羧基端是发挥反式激活作用的部位，羧基端缺失可引起HBx蛋白反式作用的改变，可抑制细胞增殖与转化，促进myc和ras癌基因细胞转化的能力，这可能是HBx蛋白导致HBV相关性HCC的发生发展的重要机制[7]。HBV感染引发的免疫效应及分子机制对于HBV相关肝病的预后极为关键。近年来，越来越多的证据表明固有免疫在HBV感染及慢性肝病发展过程中发挥重要作用。Hosel等研究表明IL-1β、IL-18等炎症因子参与各种慢性肝损伤的发生与发展[18]。Park等研究认为乙肝患者体内IL-1β的水平与HBV病毒滴度呈正相关，HBx蛋白可诱导IL-18的产生[19]。而IL-1β、IL-18的表达、成熟和分泌主要依赖NLRP3炎性小体的激活。提示HBx蛋白可能通过激活NLRP3炎性小体，促进IL-1β、IL-18的合成和分泌，引起炎症反应，从而在HCC的生理病理过程中发挥一定的作用。为了阐明上述问题，本文以人肝癌细胞株HepG2作为细胞模型，检测了HBx蛋白对NLRP3炎性小体的激活情况，并初步探讨了HBx蛋白促进NLRP3炎性小体激活的分子机制，对于阐明慢性肝病的发病机制具有重要的意义。本研究结果显示，肝癌细胞虽非标准的炎症效应细胞，但仍然能表达有功能的NLRP3炎性小体。在危险信号HBx蛋白的刺激下，NLRP3蛋白表达上调，促进了炎性小体活化的重要的下游效应因子IL-1β和IL-18的合成和分泌。为了验证IL-1β和IL-18是否是依赖NLRP3炎性小体活化途径产生的，我们进一步使用NLRP3蛋白的抑制剂格列本脲进行了抑制试验，结果显示格列本脲能明显抑制IL-1β和IL-18的分泌。研究结果提示，HBx蛋白能够激活NLRP3炎性小体，但并不能排除HBx蛋白也可诱导其他类型的炎性小体的活化，今后需要进一步的研究来明确。文献报道，多种DNA病毒都可调节NLRP3炎性小体的活化。NLRP3炎性小体在一些炎症性疾病、感染性疾病和肿瘤中都具有重要的作用。但NLRP3炎性小体如何识别病毒并被激活的作用和机制仍不明确。迄今为止，NLRP3炎性小体的激活模型主要有K离子外流半通道模型、溶酶体损坏模型、活性氧（ROS）模型。其中ROS模型最为重要。ROS是生物体内产生的超氧阴离子（O2-）、过氧化氢（H2O2）、羟自由基（HO）、一氧化氮（NO）活性含氧化合物的总称。细胞接受刺激时，ROS将作为一个警报信号参与几乎所有的病理过程，特别是炎症过程。一旦刺激持续存在，ROS的浓度将会超过抗氧化系统的清除能力，导致细胞氧化损伤。特别是肿瘤细胞，因常常缺失抗氧化酶SOD、过氧化氢酶以及谷胱甘肽等抗氧化物质,最终导致肿瘤的发生[20]。目前发现的NLRP3炎性小体激活剂都能够诱导线粒体ROS的产生，且ROS的抑制剂乙酰半胱氨酸（NAC）以及线粒体通过自噬现象都能抑制细胞内NLRP3炎性小体的激活[16]。VDAC是线粒体膜上渗透转换孔复合体中的成分，能凋节线粒体膜电位和细胞色素C的释放。文献报道，HBx蛋白可与线粒体外孔蛋白结合而降低线粒体电位差，增加线粒体ROS水平，参与HCC的发生发展[14,15]。为了明确HBx蛋白是否通过影响细胞内ROS的水平诱导NLRP3炎性小体的活化,我们检测了HBx转染后肝癌细胞内ROS的水平，并使用ROS特异性抑制剂APDC检测了IL-1β和IL-18水平的变化。结果提示HBx蛋白可通过诱导细胞内ROS的产生激活NLRP3炎性小体，ROS的抑制剂可明显抑制NLRP3炎性小体的激活。研究还表明HBx羧基端是细胞内ROS产生的必要条件，这与Jung[15]等的研究结果一致。病原微生物可通过一种或多种机制参与NLRP3炎性小体的活化，文献报道，HBV可通过Racl通路影响NLRP3炎性小体的活化,而HBx蛋白也能激活Racl[16]。HBx蛋白可促进钙离子内流，Ca2+离子动员是NLRP3炎性小体激活的一个新型模型[21,22]。提示HBx蛋白激活NLRP3炎性小体的具体机制，还有待于进一步探讨。本研究首次证明了HBx蛋白通过诱导细胞内ROS产生并激活NLRP3炎性小体，进而促进IL-1β和IL-18的合成和分泌，可能在原发性肝癌的发生发展过程中发挥重要的作用。本研究表明通过抑制肝细胞内NLRP3炎性小体活化进而减少IL-1β、IL-18的合成和分泌，可能会阻断HBV相关HCC的进程，这为HBV相关HCC的发病机制研究提供了新的思路，并为其临床治疗提供了新的靶点。致谢衷心感谢导师陈伟庆教授多年来对我的悉心指导和关怀爱护。衷心感谢西南医院中心实验室所有老师对我实验工作的大力支持和认真指导。参考文献[1] 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