DB1698-2018实验用喜马拉雅旱獭++遗传质量控制

ICS65.020.30B41备案：60861-2018 DB63B41青 海 省 地 方 标 准DB63/T1698—2018实验用喜马拉雅旱獭遗传质量控制2018-09-25发布 2018-12-01实施青海省质量技术监督局 发布DB63/T1698DB63/T1698—2018II前 言本规程按照GB/T1.1-2009给出的规则编写。本规程由青海省科学技术厅提出并归口。本规程主要起草人：吴天一、范微、张评浒、徐楠、张玲、周国华、张毓。DB63/T1698DB63/T1698—2018PAGEPAGE7实验用喜马拉雅旱獭遗传质量控制范围本部分规定了实验用喜马拉雅旱獭的遗传分类、封闭群的繁殖方法、遗传质量监测。本部分适用于封闭群实验用喜马拉雅旱獭的遗传质量控制和管理。GB14923实验动物哺乳类实验动物的遗传质量控制下列术语和定义适用于本文件。3.1实验用喜马拉雅旱獭ExperimentalMarmotaHimalayana3.2封闭群或远交群Closedcolonyoroutbredstock按照GB14923附录A封闭群动物繁殖方法进行。。行，见附录A。（附录。A。。抽样按表1要求。表1抽样数量生产种群旱獭数量取样数量（只）100只以上≥30100只以下≥15选择实验用喜马拉雅旱獭13个具有高度多态的位点作为遗传检测的微卫星分子标记。当平均有效杂合度在0.5时～0.7时，群体为合格封闭群实验旱獭群体。或用群体是否达到平衡状态来判断定，如果没有达到平衡状态，说明群体的基因频率或基因型频率发生变化，该封闭群判为不合格。喜马拉雅旱獭Cytb封闭群实验喜马拉雅旱獭每年进行一次遗传质量检测。附录A（规范性附录）喜马拉雅旱獭遗传进化分析方法DNAMarker、RNase、高保真Taq酶、琼脂糖、琼脂粉、Tris碱、质粒抽提试剂盒、AMP、IPTG、β-gal、Goldview、异丙醇、CaCl2、甘油、QIAGEN动物组织与全血DNA提取试剂盒。——TE缓冲液（pH8.0）：10mMTris-HCl，1mMEDTA；——TAE（50×）：242gTris57.1ml100ml0.5mol/LEDTA(pH8.0)1升；——凝胶加样缓冲液母液（6×）：0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青FF，30%甘油水溶液4℃贮存；——Goldview染液：50mlTAE缓冲液中加入Goldview1µL。仪器PCRIQ5Cytb——参照GenBankcyt-b——WcytbF1:5´-GCTACAGCTTTCATAGGCTATG-3；´——WcytbR1:5´-CTATGACTAGAGCTGCGATG-3´。旱獭DNA200µlGARNase(100mg/mL155min。20µlK56200µl缓冲液10min200µl15CB312，000rpm30CB3向吸附柱CB3500µl30CB3700µlPW，12,000rpm30CB3500µlPW，12,000rpm30将吸附柱CB312,000rpm2min将吸附柱CB3CB3100µl2-5min，12,000rpm2min20260230nmnmA260=1DNA50µg/ml，单链RNA为40µg/mlA260——使用1cm光程石英比色杯，以超纯水调好仪器零点。——将20µl核酸样品稀释到1mL去离子水中。——测定并记录A260与A280PCRCyt-b组分体积H2O31.5µl10×buffer5µlMgCl22.5mM4µldNTP2.5mM4µlHcytbF12µlHcytbR12µlDNAtemplate1µlTaq-polimerase(5u/µl)0.5µl循环温度时间194℃5min3094℃30sec55℃30sec72℃30sec172℃10min4℃30minA.3序列比对与遗传进化分析利用DNAstar5.0和MEGA4.0软件对喜马拉雅旱獭Cytb序列进行同源比对与遗传进化分析。附录B（规范性附录）喜马拉雅旱獭微卫星遗传标记的检测方法0.001gpH计、酚:氯仿:异戊醇(25:24:1,V:V)、氯仿、异丙醇、70%乙醇、TE(pH8.0)、RNaseA、蛋白酶K、电泳试剂、PCR扩增试剂、SNET裂解缓冲液（配方见《分子克隆实验指南第三版》）。GenebankPCRB.1。表B.1微卫星各位点的名称、引物序列、Genbank登录号、最佳退火温度位点引物序列（5’-3‘）Genbank登录号退火温度（℃）SSR1GAAATAGGCTGGTCCGTGCATACTTGATAGATGGTGGTGEF67608560SSR2GTCTGTTCAGGAGCCATCCTCATCCAGCCTTAGTGTAGEF67608660SSR3GATGGGTCAAATAATGGTACATGTGAAGGGTTGGGGTTEF67608862SSR4GGGAAAACCAAAATCTGAACACAGCAAATCTCCCACCAEF67608756SSR5ACATTGCTACCACTGCTGCTCCGACCCAGACTGAATTACATCATEF67609052SSR6CTTCTTTCCTTCCCCATAAACTCAAGTGAGACCCTGTEF67608452SSR7GCCTGTTTGAAGACTGATTGACCTAAAGAAATGCTATEF55551950SSR8TCAGAAATGCAACCCAGACGCCCCAACAGAAGGAACTEF67608956SSR9AGGGGAACAGAACCAAAAGGGTTTCTTCCAGGGACAAAGCACCATCAY19778056SSR10ATCCGTCCAATAAAGAAATTCGTTTCTTGTGGCTCAGTGGTCAGATGAY19778156SSR11CATTTAGACGCACATTTTGGGGATGGAGAATGAGGAAGAY19778256SSR12AATATGTTAAGGCAGTTCTAGCGTTTCTTCCTGATATGGAAAGATGATGTAY19778352SSR13CCTGTGTGAGTCCAGCCATTTAGGTCTGCAY19778454DNAEPSNET30min。10000r/min10minEP继续10000r/min10minEP4℃10000r/minDNA。1ml再10000r/min离心107015min。加入50μLTE，4DNA。取2μLDNAPCRPCR反应体系总体积为25μL。其中，10×Buffer2.5μL、10mMdNTPs0.5μL、10mM上/0.550ng/