瓜类细菌性果斑病菌抗铜差异性检测课件

答辩人：单亚楠指导老师：高洁教授赵廷昌研究员

瓜类细菌性果斑病菌抗铜差异性检测答辩人：单亚楠瓜类细菌性果斑病菌抗铜差异性检1研究内容2.

材料与方法

1.

前言3.

5.致谢结果与分析4.结论与讨论研究内容2.材21前言

瓜类细菌性果斑病（BFB）是发生在葫芦科植物上的一种严重的世界性病害，该病害为种传病害。病原菌为西瓜嗜酸菌(Acidovoraxcitrulli，简称Ac)，是近年来传入国内的检疫性有害生物，1985年首次被鉴定为类产碱假单胞菌西瓜亚种，1992年被更名为西瓜细菌性果斑病菌(Acidovoraxavenae

subsp.citrulli)。菌株间存在比较丰富的遗传多样性，可以分为两个亚群，亚群Ⅰ主要分离自甜瓜、南瓜等，亚群Ⅱ主要分离自西瓜等。瓜类细菌性果斑病是国内外西瓜甜瓜上危害最为严重的病害之一。目前除了严格检疫尚无有效防治措施。1前言瓜类细菌性果斑病（BF31.1危害症状图1：瓜类细菌性果斑病发病症状：西瓜子叶(A),西瓜真叶(B),西瓜果实(C),甜瓜真叶(D),甜瓜果实(E),甜瓜果肉(F)1.1危害症状图1：瓜类细菌性果斑病发病症状：西瓜子叶(A41.2瓜类细菌性果斑病的发生情况

该病害自1998年在我国首次报道，15年的时间已经遍布了我国许多农业大省。该病最早于1969年由Crall和sehenckt在美国佛罗里达州发现，并对果斑病的症状进行了描述。1985年wall和santos在关岛报道了西瓜细菌性果斑病的发生，并首次将其病原菌鉴定为类产碱假单胞菌西瓜亚种。1992年Willems等人根据西瓜果斑病病原菌的rRNA-DNA和DNA-DNA分子杂交研究结果，将其更名为西瓜细菌性果斑病菌(Acidovoraxavenae

subsp.citrulli)。1.2瓜类细菌性果斑病的发生情况该病害自1998年在我国51.3瓜类细菌性果斑病的防治关于该病害的防治方法有加强检疫、药剂防治、种子处理、从无病区引种、生物防治、采用抗病品种等。目前应用最广泛的是药剂防治，有效的药剂是铜制剂和抗生素。5%百菌清1公斤/亩、14%络氨铜水剂300倍液或50%甲霜铜可湿性粉剂600倍液,77%氢氧化铜可湿性微粒粉剂400倍液,用量60～75升/亩,连续3～4次。硫酸链霉素或72%农用链霉素可溶性粉剂4000倍液;40万单位的青霉素甲盐5000倍液。药剂防治方面主要是铜制剂。1.3瓜类细菌性果斑病的防治关于该病害的防治方法有加强检疫61.4本论文研究目的及意义

我国的西瓜、甜瓜种植面积和产量都位居世界前列。瓜类细菌性果斑病给我国西甜瓜生产造成了严重危害。用于田间防治果斑病的主要是含铜杀菌剂。随着铜制剂的不断应用病原菌对铜制剂抗性不断增加，而目前国内对果斑病菌菌株之间抗铜性的差异还没有报道，因此本试验对113株菌株的抗铜性进行了研究，阐明菌株间的抗铜性差异，从而为田间合理使用含铜杀菌剂提供有力的证据。1.4本论文研究目的及意义我国的西瓜、甜瓜种植面积和产7菌株号采集地点寄主分离部位亚群分离时间No.ofstrainLocationHostOrganisolatedgroupTimeisolatedAacw1内蒙古临河市西瓜叶片Ⅰ2002-9-3Aacw2内蒙古临河市西瓜叶片Ⅰ2002-9-3Fc247Unitedstates西瓜叶片Ⅰ2002-9-3Fc520UnitedStates西瓜叶片Ⅰ2002-9-3pslb1内蒙古临河市甜瓜叶片Ⅰ2000-7-14pslb2内蒙古临河市甜瓜叶片Ⅰ2000-7-14pslb3内蒙古临河市甜瓜叶片Ⅰ2000-7-14pslb4内蒙古临河市甜瓜叶片Ⅰ2000-7-14pslb8内蒙古临河市甜瓜叶片Ⅰ2000-7-14pslb9内蒙古临河市甜瓜叶片Ⅰ2000-7-14pslb10内蒙古临河市甜瓜叶片Ⅰ2000-7-14pslb15内蒙古临河市甜瓜叶片Ⅰ2000-7-18pslb19内蒙古临河市八一乡甜瓜叶片Ⅰ2000-7-18pslb22内蒙古临河市八一乡甜瓜果实Ⅰ2000-7-18pslb23内蒙古临河市八一乡甜瓜果实Ⅰ2000-7-182材料与方法2.1供试菌株表1113株供试瓜类细菌性果斑病菌菌株菌株号采集地点寄主分离部位亚群分离时间No.ofstra8pslb24内蒙古临河市八一乡甜瓜果实Ⅰ2000-7-18pslb25内蒙古临河市八一乡甜瓜果实Ⅰ2000-7-18pslb28内蒙古临河市八一乡甜瓜果实Ⅰ2000-7-18pslb29内蒙古临河市八一乡甜瓜果实Ⅰ2000-7-18pslb30内蒙古临河市八一乡甜瓜果实Ⅰ2000-7-18pslb31内蒙古临河市八一乡甜瓜叶片Ⅰ2000-7-25pslb35内蒙古巴盟农业多种经营站甜瓜子叶Ⅰ2000-8-20pslb36内蒙古巴盟农业多种经营站甜瓜子叶Ⅰ2000-8-20pslb37新疆甜瓜果实Ⅰ2000-9-9pslb38新疆甜瓜果实Ⅰ2000-9-9pslb39新疆呼图壁甜瓜果实Ⅰ2000-9-14pslb40新疆呼图壁甜瓜果实Ⅰ2000-9-14pslb41新疆呼图壁甜瓜果实Ⅰ2000-9-14pslb42新疆呼图壁甜瓜果实Ⅰ2000-9-14pslb44新疆甜瓜果实Ⅰ2000-9-14pslb45新疆甜瓜果实Ⅰ2000-9-14pslb46新疆甜瓜果实Ⅰ2000-9-14pslb47新疆甜瓜果实Ⅰ2000-9-14pslb48新疆甜瓜子叶Ⅰ2000-9-14pslb49新疆甜瓜叶片Ⅰ2000-9-14pslb52新疆甜瓜叶片Ⅰ2000-9-14pslb53新疆甜瓜叶片Ⅰ2000-9-14pslb54新疆甜瓜叶片Ⅰ2000-9-14pslb60新疆甜瓜叶片Ⅰ2000-9-14pslb61新疆甜瓜叶片Ⅰ2000-9-14pslb24内蒙古临河市八一乡甜瓜果实Ⅰ2000-7-18p9pslb62新疆甜瓜叶片Ⅰ2000-9-14pslb63新疆甜瓜叶片Ⅰ2000-9-14pslb64新疆甜瓜叶片Ⅰ2000-9-14pslb65新疆甜瓜叶片Ⅰ2000-9-14pslb68新疆阿尔泰甜瓜叶片Ⅰ2001-8-26pslb69新疆阿尔泰甜瓜叶片Ⅰ2001-8-26pslb70新疆阿尔泰甜瓜叶片Ⅰ2001-8-26pslb71新疆阿尔泰甜瓜叶片Ⅰ2001-8-26pslb73新疆阿尔泰甜瓜叶片Ⅰ2001-8-26pslb74新疆阿尔泰甜瓜叶片Ⅰ2001-8-26pslb75新疆阿尔泰甜瓜叶片Ⅰ2001-8-26pslb76新疆阿尔泰甜瓜叶片Ⅰ2001-8-26pslb88内蒙古临河市甜瓜果实Ⅰ2004-8-13pslb89内蒙古临河市甜瓜果实Ⅰ2004-8-13pslb90内蒙古临河市甜瓜果实Ⅰ2004-8-13pslb91内蒙古临河市甜瓜果实Ⅰ2004-8-13pslb92内蒙古临河市甜瓜果实Ⅰ2004-8-13pslb93新疆五家渠甜瓜叶片Ⅰ2005-7-21pslb94新疆五家渠甜瓜茎Ⅰ2005-7-21pslb95新疆五家渠甜瓜茎Ⅰ2005-7-21pslb96海南甜瓜茎Ⅰ2005-7-21pslb97山东甜瓜果实Ⅰ2009-5-4pslb98河北乐亭甜瓜果实Ⅰ2009-5-14pslb99浙江宁波甜瓜果实Ⅰ2009-5-25pslb101海南甜瓜果实Ⅰ2009-11-12pslb62新疆甜瓜叶片Ⅰ2000-9-14pslb63新疆10pslb102新疆(222团)甜瓜叶片Ⅰ2010-7-15pslb103新疆(222团)甜瓜叶片Ⅰ2010-7-15pslbtw19海南文昌西瓜嫁接苗Ⅰ2009-12-10pslbtw20海南三亚西瓜叶片Ⅰ2010-4-6Aac5台湾西瓜叶片Ⅱ2002-9-3Aac13台湾西瓜叶片Ⅱ2002-9-3Aac14台湾西瓜叶片Ⅱ2002-9-3Fc491Japan西瓜叶片Ⅱ2002-9-3pslb86新疆甜瓜叶片Ⅱ2004-7-7pslbtw2北京西瓜果实Ⅱ2005-6-13pslbtw3北京西瓜果实Ⅱ2005-6-13pslbtw5北京西瓜果实Ⅱ2005-6-30pslbtw6北京西瓜果实Ⅱ2005-6-30pslbtw7北京西瓜果实Ⅱ2005-6-30pslbtw8北京西瓜果实Ⅱ2005-6-30pslbtw9北京西瓜果实Ⅱ2005-6-30pslbtw10北京西瓜果实Ⅱ2005-6-30pslbtw11北京西瓜果实Ⅱ2005-6-30pslbtw14广东西瓜果实Ⅱ2008-10-24pslbtw15山东西瓜叶片Ⅱ2009-5-4pslbtw16黑龙江哈尔滨西瓜叶片Ⅱ2009-11-2pslbtw22北京大兴西瓜果实Ⅱ2010-6-26pslbtw23北京大兴西瓜果实Ⅱ2010-6-26pslbtw24北京大兴西瓜果实Ⅱ2010-6-26pslbtw25北京大兴西瓜果实Ⅱ2010-6-26pslb102新疆(222团)甜瓜叶片Ⅰ2010-7-1511pslbtw26北京大兴西瓜果实Ⅱ2010-6-26pslbtw27新疆打瓜果实Ⅱ2010-8-1pslbtw28新疆打瓜果实Ⅱ2010-8-1pslbtw29新疆打瓜果实Ⅱ2010-8-1pslbtw30新疆打瓜果实Ⅱ2010-8-1pslbtw31新疆打瓜果实Ⅱ2010-8-1pslbtw32黑龙江哈尔滨西瓜叶片Ⅱ2010-8-11pslbtw33黑龙江哈尔滨西瓜叶片Ⅱ2010-8-11pslbtw34黑龙江哈尔滨西瓜果实Ⅱ2010-9-1pslbtw35黑龙江哈尔滨西瓜果实Ⅱ2010-9-1pslbtw36黑龙江哈尔滨西瓜果实Ⅱ2010-9-1pslbtw37黑龙江哈尔滨西瓜果实Ⅱ2010-9-1pslbtw38黑龙江哈尔滨西瓜果实Ⅱ2010-9-1pslbtw39海南文昌西瓜子叶Ⅱ2010-11-6pslbtw40海南西瓜子叶Ⅱ2010-11-6pslbtw41北京大兴西瓜子叶Ⅱ2010-12-24pslbtw42北京大兴西瓜子叶Ⅱ2010-12-24pslbtw43北京大兴西瓜子叶Ⅱ2010-12-24pslbtw26北京大兴西瓜果实Ⅱ2010-6-26pslb122.2供试试剂和仪器

电磁炉，微波炉，高压灭菌锅，超净工作台（北京东联哈尔仪器制造有限公司，DL-CJ-2ND医用型），恒温培养箱（DHP120，上海实验仪器厂有限公司），蛋白胨、琼脂粉、磷酸氢二钾、七水合硫酸镁购自北京化学试剂公司，五水硫酸铜购自天津大学科威公司。2.2供试试剂和仪器电磁炉，微波炉，高132.3试验方法2.3.1不同浓度硫酸铜KB培养基配制用移液枪吸取硫酸铜母液加入溶化的KB培养基中，使硫酸铜的终浓度分别为：50µg/ml、100µg/ml、150µg/ml、200µg/ml、250µg/ml、300µg/ml、350µg/ml、400µg/ml，450µg/ml，500µg/ml，550µg/ml，600µg/ml、650µg/ml、700µg/ml、750µg/ml，混匀后倒平板备用。

2.3.2接种活化实验室保存的113株果斑病菌株，28℃培养48h后，挑取单菌落划线接种于不同浓度的硫酸铜平板上，每个浓度设置3个重复，并划线接种于不含硫酸铜的KB平板作为对照，28℃培养，1d后开始观察，观察10d。2.3试验方法2.3.1不同浓度硫酸铜KB培养基配制143结果与分析3.1供试菌株对硫酸铜抗性差异比较

所有菌株对小于300µg/ml浓度均不敏感，300µg/ml浓度时只有pslbtw43菌株表现敏感，在浓度达700µg/ml时所有菌株在划线培养10d后均不能生长，据此推断果斑病菌株对硫酸铜的最大抗性浓度约为700µg/ml。本试验结果与R.R.Walcott研究不一致。3结果与分析3.1供试菌株对硫酸铜抗性差异比较15表2果斑病菌对不同浓度硫酸铜敏感度

Table2bacteriasensitivitytodifferentconcentrationsofcoppersulfate菌株号硫酸铜浓度（µg/ml）50100150200250300350400450500550600650Aacw1＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋Aacw2＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋Aac5＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—Aac13＋＋＋＋＋＋＋＋—Aac14＋＋＋＋＋＋＋＋—Fc247＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—Fc356＋＋＋＋＋＋＋＋＋—Fc376＋＋＋＋＋＋＋＋—Fc491＋＋＋＋＋＋＋—Fc520＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋pslb1＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb2＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋pslb3＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—表2果斑病菌对不同浓度硫酸铜敏感度

Table2bact16pslb4＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb8＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb9＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb10＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb15＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb18＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb19＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb22＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb23＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb24＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb25＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb27＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb28＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb29＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb30＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb31＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb35＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb36＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb4＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb8＋＋＋＋＋＋17pslb37＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb38＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb39＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb40＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb41＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb42＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb44＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb45＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb46＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb47＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb48＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb49＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb52＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb53＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb54＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb60＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb61＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb62＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb37＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb38＋＋＋＋18pslb63＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb64＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb65＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb68＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb69＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb70＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb71＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb73＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb74＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb75＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb76＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb86＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb88＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb89＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb90＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb91＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb92＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb93＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb63＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb64＋＋＋＋＋19pslb94＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb95＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb96＋＋＋＋＋＋＋—pslb97＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb98＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb99＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb101＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb102＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb103＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslbtw1＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslbtw2＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslbtw3＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslbtw5＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslbtw6＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslbtw7＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslbtw8＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslbtw9＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslbtw10＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb94＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb95＋＋＋＋20pslbtw11＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslbtw14＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslbtw15＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslbtw16＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslbtw19＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslbtw20＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslbtw22＋＋＋＋＋＋＋＋—pslbtw23＋＋＋＋＋＋＋＋——pslbtw24＋＋＋＋＋＋＋＋——pslbtw25＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslbtw26＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslbtw27＋＋＋＋＋＋＋＋—pslbtw28＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslbtw29＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslbtw30＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslbtw31＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslbtw32＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslbtw33＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslbtw11＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslbtw1421

注：“＋”表示生长，“—”表示不生长。pslbtw34＋＋＋＋＋＋＋＋—pslbtw35＋＋＋＋＋＋＋＋—pslbtw36＋＋＋＋＋＋＋＋—pslbtw37＋＋＋＋＋＋＋＋—pslbtw38＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslbtw39＋＋＋＋＋＋＋＋—pslbtw40＋＋＋＋＋＋＋—pslbtw41＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslbtw42＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslbtw43＋＋＋＋＋—注：“＋”表示生长，“—”表示不生长。pslbtw34＋＋223.2Ⅰ亚群和Ⅱ亚群菌株抗铜性差异

在硫酸铜浓度为500µg/ml时Ⅱ亚群73%的菌株不能够生长，而Ⅰ亚群菌株在浓度为650µg/ml时仍有72%的菌株生长.即Ⅰ亚群菌株抗铜性明显强于Ⅱ亚群菌株，且在试验过程中，Ⅰ亚群菌株的生长速率明显高于Ⅱ亚群菌株。

硫酸铜浓度（µg/ml

）图2Ⅰ亚群和Ⅱ亚群菌株抗铜差异比较Fig2subgroupⅠandⅡcopperresistancedifference3.2Ⅰ亚群和Ⅱ亚群菌株抗铜性差异在硫酸铜浓度为233.3不同寄主菌株抗铜性差异

图3不同寄主菌株的抗铜差异分析Fig3Differentstrainsofhostresistancetocoppervarianceanalysis3.3不同寄主菌株抗铜性差异图3不同寄主菌株的抗铜差异244结论与讨论4.1结论

本试验通过对比果斑病菌株Ⅰ亚群菌株和Ⅱ亚群菌株、不同寄主菌株抗铜性差异，结果表明:(1)Ⅰ亚群菌株抗铜性明显强于Ⅱ亚群菌株，且在实验过程中，Ⅰ亚群菌株的生长速率明显高于Ⅱ亚群菌株。(2)寄主为甜瓜的菌株比其他寄主的菌株有更高的铜抗性。而Ⅰ亚群菌株主要分离自甜瓜、南瓜等，Ⅱ亚群菌株主要分离自西瓜，两组分析得出的结论相符。本试验为大田中科学合理的防治果斑病提供了理论依据，在喷药过程中，西瓜大田中配制农药浓度低于甜瓜大田，从而可以有效的减缓菌株对农药的抗性提升。4结论与讨论4.1结论254.2讨论

本试验得出的瓜类果斑病菌对硫酸铜的敏感浓度明显高于R.R.Walcott的研究结果。

两试验方法相同且两研究中来自共同地方的菌株硫酸铜敏感度均与各实验相一致，这就排除了两试验结果不同的地理因素。结果不一致的可能原因是R.R.Walcott所选的菌株均分离自2000年前，而本试验所选的菌株均分离自2000年后，由于农药的使用、空气污染等使菌株的抗性增加。本试验所选的113株菌株，来自我国西甜瓜产区的10个省市，试验结果可以体现我国果斑病菌株整体的抗铜特征，具有代表性。4.2讨论本试验得出的瓜类果斑病菌对硫酸铜的敏感26致谢本论文是在导师高洁的悉心指导下完成的。从论文的选题、实验方案的设计到论文的撰写修改，每个环节都凝聚着赵老师的心血。高老师忘我的工作精神、严谨的治学态度、高尚的人格和平易近人的作风令我终生受益，激励我在今后的工作岗位和人生道路上不断前进与发展。高老师为我的学习付出了大量的心血。衷心感谢高老师在学习和生活上对我的关怀和帮助，在此献上我最崇高的敬意和最诚挚的谢意！论文完成期间，感谢王雪老师，感谢在实习期间赵廷昌老师、师姐王铁霖、林振亚、杨姗姗、师兄赵文龙、刘慧琴老师在日常的学习生活中给予我点点滴滴的关心和帮助。还有在我周围一直支持我的同学，为我们搜寻就业信息，给我们提供建议。还有团委老师，班委们，他们为我们的学习生活一直忙碌着。在我的学习生涯中，我成长的每一步都离不开父母的辛勤培养和无私关爱，他们对我的鼓励和支持是我的坚实后盾，在此向他们献上最诚挚的敬意和感谢。值此毕业之际，衷心感谢所有关心和帮助过我的老师、同学、亲人和朋友，祝福他们身体健康，工作顺利！最后要感谢陪伴我四年的大学同学，不管我做什么决定都一直支持我，鼓励我，帮助我。谢谢吉林农业大学，谢谢我周围所有的人，让我的大学生活丰富多彩。致谢2728答辩人：单亚楠指导老师：高洁教授赵廷昌研究员

瓜类细菌性果斑病菌抗铜差异性检测答辩人：单亚楠瓜类细菌性果斑病菌抗铜差异性检29研究内容2.

材料与方法

1.

前言3.

5.致谢结果与分析4.结论与讨论研究内容2.材301前言

瓜类细菌性果斑病（BFB）是发生在葫芦科植物上的一种严重的世界性病害，该病害为种传病害。病原菌为西瓜嗜酸菌(Acidovoraxcitrulli，简称Ac)，是近年来传入国内的检疫性有害生物，1985年首次被鉴定为类产碱假单胞菌西瓜亚种，1992年被更名为西瓜细菌性果斑病菌(Acidovoraxavenae

subsp.citrulli)。菌株间存在比较丰富的遗传多样性，可以分为两个亚群，亚群Ⅰ主要分离自甜瓜、南瓜等，亚群Ⅱ主要分离自西瓜等。瓜类细菌性果斑病是国内外西瓜甜瓜上危害最为严重的病害之一。目前除了严格检疫尚无有效防治措施。1前言瓜类细菌性果斑病（BF311.1危害症状图1：瓜类细菌性果斑病发病症状：西瓜子叶(A),西瓜真叶(B),西瓜果实(C),甜瓜真叶(D),甜瓜果实(E),甜瓜果肉(F)1.1危害症状图1：瓜类细菌性果斑病发病症状：西瓜子叶(A321.2瓜类细菌性果斑病的发生情况

该病害自1998年在我国首次报道，15年的时间已经遍布了我国许多农业大省。该病最早于1969年由Crall和sehenckt在美国佛罗里达州发现，并对果斑病的症状进行了描述。1985年wall和santos在关岛报道了西瓜细菌性果斑病的发生，并首次将其病原菌鉴定为类产碱假单胞菌西瓜亚种。1992年Willems等人根据西瓜果斑病病原菌的rRNA-DNA和DNA-DNA分子杂交研究结果，将其更名为西瓜细菌性果斑病菌(Acidovoraxavenae

subsp.citrulli)。1.2瓜类细菌性果斑病的发生情况该病害自1998年在我国331.3瓜类细菌性果斑病的防治关于该病害的防治方法有加强检疫、药剂防治、种子处理、从无病区引种、生物防治、采用抗病品种等。目前应用最广泛的是药剂防治，有效的药剂是铜制剂和抗生素。5%百菌清1公斤/亩、14%络氨铜水剂300倍液或50%甲霜铜可湿性粉剂600倍液,77%氢氧化铜可湿性微粒粉剂400倍液,用量60～75升/亩,连续3～4次。硫酸链霉素或72%农用链霉素可溶性粉剂4000倍液;40万单位的青霉素甲盐5000倍液。药剂防治方面主要是铜制剂。1.3瓜类细菌性果斑病的防治关于该病害的防治方法有加强检疫341.4本论文研究目的及意义

我国的西瓜、甜瓜种植面积和产量都位居世界前列。瓜类细菌性果斑病给我国西甜瓜生产造成了严重危害。用于田间防治果斑病的主要是含铜杀菌剂。随着铜制剂的不断应用病原菌对铜制剂抗性不断增加，而目前国内对果斑病菌菌株之间抗铜性的差异还没有报道，因此本试验对113株菌株的抗铜性进行了研究，阐明菌株间的抗铜性差异，从而为田间合理使用含铜杀菌剂提供有力的证据。1.4本论文研究目的及意义我国的西瓜、甜瓜种植面积和产35菌株号采集地点寄主分离部位亚群分离时间No.ofstrainLocationHostOrganisolatedgroupTimeisolatedAacw1内蒙古临河市西瓜叶片Ⅰ2002-9-3Aacw2内蒙古临河市西瓜叶片Ⅰ2002-9-3Fc247Unitedstates西瓜叶片Ⅰ2002-9-3Fc520UnitedStates西瓜叶片Ⅰ2002-9-3pslb1内蒙古临河市甜瓜叶片Ⅰ2000-7-14pslb2内蒙古临河市甜瓜叶片Ⅰ2000-7-14pslb3内蒙古临河市甜瓜叶片Ⅰ2000-7-14pslb4内蒙古临河市甜瓜叶片Ⅰ2000-7-14pslb8内蒙古临河市甜瓜叶片Ⅰ2000-7-14pslb9内蒙古临河市甜瓜叶片Ⅰ2000-7-14pslb10内蒙古临河市甜瓜叶片Ⅰ2000-7-14pslb15内蒙古临河市甜瓜叶片Ⅰ2000-7-18pslb19内蒙古临河市八一乡甜瓜叶片Ⅰ2000-7-18pslb22内蒙古临河市八一乡甜瓜果实Ⅰ2000-7-18pslb23内蒙古临河市八一乡甜瓜果实Ⅰ2000-7-182材料与方法2.1供试菌株表1113株供试瓜类细菌性果斑病菌菌株菌株号采集地点寄主分离部位亚群分离时间No.ofstra36pslb24内蒙古临河市八一乡甜瓜果实Ⅰ2000-7-18pslb25内蒙古临河市八一乡甜瓜果实Ⅰ2000-7-18pslb28内蒙古临河市八一乡甜瓜果实Ⅰ2000-7-18pslb29内蒙古临河市八一乡甜瓜果实Ⅰ2000-7-18pslb30内蒙古临河市八一乡甜瓜果实Ⅰ2000-7-18pslb31内蒙古临河市八一乡甜瓜叶片Ⅰ2000-7-25pslb35内蒙古巴盟农业多种经营站甜瓜子叶Ⅰ2000-8-20pslb36内蒙古巴盟农业多种经营站甜瓜子叶Ⅰ2000-8-20pslb37新疆甜瓜果实Ⅰ2000-9-9pslb38新疆甜瓜果实Ⅰ2000-9-9pslb39新疆呼图壁甜瓜果实Ⅰ2000-9-14pslb40新疆呼图壁甜瓜果实Ⅰ2000-9-14pslb41新疆呼图壁甜瓜果实Ⅰ2000-9-14pslb42新疆呼图壁甜瓜果实Ⅰ2000-9-14pslb44新疆甜瓜果实Ⅰ2000-9-14pslb45新疆甜瓜果实Ⅰ2000-9-14pslb46新疆甜瓜果实Ⅰ2000-9-14pslb47新疆甜瓜果实Ⅰ2000-9-14pslb48新疆甜瓜子叶Ⅰ2000-9-14pslb49新疆甜瓜叶片Ⅰ2000-9-14pslb52新疆甜瓜叶片Ⅰ2000-9-14pslb53新疆甜瓜叶片Ⅰ2000-9-14pslb54新疆甜瓜叶片Ⅰ2000-9-14pslb60新疆甜瓜叶片Ⅰ2000-9-14pslb61新疆甜瓜叶片Ⅰ2000-9-14pslb24内蒙古临河市八一乡甜瓜果实Ⅰ2000-7-18p37pslb62新疆甜瓜叶片Ⅰ2000-9-14pslb63新疆甜瓜叶片Ⅰ2000-9-14pslb64新疆甜瓜叶片Ⅰ2000-9-14pslb65新疆甜瓜叶片Ⅰ2000-9-14pslb68新疆阿尔泰甜瓜叶片Ⅰ2001-8-26pslb69新疆阿尔泰甜瓜叶片Ⅰ2001-8-26pslb70新疆阿尔泰甜瓜叶片Ⅰ2001-8-26pslb71新疆阿尔泰甜瓜叶片Ⅰ2001-8-26pslb73新疆阿尔泰甜瓜叶片Ⅰ2001-8-26pslb74新疆阿尔泰甜瓜叶片Ⅰ2001-8-26pslb75新疆阿尔泰甜瓜叶片Ⅰ2001-8-26pslb76新疆阿尔泰甜瓜叶片Ⅰ2001-8-26pslb88内蒙古临河市甜瓜果实Ⅰ2004-8-13pslb89内蒙古临河市甜瓜果实Ⅰ2004-8-13pslb90内蒙古临河市甜瓜果实Ⅰ2004-8-13pslb91内蒙古临河市甜瓜果实Ⅰ2004-8-13pslb92内蒙古临河市甜瓜果实Ⅰ2004-8-13pslb93新疆五家渠甜瓜叶片Ⅰ2005-7-21pslb94新疆五家渠甜瓜茎Ⅰ2005-7-21pslb95新疆五家渠甜瓜茎Ⅰ2005-7-21pslb96海南甜瓜茎Ⅰ2005-7-21pslb97山东甜瓜果实Ⅰ2009-5-4pslb98河北乐亭甜瓜果实Ⅰ2009-5-14pslb99浙江宁波甜瓜果实Ⅰ2009-5-25pslb101海南甜瓜果实Ⅰ2009-11-12pslb62新疆甜瓜叶片Ⅰ2000-9-14pslb63新疆38pslb102新疆(222团)甜瓜叶片Ⅰ2010-7-15pslb103新疆(222团)甜瓜叶片Ⅰ2010-7-15pslbtw19海南文昌西瓜嫁接苗Ⅰ2009-12-10pslbtw20海南三亚西瓜叶片Ⅰ2010-4-6Aac5台湾西瓜叶片Ⅱ2002-9-3Aac13台湾西瓜叶片Ⅱ2002-9-3Aac14台湾西瓜叶片Ⅱ2002-9-3Fc491Japan西瓜叶片Ⅱ2002-9-3pslb86新疆甜瓜叶片Ⅱ2004-7-7pslbtw2北京西瓜果实Ⅱ2005-6-13pslbtw3北京西瓜果实Ⅱ2005-6-13pslbtw5北京西瓜果实Ⅱ2005-6-30pslbtw6北京西瓜果实Ⅱ2005-6-30pslbtw7北京西瓜果实Ⅱ2005-6-30pslbtw8北京西瓜果实Ⅱ2005-6-30pslbtw9北京西瓜果实Ⅱ2005-6-30pslbtw10北京西瓜果实Ⅱ2005-6-30pslbtw11北京西瓜果实Ⅱ2005-6-30pslbtw14广东西瓜果实Ⅱ2008-10-24pslbtw15山东西瓜叶片Ⅱ2009-5-4pslbtw16黑龙江哈尔滨西瓜叶片Ⅱ2009-11-2pslbtw22北京大兴西瓜果实Ⅱ2010-6-26pslbtw23北京大兴西瓜果实Ⅱ2010-6-26pslbtw24北京大兴西瓜果实Ⅱ2010-6-26pslbtw25北京大兴西瓜果实Ⅱ2010-6-26pslb102新疆(222团)甜瓜叶片Ⅰ2010-7-1539pslbtw26北京大兴西瓜果实Ⅱ2010-6-26pslbtw27新疆打瓜果实Ⅱ2010-8-1pslbtw28新疆打瓜果实Ⅱ2010-8-1pslbtw29新疆打瓜果实Ⅱ2010-8-1pslbtw30新疆打瓜果实Ⅱ2010-8-1pslbtw31新疆打瓜果实Ⅱ2010-8-1pslbtw32黑龙江哈尔滨西瓜叶片Ⅱ2010-8-11pslbtw33黑龙江哈尔滨西瓜叶片Ⅱ2010-8-11pslbtw34黑龙江哈尔滨西瓜果实Ⅱ2010-9-1pslbtw35黑龙江哈尔滨西瓜果实Ⅱ2010-9-1pslbtw36黑龙江哈尔滨西瓜果实Ⅱ2010-9-1pslbtw37黑龙江哈尔滨西瓜果实Ⅱ2010-9-1pslbtw38黑龙江哈尔滨西瓜果实Ⅱ2010-9-1pslbtw39海南文昌西瓜子叶Ⅱ2010-11-6pslbtw40海南西瓜子叶Ⅱ2010-11-6pslbtw41北京大兴西瓜子叶Ⅱ2010-12-24pslbtw42北京大兴西瓜子叶Ⅱ2010-12-24pslbtw43北京大兴西瓜子叶Ⅱ2010-12-24pslbtw26北京大兴西瓜果实Ⅱ2010-6-26pslb402.2供试试剂和仪器

电磁炉，微波炉，高压灭菌锅，超净工作台（北京东联哈尔仪器制造有限公司，DL-CJ-2ND医用型），恒温培养箱（DHP120，上海实验仪器厂有限公司），蛋白胨、琼脂粉、磷酸氢二钾、七水合硫酸镁购自北京化学试剂公司，五水硫酸铜购自天津大学科威公司。2.2供试试剂和仪器电磁炉，微波炉，高412.3试验方法2.3.1不同浓度硫酸铜KB培养基配制用移液枪吸取硫酸铜母液加入溶化的KB培养基中，使硫酸铜的终浓度分别为：50µg/ml、100µg/ml、150µg/ml、200µg/ml、250µg/ml、300µg/ml、350µg/ml、400µg/ml，450µg/ml，500µg/ml，550µg/ml，600µg/ml、650µg/ml、700µg/ml、750µg/ml，混匀后倒平板备用。

2.3.2接种活化实验室保存的113株果斑病菌株，28℃培养48h后，挑取单菌落划线接种于不同浓度的硫酸铜平板上，每个浓度设置3个重复，并划线接种于不含硫酸铜的KB平板作为对照，28℃培养，1d后开始观察，观察10d。2.3试验方法2.3.1不同浓度硫酸铜KB培养基配制423结果与分析3.1供试菌株对硫酸铜抗性差异比较

所有菌株对小于300µg/ml浓度均不敏感，300µg/ml浓度时只有pslbtw43菌株表现敏感，在浓度达700µg/ml时所有菌株在划线培养10d后均不能生长，据此推断果斑病菌株对硫酸铜的最大抗性浓度约为700µg/ml。本试验结果与R.R.Walcott研究不一致。3结果与分析3.1供试菌株对硫酸铜抗性差异比较43表2果斑病菌对不同浓度硫酸铜敏感度

Table2bacteriasensitivitytodifferentconcentrationsofcoppersulfate菌株号硫酸铜浓度（µg/ml）50100150200250300350400450500550600650Aacw1＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋Aacw2＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋Aac5＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—Aac13＋＋＋＋＋＋＋＋—Aac14＋＋＋＋＋＋＋＋—Fc247＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—Fc356＋＋＋＋＋＋＋＋＋—Fc376＋＋＋＋＋＋＋＋—Fc491＋＋＋＋＋＋＋—Fc520＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋pslb1＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb2＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋pslb3＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—表2果斑病菌对不同浓度硫酸铜敏感度

Table2bact44pslb4＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb8＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb9＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb10＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb15＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb18＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb19＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb22＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb23＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb24＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb25＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb27＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb28＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb29＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb30＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb31＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb35＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb36＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb4＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb8＋＋＋＋＋＋45pslb37＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb38＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb39＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb40＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb41＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb42＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb44＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb45＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb46＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb47＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb48＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb49＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb52＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb53＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb54＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb60＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb61＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb62＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb37＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb38＋＋＋＋46pslb63＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb64＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb65＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb68＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb69＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb70＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb71＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb73＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb74＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb75＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb76＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb86＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb88＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb89＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb90＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb91＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb92＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb93＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb63＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb64＋＋＋＋＋47pslb94＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb95＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb96＋＋＋＋＋＋＋—pslb97＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb98＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb99＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb101＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb102＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb103＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslbtw1＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslbtw2＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslbtw3＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslbtw5＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslbtw6＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslbtw7＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslbtw8＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslbtw9＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslbtw10＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb94＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb95＋＋＋＋48pslbtw11＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslbtw14＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslbtw15＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslbtw16＋＋＋＋＋＋＋＋＋—