细胞质膜课件

细胞质膜

1细胞质膜1标题添加点击此处输入相关文本内容点击此处输入相关文本内容前言点击此处输入相关文本内容标题添加点击此处输入相关文本内容2标题添加点击此处输入相点击此处输入前言点击此处输入标题添加点HarvardUniversityTheInnerLifeoftheCell3HarvardUniversity3第一节细胞质膜的结构模型与基本组分细胞质膜的概念

细胞质膜的结构模型

细胞质膜的基本成分4第一节细胞质膜的结构模型与基本组分细胞质膜的概念4由脂质和蛋白质组成的具有一定结构和生物功能的胞内所有被膜的总称。5由脂质和蛋白质组成的具有一定结构和生物功能的胞内所有被膜的总概念：围绕在细胞最外层，由脂质、蛋白质和糖类组成的

生物膜。功能：作为细胞的界膜，使细胞具有一个相对稳定的内环境；在细胞和环境之间的物质运输、能量转换及信息传递

过程中也起着重要作用。细胞质膜(plasmamembrane)6概念：围绕在细胞最外层，由脂质、蛋白质和糖类组成的细胞质膜一、细胞质膜的结构模型Gorder和Grendel：双层脂分子结构Davson和Danielli：蛋白质-脂质-蛋白质的三明治结构Robertson：单位膜模型Singer和Nicholson：流动镶嵌模型Uptodate：脂筏模型7一、细胞质膜的结构模型Gorder和Grendel：双1895年，E.Overton发现凡是溶于脂肪的物质很容易透过植物的细胞膜，而不溶于脂肪的物质不易透过细胞膜，因此推测细胞膜由连续的脂类物质组成。1.质膜是由脂类物质构成的推测81895年，E.Overton发现凡是溶于脂肪的物质很容易1925年，E.Gorter和F.Grendel利用有机溶剂抽提人的红细胞质膜的膜脂成分，以便测定膜脂单层分子在水面的铺展面积，发现它是红细胞表面积的二倍，这一结果提示了质膜是由双层脂分子构成。2.质膜是由双层脂分子构成的推测91925年，E.Gorter和F.Grendel利用有1935年，Davson和Danielli发现质膜的表面张力比油-水界面的表面张力低得多，推测质膜中含有蛋白质成分，并提出“蛋白质-脂质-蛋白质”的三明治式的质膜结构模型。3.“蛋白质-脂质-蛋白质”三明治式质膜结构模型101935年，Davson和Danielli发现质膜的表面张力4.单位膜模型（unitmembranemodel）1959年，J.D.Robertson利用超薄切片技术获得了清晰的细胞膜照片，显示暗-明-暗三层结构，它由厚约3.5nm的双层脂分子和内外表面各厚约2nm的蛋白质构成，整个膜的厚度约7.5nm。114.单位膜模型（unitmembranemodel）15.流动镶嵌模型（fluidmosaicmodel）

1972年，S.J.Singer和G.L.Nicholson提出了生物膜的流动镶嵌模型；

细胞膜主要是由磷脂双分子层和镶嵌在其中的蛋白质组成；

膜的流动性和膜蛋白分布的不对称性。125.流动镶嵌模型（fluidmosaicmodel）6.脂筏模型（lipidraftmodel）1988年，Simons提出脂筏模型；胆固醇和鞘磷脂等富集区域形成相对有序的脂相，如同漂浮在

脂双层上的“竹筏”。136.脂筏模型（lipidraftmodel）1988年脂筏模型大小为10-200nm，富含胆固醇、鞘磷脂等形成相对有序的脂相。由于鞘磷脂具有较长的饱和脂肪酸链，分子间作用力较强，所以这些区域结构致密是一种动态结构，介于无序液体与液晶之间，称为有序液体（Liquid-ordered，Lo），流动性比非筏区弱。

低温下可耐受非离子去垢剂的抽提，称为抗去垢剂膜

（detergent-resistantmembrane，DRMs）。14脂筏模型大小为10-200nm，富含胆固醇、鞘磷脂等形成植物脂筏的结构示意图

鞘脂类（sphingolipid）固醇类（sterol）BhatandPanstruga.2005.Planta223:5-1915植物脂筏的结构示意图鞘脂类（sphingolipid）B脂质微区脂筏（lipidrafts）质膜微囊（Caveolae）

标记蛋白GPI-anchoredproteincaveolinflotillin

remorinstomatinprohibitinSimonsandIkonen.1997.Nature387:569-572raft16脂质微区SimonsandIkonen.1997.在细胞质膜的脂筏区形成的特异性的内陷微区，亦称为胞膜窖、

小窝。主要存在于高度分化的细胞，在内皮细胞、上皮细胞、皮纤维

细胞、平滑肌细胞、脂肪细胞中尤为丰富。

主要由脂类和蛋白质组成：

脂类成分主要包括胆固醇、鞘糖、鞘磷脂；

蛋白质成分主要包括窖蛋白（caveolin）、脂质锚定蛋白（如GPI锚定蛋白）等，

其中caveolin是caveolae的表面标记蛋白，是构成caveolae的完整膜蛋白，又称为

小窝蛋白。质膜微囊（caveolae）17在细胞质膜的脂筏区形成的特异性的内陷微区，亦称为胞膜窖、质人纤维原细胞的小窝电镜图(65nm)

PartonRG.2001.Science293:2404-240518人纤维原细胞的小窝电镜图(65nm)PartonRG细胞质膜的结构认知磷脂双分子层是组成细胞质膜的基本结构成分；蛋白分子以不同方式镶嵌在脂双层分子中或结合在其表面，

膜蛋白是赋予细胞质膜功能的主要决定者；细胞质膜可看成是蛋白质在双层脂中的二维溶液；细胞质膜在三维空间上可出现弯曲、折叠、延伸等改变，处于不断的动态变化中。19细胞质膜的结构认知磷脂双分子层是组成细胞质膜的基本结构成分；1.膜脂甘油磷脂(glycerophosphatide)

鞘脂(sphingolipid)

固醇(sterols)二、细胞质膜的基本成分201.膜脂甘油磷脂(glycerophosphatide甘油磷脂

极性头部非极性尾部甘油骨架和磷酸基团21甘油磷脂

极性头部21极性头部：乙醇胺、胆碱、丝氨酸、肌醇等，为甘油磷脂命名非极性尾部：脂肪酸碳链；多为偶数，16或18个碳原子；饱和脂肪酸和含有1-2个不饱和双键的脂肪酸，双键产生30度左右弯曲，提供质膜的流动性。

甘油骨架和磷酸基团

内质网合成50%以上甘油磷脂

22极性头部：乙醇胺、胆碱、丝氨酸、肌醇等，为甘油磷脂命名甘油磷极性头的空间占位可影响脂双层的曲度PE头较小，更多地分布在脂双层曲率较大的一侧，因此更倾向于形成曲面膜。磷脂酰胆碱（卵磷脂）磷脂酰乙醇胺（脑磷脂）23极性头的空间占位可影响脂双层的曲度PE头较小A.卵磷脂B.鞘磷脂鞘脂

主要在高尔基体合成；

鞘磷脂形成的脂双层的厚度较甘油磷脂的厚度更大，如神经

鞘磷脂为4.6-5.6nm，而卵磷脂约3.5nm。24A.卵磷脂鞘脂

主要在高尔基体合成；24鞘磷脂

非极性尾部：长链脂肪酸，烃链极性头部鞘氨醇骨架和磷酸基团高尔基体合成在脑细胞和神经细胞膜中含量丰富极性头部非极性尾部25鞘磷脂

非极性尾部：长链脂肪酸，烃链极性头部非极性尾部25糖脂非极性尾部：长链脂肪酸，烃链极性头部：糖分子或寡糖链鞘氨醇骨架和磷酸基团约占脂总量的5％以下，在神经细胞膜上糖脂含量较高，约占5-10％。只存在于细胞膜的外表面。26糖脂非极性尾部：长链脂肪酸，烃链26半乳糖脑苷脂神经节苷脂唾液酸糖脂的分类半乳糖脑苷脂：最简单的糖脂，极性头部为半乳糖，在髓鞘的多层膜中含量丰富。神经节苷脂：变化最多、最复杂的糖脂，其头部包含一个或几个唾液酸和糖的残基，是神经元质膜中具有特征性的成分。27半乳糖脑苷脂神经节苷脂唾液酸糖脂的分类半乳糖脑苷脂：最简单的固醇动物细胞和极少数的原核细胞：胆固醇植物细胞：豆固醇和谷固醇真菌和酵母：麦角固醇28固醇动物细胞和极少数的原核细胞：胆固醇28固醇：胆固醇及其类似物含有4个闭环的碳氢化合物，亲水头部为一个羟基(OH)；插入磷脂分子之间，参与细胞膜的形成，调节膜的流动性和通透性；

脂筏的基本结构成分；

生物活性分子的合成前体：固醇类激素、维生素D和胆酸等。29固醇：胆固醇及其类似物含有4个闭环的碳氢化合物，亲水头部膜脂的功能构成膜的基本骨架膜蛋白的溶剂为某些膜蛋白(酶)维持构象、表现活性提供环境30膜脂的功能30脂质体（liposome）一种根据磷脂分子可在水相中形成稳定的脂双层膜现象而制备的人工膜。在水中磷脂分子亲水头部插入水中，脂质体疏水尾部伸向空气，搅动后形成单层或双层脂分子的球形脂质体，直径25~1000nm不等。31脂质体（liposome）一种根据磷脂分子可在水相中形成稳定脂质体的类型水溶液中的磷脂分子团球形脂质体平面脂质体膜32脂质体的类型水溶液中的磷脂分子团32脂质体的应用研究膜脂与膜蛋白及其生物学性质。脂质体中裹入DNA可用于基因转移。在临床治疗中，脂质体作为药物或酶等载体。33脂质体的应用研究膜脂与膜蛋白及其生物学性质。33类型功能去垢剂2.膜蛋白34类型2.膜蛋白34膜蛋白种类繁多；

赋予生物膜重要的生物学功能；50%以上的小分子药物的受体为膜蛋白。35膜蛋白种类繁多；35膜蛋白的类型外在膜蛋白/外周膜蛋白（peripheralprotein）

内在膜蛋白/整合膜蛋白（integralprotein）脂锚定膜蛋白（lipid-anchoredprotein）36膜蛋白的类型外在膜蛋白/外周膜蛋白（periphera

外周膜蛋白

分布在膜表面，水溶性通过离子键或其他较弱的键与膜表面的蛋白或脂分子结合改变溶液的离子强度或者提高温度就可以分离以磷脂为底物的水溶性酶类，如磷脂酶：降解衰老或损伤的生物膜多种蛇毒的活性成分37

外周膜蛋白

37

整合膜蛋白

70%-80%水不溶性以不同的程度嵌入膜内，跨膜蛋白与脂质紧密结合，通过去垢剂才可解离如：盐细菌的质膜蛋白---菌紫红质38整合膜蛋白

38细菌紫红质分子的三维结构1975年，N.Unwin和R.Henderson首次报道了盐细菌的质膜蛋白---菌紫红质的三维结构。它是一个跨膜7次的膜蛋白，通过蛋白质的疏水结构域“镶嵌”在脂双层中，利用光能完成质子的转运。39细菌紫红质分子的三维结构1975年，N.Unwin和R.整合膜蛋白的跨膜结构域与脂双层分子疏水核心相互作用；跨膜结构域两端携带正电荷的氨基酸（Arg+，Lys+）残基与磷脂分子带负电的极性头部形成离子键相互作用；膜蛋白胞质侧半胱氨酸残基（Cys）共价结合到脂肪酸分子上，后者插入脂双分子层。

整合膜蛋白与膜脂结合方式

40整合膜蛋白的跨膜结构域与脂双层分子疏水核心相互作用；G蛋白偶联受体41G蛋白偶联受体41水孔蛋白（aquaporin）具有6个α螺旋区的蛋白家族；通常形成四聚体，以行使其转运水或甘油等分子的功能。42水孔蛋白（aquaporin）具有6个α螺旋区的蛋白家族；4跨膜蛋白既有疏水区域（跨膜区），也有亲水区域（膜表面区）；其结构解析主要应用低温电镜技术和X射线晶体衍射技术。水孔蛋白Glpf3-磷酸甘油转运蛋白

跨膜蛋白与膜脂关系的三维结构解析43跨膜蛋白既有疏水区域（跨膜区），也有亲水区域（膜表面区）；水沈建仁和匡廷云研究团队长期致力于光合膜蛋白结构和功能的研究，经过多年的积累解析出了高等植物PSI-LHCI光合膜蛋白超分子复合物2.8Å的晶体结构。匡廷云院士44沈建仁和匡廷云研究团队长期致力于光合膜蛋白结构和施一公团队首次揭示老年痴呆症致病蛋白精细三维结构（2015年）阿尔茨海默症又称老年痴呆症，是一类神经退行性疾病，临床表现为脑组织切片中出现淀粉样斑块，神经元逐渐死亡，认知和记忆能力受损，大脑功能逐渐丧失，病人逐渐丧失独立生活能力，最后脑功能严重受损直至死亡。美国前总统里根和英国前首相撒切尔夫人都罹患该疾病。此前的研究表明，阿尔茨海默症的发生和大脑中淀粉样斑块的形成密切相关。淀粉样斑块则是由膜整合蛋白酶复合物异常切割“淀粉样前体蛋白”所致。因此，获得γ分泌酶复合物的三维结构是目前世界生命科学领域最热门的研究课题之一。45施一公团队首次揭示老年痴呆症致病蛋白精细三维结构（2015年脂锚定蛋白A.脂肪酸结合到膜蛋白N端的甘氨酸残基上B.15或20个碳链长的烃链结合到膜蛋白C端的半胱氨酸残基上C.通过糖脂锚定在细胞质膜上（糖蛋白）46脂锚定蛋白A.脂肪酸结合到膜蛋白N端的甘氨酸残基上46与磷脂酰肌醇糖脂结合锚定在细胞膜上。GPI：以磷脂酰肌醇（PI）为骨架，一端通过两个脂肪酸链插入到膜脂中，一端与长度不等的寡糖链结合，最后通过寡糖末端的磷脂酰己醇胺与蛋白质共价连接。磷脂酰肌醇糖脂结合蛋白（GPI锚定蛋白）47与磷脂酰肌醇糖脂结合锚定在细胞膜上。磷脂酰肌醇糖脂结合蛋白4糖蛋白

糖与氨基酸的连接，由短的寡糖链与蛋白质共价相连构成的分子；

常作为表面识别信号。48糖蛋白

糖与氨基酸的连接，由短的寡糖链与蛋白质共价相连48膜蛋白的功能转运连接受体酶49膜蛋白的功能转运连接受体酶49去垢剂

一端亲水，一端疏水的两性小分子，分离及研究膜蛋白的常用试剂。插入膜脂，与膜脂或膜蛋白的跨膜结构域等疏水部分结合，形成可溶性微粒。CMC：微团临界浓度（criticalmicelleconcentration），浓度高于或低于CMC时，作用方式和效果不同。50去垢剂

一端亲水，一端疏水的两性小分子，分离及研究膜蛋白的常离子型SDS：与膜蛋白疏水部分结合，使其与膜分离。高浓度破坏蛋白质中的非共价键，使蛋白变性，用于SDS凝胶电泳。非离子型TritonX-100：使细胞膜崩解，对蛋白作用比较温和。用于膜蛋白的分离与纯化，也用于去除细胞的膜系统，以便对细胞骨架蛋白和其他蛋白进行研究。去垢剂

51离子型SDS：去垢剂

51甘油磷脂（glycerophosphatide）

鞘脂（sphingolipid）

固醇（sterols）膜脂膜蛋白双层脂分子结构“蛋白质-脂质-蛋白质”的三明治结构单位膜模型流动镶嵌模型脂筏模型外周膜蛋白（peripheralprotein）整合膜蛋白（integralprotein）脂锚定膜蛋白（lipid-anchoredprotein）小结结构模型

基本成分

细胞质膜52甘油磷脂（glycerophosphatide）膜脂膜蛋第二节细胞质膜基本特征与功能膜的流动性膜的不对称性细胞质膜的基本功能53第二节细胞质膜基本特征与功能532.1膜的流动性膜脂流动性膜蛋白流动性542.1膜的流动性膜脂流动性54膜脂的流动性侧向扩散运动：同一平面上相邻的脂分子交换位置。旋转运动：围绕与膜平面垂直的轴进行快速旋转。摆动运动：围绕与膜平面垂直的轴进行左右摆动。55膜脂的流动性侧向扩散运动：55膜脂的流动性伸缩震荡运动：脂肪酸链进行伸缩震荡运动。翻转运动：膜脂分子从脂双层的一层翻转到另一层。旋转异构化运动：脂肪酸链围绕C-C键旋转。56膜脂的流动性56影响膜脂流动性的因素脂肪酸链长度：短链，流动性强。脂肪酸链饱和度：不饱和程度高，流动性强。脂分子相变温度：相变温度低，流动性大。鞘磷脂或卵磷脂流动性小，磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇和磷脂酰丝氨酸流动性高。57影响膜脂流动性的因素脂肪酸链长度：57影响膜脂流动性的因素胆固醇的含量：双重作用胆固醇分子与磷脂分子结合：限制膜脂运动。胆固醇分子隔开磷脂分子：增加膜脂流动。其他因素：膜蛋白与膜脂相互作用。温度。酸碱度。离子强度等。58影响膜脂流动性的因素胆固醇的含量：双重作用58膜蛋白的流动性相对静止（immobile）自由扩散（free

diffusion）受限运动（restrictedmovement）向性运动（directedmovement）混合运动（mixedmovement）59膜蛋白的流动性相对静止（immobile）59利用细胞融合技术观察膜蛋白的侧向运动灭活的仙台病毒介导两种细胞融合10min40min60利用细胞融合技术观察膜蛋白的侧向运动灭活的仙台病毒介导两种细成斑成帽现象观察膜蛋白的侧向运动成斑现象（patching）成帽现象（capping）61成斑成帽现象观察膜蛋白的侧向运动成斑现象（patching）荧光漂白恢复技术（FRAP）观察膜蛋白的侧向运动62荧光漂白恢复技术（FRAP）观察膜蛋白的62影响膜蛋白流动的因素温度蛋白质自身的大小与蛋白的相互作用与膜脂的相互作用63影响膜蛋白流动的因素63膜流动性的生理意义质膜的流动性是保证其正常功能的必要条件。当膜的流动性低于一定的阈值时，许多酶的活动和跨膜运输将停止，反之如果流动性过高，又会造成膜的溶解。64膜流动性的生理意义质膜的流动性是保证其正常功能的必要条件。当2.2膜的不对称性

质膜内外两层的组分和功能的差异，称为膜的不对称性。膜脂的不对称性膜蛋白的不对称性糖的不对称性652.2膜的不对称性

质膜内外两层的组分和功能的差异，称为膜细胞质膜各膜面名称样品经冰冻断裂处理后，细胞膜可从脂双层中央断开，各断面命名为：细胞外表面（extrocytoplasmicsurface,ES）：外小叶细胞外小叶断面（extrocytoplasmicface,EF）原生质表面（protoplasmicsurface,PS）原生质小叶断面（protoplasmicface,PF)：内小叶。66细胞质膜各膜面名称样品经冰冻断裂处理后，细胞膜可从脂双层中央小鼠肝细胞膜冰冻蚀刻67小鼠肝细胞膜冰冻蚀刻67细胞内膜各膜面名称原生质表面（PS）：与细胞质机制接触的膜面细胞外表面（ES）：与囊泡腔中液体接触的膜面在膜泡出芽、转运及融合过程中，其拓扑学结构不变。68细胞内膜各膜面名称原生质表面（PS）：与细胞质机制接触的膜面膜脂的不对称性同一种脂分子在脂双层中呈不均匀分布，与其合成部位相关。膜脂的不对称性还表现在膜表面具有胆固醇和鞘磷脂等形成的微结构域-脂筏。膜脂的不对称性与其生物学功能密切相关。SM：鞘磷脂PC：卵磷脂PS：磷脂酰丝氨酸（血小板）PE：磷脂酰乙醇胺PI：磷脂酰肌醇CI：胆固醇69膜脂的不对称性SM：鞘磷脂69膜蛋白的不对称性每种膜蛋白分子在细胞膜上都具有特定的方向性和分布的区域性。膜蛋白的不对称性在合成时就已经确定，其拓扑学结构始终保持不变。膜蛋白的不对称性是生物膜完成复杂的在时间与空间上有序的各种生理功能的保证。)((HEthyleneBrassinosteroidsPPPCytokinins70膜蛋白的不对称性)((HEthyleneBrassinost糖脂和糖蛋白只分布于细胞膜的外表面。糖蛋白和糖脂的糖基均位于细胞质膜的外侧。糖的不对称性人的ABO血型抗原寡糖链结构的比较71糖脂和糖蛋白只分布于细胞膜的外表面。糖的不对称性人的ABO血膜不对称性的生理意义膜的不对称性导致了膜功能的不对称性和方向性。细胞间的识别、运动、物质运输、信号转导等都具有方向性。72膜不对称性的生理意义膜的不对称性导致了膜功能的不对称性和方向维持稳定的内环境；分隔细胞和细胞器水溶性物质和大分子难以通透选择性地进行物质交换；可调控性高度选择性细胞种类的特异性吸收与分泌提供生化识别与反应的场所；酶促反应免疫识别等与外界保持信息交流；激素识别受体-配体反应等细胞识别（免疫等）运动性：温度等环境因素的影响信号传递和物质交换细胞质膜的基本功能脂双层膜（磷脂，固醇）膜蛋白脂双层膜（磷脂，固醇）膜蛋白（受体）糖脂，糖蛋白等脂双层膜（磷脂，固醇）脂筏膜蛋白（受体）等73维持稳定的内环境；细胞质膜的基本功能脂双层膜（磷脂，固醇）细胞质膜的生物功能边界与通透性屏障组织和功能定位运输作用信号检测细胞间通讯74细胞质膜的生物功能边界与通透性屏障74举例：质膜蛋白的定位和功能研究---GFP融合表达蛋白设计引物，扩增基因（PCR）构建GFP融合表达载体（质粒）转化拟南芥转基因植株的鉴定75举例：质膜蛋白的定位和功能研究设计引物，扩增基因（PCR）7转基因植株的鉴定PCRRT-PCRWestern76转基因植株的鉴定PCRRT-PCRWestern76PCR鉴定以筛选出的苗子DNA为模板，用载体上的一个引物与目的基因上的一个引物进行PCR扩增，根据扩增条带的大来判断是否是阳性植株。77PCR鉴定77RT-PCR以单链的mRNA为模板逆转录生成双链的cDNA，再以此cDNA为模板用引物进行PCR扩增，根据扩增产物的量对原初mRNA的含量进行半定量。78RT-PCR78RT-PCRInterestedGeneLoadingControlWT

KDOECOM

RNA样品定量和参照基因扩增保证样品

中mRNA含量的一致性

调整扩增循环数以区分差异79RT-PCRInterestedGeneWTKWestern通过特异性抗体对凝胶电泳分离后的蛋白样品进行着色。通过分析着色部位的分子量大小和着色深度获知特定蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达情况。80Western通过特异性抗体对凝胶电泳分离后的蛋白样品进行着WesternInterestedProteinLoadingControlWT

KOCOMOE

蛋白样品定量和参照蛋白杂交保证样品

中蛋白含量的一致性

调整曝光时间以区分差异81WesternInterestedProteinWT荧光显微镜（FluorescenceMicroscope）特异性标记并观察目标（生物大分子，信号物质等）。利用生物物质的自发荧光或标记荧光。Nikon公司公开材料82荧光显微镜（FluorescenceMicroscope激光扫描共聚焦显微镜技术（LaserScanningConfocalMicroscopy）北京林业大学实验中心，LeicaSP5激光共聚焦显微镜83激光扫描共聚焦显微镜技术北京林业大学实验中心，LeicaS普通荧光显微镜与共聚焦显微镜的比较分辨率提高1.4-1.7倍小鼠肾小球细胞84普通荧光显微镜与共聚焦显微镜的比较分辨率提高1.4-1.7倍实例利用激光共聚焦显微镜进行的双通道扫描李瑞丽….林金星(2012)PlantCell85实例利用激光共聚焦显微镜进行的双通道扫描李瑞丽….林金星实例微丝（FABD2-GFP）微管（Tubulin-mCheery）86实例微丝（FABD2-GFP）微管（Tubulin-mChe

当光从高折射率(n1)的介质入射到低折射率(n2)的介质时，一部分发生反射，另一部分则会在介质的交界处发生折射进入低折射率介质。当入射角大到一定程度时，光不再折射到低折射率的介质里，而是发生全反射。实际上，由于光的波动效应，有一部分光的能量会穿过界面渗透到介质2中，平行于界面传播。这部分波就是所谓的隐失波，因此全内反射荧光显微术也通常被称为隐失波显微术。全内反射荧光显微术(totalinternalreflectionfluorescencemicroscopy,TIRFM)87当光从高折射率(n1)的介质入射到低折射率TIRFM的优点优点：较高信噪比S/N=35成像速度快200帧/s较小的光漂白和光损伤

利用全内反射产生的隐失波照明样品，

使照明区域限定在样品表面100-400nm范围内，可以实现对细胞膜表面的单个

分子进行活体观测。88TIRFM的优点优点：利用全内反射产生的隐失波照明样品，TIRFM的优点89TIRFM的优点89本研究团队建立的单分子检测平台中科院植物所北京林业大学（主楼402）90本研究团队建立的单分子检测平台中科院植物所北京林业大学（主楼膜蛋白（或膜受体）的动力学特征荧光强度、运动轨迹、运动速率、扩散系数、平均平方位移膜蛋白（或膜受体）的寡聚体状态单体、二聚体、三聚体和寡聚体膜上的停泊时间（lifetime）胞吞（下膜）或胞吐的动态过程膜蛋白与细胞骨架的实时动态分析获得参数TIRFM的应用91膜蛋白（或膜受体）的动力学特征获得参数TIRFM的应用911、膜蛋白的动力学特征（dynamics）荧光强度（Fluorescenceintensity）

运动轨迹（Trajectory）运动速率（Velocity）扩散系数（Diffusioncoefficient，D）平均平方位移（Meansquaredisplacement，MSD）921、膜蛋白的动力学特征（dynamics）92荧光强度（Fluorescenceintensity）TRII-GFP的TIRFM成像及其荧光强度分析Zhangetal.2009.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.106,15679-1568393荧光强度（Fluorescenceintensity）TR运动轨迹（trajectory）Lietal.2011PlantCell23,3780-3797A．VA-TIRFM图片B．运动轨迹C．MSD对应时间的曲线布朗运动定向运动受限运动混合运动94运动轨迹（trajectory）Lietal.2011运动轨迹与扩散系数UnpublisheddataA．运动轨迹B-F.扩散系数D（μm2/s）95运动轨迹与扩散系数UnpublisheddataA．运动轨

运动速率和扩散系数D.运动速率（μm/s）E-F.扩散系数D（μm2/s）结论：Flot1蛋白运动速率较大，

而扩散系数则较小。Lietal.2012PlantCell24,2105-2122

两个蛋白的动力学参数分析96运动速率和扩散系数D.运动速率（μm/s）Lieta2、膜蛋白的寡聚体状态（Oligomericstate）单体（Monomer）

二聚体（Dimer）三聚体（Trimer）寡聚体（Oligomericstate）972、膜蛋白的寡聚体状态（Oligomericstate）9寡聚体状态（Oligomericstates）

BleachingstepsforEGFPattachedtotandemmultimericconstructsrevealatetramericcomplexofOrai1proteins.Jietal.2008.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.105,13668-1367398寡聚体状态（Oligomericstates）Bleac拟南芥AMT1;3-EGFP的寡聚化

状态分析A.荧光强度的分布(n=200)B.单分子成像C-E.荧光漂白曲线寡聚体状态（Oligomericstates）

Wangetal.2013.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.110,13204-1320999拟南芥AMT1;3-EGFP的寡聚化寡聚体状态（Olig表面停留时间（AMT1;3-EGFP）short-lived(<1s)long-lived(>1s)C.N-sufficientD.N-deprivedWangetal.2013.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.110,13204-132093、膜蛋白在膜上的停泊时间（lifetime）100表面停留时间（AMT1;3-EGFP）C.N-suffi4、胞吞和胞吐作用（endocytosis/exocytosisevents）胞吞作用（Endocytosis）

胞吐作用（Exocytosis）1014、胞吞和胞吐作用（endocytosis/exocyto

高度动态结构

Flot1在进行连续地

胞吞运动Lietal.2012.PlantCell24,2105-2122胞吞作用（endocytosis）102高度动态结构Lietal.2012.PlantCVA-TIRFM双通道分析AP2σ-mCherryCLC-EGFPFanetal.2013.Development140,3826-3837胞吞作用（endocytosis）103VA-TIRFM双通道分析Fanetal.2013.胞吐作用（exocytosisevent）SecretoryvesiclesinlivingpollentubesofP.meyeri.Wangetal.2006.PlantPhysiol.141,1591-1603104胞吐作用（exocytosisevent）Secreto5、膜蛋白与细胞骨架的相互作用分析细胞骨架（Cytoskeleton）

膜蛋白与细胞骨架的相互作用1055、膜蛋白与细胞骨架的相互作用分析105Q&A问答环节

敏而好学，不耻下问。

学问学问，边学边问。

He

is

quick

and

eager

to

learn.

Learning

is

learning

and

asking.106Q&A问答环节

敏而好学，不耻下问。

学问学问，边学边问。

结束语

感谢参与本课程，也感激大家对我们工作的支持与积极的参与。课程后会发放课程满意度评估表，如果对我们课程或者工作有什么建议和意见，也请写在上边点击进入107结束语

点击进入107感谢您的观看与聆听本课件下载后可根据实际情况进行调整108感谢您的观看与聆听本课件下载后可根据实际情况进行调整108细胞质膜

109细胞质膜1标题添加点击此处输入相关文本内容点击此处输入相关文本内容前言点击此处输入相关文本内容标题添加点击此处输入相关文本内容110标题添加点击此处输入相点击此处输入前言点击此处输入标题添加点HarvardUniversityTheInnerLifeoftheCell111HarvardUniversity3第一节细胞质膜的结构模型与基本组分细胞质膜的概念

细胞质膜的结构模型

细胞质膜的基本成分112第一节细胞质膜的结构模型与基本组分细胞质膜的概念4由脂质和蛋白质组成的具有一定结构和生物功能的胞内所有被膜的总称。113由脂质和蛋白质组成的具有一定结构和生物功能的胞内所有被膜的总概念：围绕在细胞最外层，由脂质、蛋白质和糖类组成的

生物膜。功能：作为细胞的界膜，使细胞具有一个相对稳定的内环境；在细胞和环境之间的物质运输、能量转换及信息传递

过程中也起着重要作用。细胞质膜(plasmamembrane)114概念：围绕在细胞最外层，由脂质、蛋白质和糖类组成的细胞质膜一、细胞质膜的结构模型Gorder和Grendel：双层脂分子结构Davson和Danielli：蛋白质-脂质-蛋白质的三明治结构Robertson：单位膜模型Singer和Nicholson：流动镶嵌模型Uptodate：脂筏模型115一、细胞质膜的结构模型Gorder和Grendel：双1895年，E.Overton发现凡是溶于脂肪的物质很容易透过植物的细胞膜，而不溶于脂肪的物质不易透过细胞膜，因此推测细胞膜由连续的脂类物质组成。1.质膜是由脂类物质构成的推测1161895年，E.Overton发现凡是溶于脂肪的物质很容易1925年，E.Gorter和F.Grendel利用有机溶剂抽提人的红细胞质膜的膜脂成分，以便测定膜脂单层分子在水面的铺展面积，发现它是红细胞表面积的二倍，这一结果提示了质膜是由双层脂分子构成。2.质膜是由双层脂分子构成的推测1171925年，E.Gorter和F.Grendel利用有1935年，Davson和Danielli发现质膜的表面张力比油-水界面的表面张力低得多，推测质膜中含有蛋白质成分，并提出“蛋白质-脂质-蛋白质”的三明治式的质膜结构模型。3.“蛋白质-脂质-蛋白质”三明治式质膜结构模型1181935年，Davson和Danielli发现质膜的表面张力4.单位膜模型（unitmembranemodel）1959年，J.D.Robertson利用超薄切片技术获得了清晰的细胞膜照片，显示暗-明-暗三层结构，它由厚约3.5nm的双层脂分子和内外表面各厚约2nm的蛋白质构成，整个膜的厚度约7.5nm。1194.单位膜模型（unitmembranemodel）15.流动镶嵌模型（fluidmosaicmodel）

1972年，S.J.Singer和G.L.Nicholson提出了生物膜的流动镶嵌模型；

细胞膜主要是由磷脂双分子层和镶嵌在其中的蛋白质组成；

膜的流动性和膜蛋白分布的不对称性。1205.流动镶嵌模型（fluidmosaicmodel）6.脂筏模型（lipidraftmodel）1988年，Simons提出脂筏模型；胆固醇和鞘磷脂等富集区域形成相对有序的脂相，如同漂浮在

脂双层上的“竹筏”。1216.脂筏模型（lipidraftmodel）1988年脂筏模型大小为10-200nm，富含胆固醇、鞘磷脂等形成相对有序的脂相。由于鞘磷脂具有较长的饱和脂肪酸链，分子间作用力较强，所以这些区域结构致密是一种动态结构，介于无序液体与液晶之间，称为有序液体（Liquid-ordered，Lo），流动性比非筏区弱。

低温下可耐受非离子去垢剂的抽提，称为抗去垢剂膜

（detergent-resistantmembrane，DRMs）。122脂筏模型大小为10-200nm，富含胆固醇、鞘磷脂等形成植物脂筏的结构示意图

鞘脂类（sphingolipid）固醇类（sterol）BhatandPanstruga.2005.Planta223:5-19123植物脂筏的结构示意图鞘脂类（sphingolipid）B脂质微区脂筏（lipidrafts）质膜微囊（Caveolae）

标记蛋白GPI-anchoredproteincaveolinflotillin

remorinstomatinprohibitinSimonsandIkonen.1997.Nature387:569-572raft124脂质微区SimonsandIkonen.1997.在细胞质膜的脂筏区形成的特异性的内陷微区，亦称为胞膜窖、

小窝。主要存在于高度分化的细胞，在内皮细胞、上皮细胞、皮纤维

细胞、平滑肌细胞、脂肪细胞中尤为丰富。

主要由脂类和蛋白质组成：

脂类成分主要包括胆固醇、鞘糖、鞘磷脂；

蛋白质成分主要包括窖蛋白（caveolin）、脂质锚定蛋白（如GPI锚定蛋白）等，

其中caveolin是caveolae的表面标记蛋白，是构成caveolae的完整膜蛋白，又称为

小窝蛋白。质膜微囊（caveolae）125在细胞质膜的脂筏区形成的特异性的内陷微区，亦称为胞膜窖、质人纤维原细胞的小窝电镜图(65nm)

PartonRG.2001.Science293:2404-2405126人纤维原细胞的小窝电镜图(65nm)PartonRG细胞质膜的结构认知磷脂双分子层是组成细胞质膜的基本结构成分；蛋白分子以不同方式镶嵌在脂双层分子中或结合在其表面，

膜蛋白是赋予细胞质膜功能的主要决定者；细胞质膜可看成是蛋白质在双层脂中的二维溶液；细胞质膜在三维空间上可出现弯曲、折叠、延伸等改变，处于不断的动态变化中。127细胞质膜的结构认知磷脂双分子层是组成细胞质膜的基本结构成分；1.膜脂甘油磷脂(glycerophosphatide)

鞘脂(sphingolipid)

固醇(sterols)二、细胞质膜的基本成分1281.膜脂甘油磷脂(glycerophosphatide甘油磷脂

极性头部非极性尾部甘油骨架和磷酸基团129甘油磷脂

极性头部21极性头部：乙醇胺、胆碱、丝氨酸、肌醇等，为甘油磷脂命名非极性尾部：脂肪酸碳链；多为偶数，16或18个碳原子；饱和脂肪酸和含有1-2个不饱和双键的脂肪酸，双键产生30度左右弯曲，提供质膜的流动性。

甘油骨架和磷酸基团

内质网合成50%以上甘油磷脂

130极性头部：乙醇胺、胆碱、丝氨酸、肌醇等，为甘油磷脂命名甘油磷极性头的空间占位可影响脂双层的曲度PE头较小，更多地分布在脂双层曲率较大的一侧，因此更倾向于形成曲面膜。磷脂酰胆碱（卵磷脂）磷脂酰乙醇胺（脑磷脂）131极性头的空间占位可影响脂双层的曲度PE头较小A.卵磷脂B.鞘磷脂鞘脂

主要在高尔基体合成；

鞘磷脂形成的脂双层的厚度较甘油磷脂的厚度更大，如神经

鞘磷脂为4.6-5.6nm，而卵磷脂约3.5nm。132A.卵磷脂鞘脂

主要在高尔基体合成；24鞘磷脂

非极性尾部：长链脂肪酸，烃链极性头部鞘氨醇骨架和磷酸基团高尔基体合成在脑细胞和神经细胞膜中含量丰富极性头部非极性尾部133鞘磷脂

非极性尾部：长链脂肪酸，烃链极性头部非极性尾部25糖脂非极性尾部：长链脂肪酸，烃链极性头部：糖分子或寡糖链鞘氨醇骨架和磷酸基团约占脂总量的5％以下，在神经细胞膜上糖脂含量较高，约占5-10％。只存在于细胞膜的外表面。134糖脂非极性尾部：长链脂肪酸，烃链26半乳糖脑苷脂神经节苷脂唾液酸糖脂的分类半乳糖脑苷脂：最简单的糖脂，极性头部为半乳糖，在髓鞘的多层膜中含量丰富。神经节苷脂：变化最多、最复杂的糖脂，其头部包含一个或几个唾液酸和糖的残基，是神经元质膜中具有特征性的成分。135半乳糖脑苷脂神经节苷脂唾液酸糖脂的分类半乳糖脑苷脂：最简单的固醇动物细胞和极少数的原核细胞：胆固醇植物细胞：豆固醇和谷固醇真菌和酵母：麦角固醇136固醇动物细胞和极少数的原核细胞：胆固醇28固醇：胆固醇及其类似物含有4个闭环的碳氢化合物，亲水头部为一个羟基(OH)；插入磷脂分子之间，参与细胞膜的形成，调节膜的流动性和通透性；

脂筏的基本结构成分；

生物活性分子的合成前体：固醇类激素、维生素D和胆酸等。137固醇：胆固醇及其类似物含有4个闭环的碳氢化合物，亲水头部膜脂的功能构成膜的基本骨架膜蛋白的溶剂为某些膜蛋白(酶)维持构象、表现活性提供环境138膜脂的功能30脂质体（liposome）一种根据磷脂分子可在水相中形成稳定的脂双层膜现象而制备的人工膜。在水中磷脂分子亲水头部插入水中，脂质体疏水尾部伸向空气，搅动后形成单层或双层脂分子的球形脂质体，直径25~1000nm不等。139脂质体（liposome）一种根据磷脂分子可在水相中形成稳定脂质体的类型水溶液中的磷脂分子团球形脂质体平面脂质体膜140脂质体的类型水溶液中的磷脂分子团32脂质体的应用研究膜脂与膜蛋白及其生物学性质。脂质体中裹入DNA可用于基因转移。在临床治疗中，脂质体作为药物或酶等载体。141脂质体的应用研究膜脂与膜蛋白及其生物学性质。33类型功能去垢剂2.膜蛋白142类型2.膜蛋白34膜蛋白种类繁多；

赋予生物膜重要的生物学功能；50%以上的小分子药物的受体为膜蛋白。143膜蛋白种类繁多；35膜蛋白的类型外在膜蛋白/外周膜蛋白（peripheralprotein）

内在膜蛋白/整合膜蛋白（integralprotein）脂锚定膜蛋白（lipid-anchoredprotein）144膜蛋白的类型外在膜蛋白/外周膜蛋白（periphera

外周膜蛋白

分布在膜表面，水溶性通过离子键或其他较弱的键与膜表面的蛋白或脂分子结合改变溶液的离子强度或者提高温度就可以分离以磷脂为底物的水溶性酶类，如磷脂酶：降解衰老或损伤的生物膜多种蛇毒的活性成分145

外周膜蛋白

37

整合膜蛋白

70%-80%水不溶性以不同的程度嵌入膜内，跨膜蛋白与脂质紧密结合，通过去垢剂才可解离如：盐细菌的质膜蛋白---菌紫红质146整合膜蛋白

38细菌紫红质分子的三维结构1975年，N.Unwin和R.Henderson首次报道了盐细菌的质膜蛋白---菌紫红质的三维结构。它是一个跨膜7次的膜蛋白，通过蛋白质的疏水结构域“镶嵌”在脂双层中，利用光能完成质子的转运。147细菌紫红质分子的三维结构1975年，N.Unwin和R.整合膜蛋白的跨膜结构域与脂双层分子疏水核心相互作用；跨膜结构域两端携带正电荷的氨基酸（Arg+，Lys+）残基与磷脂分子带负电的极性头部形成离子键相互作用；膜蛋白胞质侧半胱氨酸残基（Cys）共价结合到脂肪酸分子上，后者插入脂双分子层。

整合膜蛋白与膜脂结合方式

148整合膜蛋白的跨膜结构域与脂双层分子疏水核心相互作用；G蛋白偶联受体149G蛋白偶联受体41水孔蛋白（aquaporin）具有6个α螺旋区的蛋白家族；通常形成四聚体，以行使其转运水或甘油等分子的功能。150水孔蛋白（aquaporin）具有6个α螺旋区的蛋白家族；4跨膜蛋白既有疏水区域（跨膜区），也有亲水区域（膜表面区）；其结构解析主要应用低温电镜技术和X射线晶体衍射技术。水孔蛋白Glpf3-磷酸甘油转运蛋白

跨膜蛋白与膜脂关系的三维结构解析151跨膜蛋白既有疏水区域（跨膜区），也有亲水区域（膜表面区）；水沈建仁和匡廷云研究团队长期致力于光合膜蛋白结构和功能的研究，经过多年的积累解析出了高等植物PSI-LHCI光合膜蛋白超分子复合物2.8Å的晶体结构。匡廷云院士152沈建仁和匡廷云研究团队长期致力于光合膜蛋白结构和施一公团队首次揭示老年痴呆症致病蛋白精细三维结构（2015年）阿尔茨海默症又称老年痴呆症，是一类神经退行性疾病，临床表现为脑组织切片中出现淀粉样斑块，神经元逐渐死亡，认知和记忆能力受损，大脑功能逐渐丧失，病人逐渐丧失独立生活能力，最后脑功能严重受损直至死亡。美国前总统里根和英国前首相撒切尔夫人都罹患该疾病。此前的研究表明，阿尔茨海默症的发生和大脑中淀粉样斑块的形成密切相关。淀粉样斑块则是由膜整合蛋白酶复合物异常切割“淀粉样前体蛋白”所致。因此，获得γ分泌酶复合物的三维结构是目前世界生命科学领域最热门的研究课题之一。153施一公团队首次揭示老年痴呆症致病蛋白精细三维结构（2015年脂锚定蛋白A.脂肪酸结合到膜蛋白N端的甘氨酸残基上B.15或20个碳链长的烃链结合到膜蛋白C端的半胱氨酸残基上C.通过糖脂锚定在细胞质膜上（糖蛋白）154脂锚定蛋白A.脂肪酸结合到膜蛋白N端的甘氨酸残基上46与磷脂酰肌醇糖脂结合锚定在细胞膜上。GPI：以磷脂酰肌醇（PI）为骨架，一端通过两个脂肪酸链插入到膜脂中，一端与长度不等的寡糖链结合，最后通过寡糖末端的磷脂酰己醇胺与蛋白质共价连接。磷脂酰肌醇糖脂结合蛋白（GPI锚定蛋白）155与磷脂酰肌醇糖脂结合锚定在细胞膜上。磷脂酰肌醇糖脂结合蛋白4糖蛋白

糖与氨基酸的连接，由短的寡糖链与蛋白质共价相连构成的分子；

常作为表面识别信号。156糖蛋白

糖与氨基酸的连接，由短的寡糖链与蛋白质共价相连48膜蛋白的功能转运连接受体酶157膜蛋白的功能转运连接受体酶49去垢剂

一端亲水，一端疏水的两性小分子，分离及研究膜蛋白的常用试剂。插入膜脂，与膜脂或膜蛋白的跨膜结构域等疏水部分结合，形成可溶性微粒。CMC：微团临界浓度（criticalmicelleconcentration），浓度高于或低于CMC时，作用方式和效果不同。158去垢剂

一端亲水，一端疏水的两性小分子，分离及研究膜蛋白的常离子型SDS：与膜蛋白疏水部分结合，使其与膜分离。高浓度破坏蛋白质中的非共价键，使蛋白变性，用于SDS凝胶电泳。非离子型TritonX-100：使细胞膜崩解，对蛋白作用比较温和。用于膜蛋白的分离与纯化，也用于去除细胞的膜系统，以便对细胞骨架蛋白和其他蛋白进行研究。去垢剂

159离子型SDS：去垢剂

51甘油磷脂（glycerophosphatide）

鞘脂（sphingolipid）

固醇（sterols）膜脂膜蛋白双层脂分子结构“蛋白质-脂质-蛋白质”的三明治结构单位膜模型流动镶嵌模型脂筏模型外周膜蛋白（peripheralprotein）整合膜蛋白（integralprotein）脂锚定膜蛋白（lipid-anchoredprotein）小结结构模型

基本成分

细胞质膜160甘油磷脂（glycerophosphatide）膜脂膜蛋第二节细胞质膜基本特征与功能膜的流动性膜的不对称性细胞质膜的基本功能161第二节细胞质膜基本特征与功能532.1膜的流动性膜脂流动性膜蛋白流动性1622.1膜的流动性膜脂流动性54膜脂的流动性侧向扩散运动：同一平面上相邻的脂分子交换位置。旋转运动：围绕与膜平面垂直的轴进行快速旋转。摆动运动：围绕与膜平面垂直的轴进行左右摆动。163膜脂的流动性侧向扩散运动：55膜脂的流动性伸缩震荡运动：脂肪酸链进行伸缩震荡运动。翻转运动：膜脂分子从脂双层的一层翻转到另一层。旋转异构化运动：脂肪酸链围绕C-C键旋转。164膜脂的流动性56影响膜脂流动性的因素脂肪酸链长度：短链，流动性强。脂肪酸链饱和度：不饱和程度高，流动性强。脂分子相变温度：相变温度低，流动性大。鞘磷脂或卵磷脂流动性小，磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇和磷脂酰丝氨酸流动性高。165影响膜脂流动性的因素脂肪酸链长度：57影响膜脂流动性的因素胆固醇的含量：双重作用胆固醇分子与磷脂分子结合：限制膜脂运动。胆固醇分子隔开磷脂分子：增加膜脂流动。其他因素：膜蛋白与膜脂相互作用。温度。酸碱度。离子强度等。166影响膜脂流动性的因素胆固醇的含量：双重作用58膜蛋白的流动性相对静止（immobile）自由扩散（free

diffusion）受限运动（restrictedmovement）向性运动（directedmovement）混合运动（mixedmovement）167膜蛋白的流动性相对静止（immobile）59利用细胞融合技术观察膜蛋白的侧向运动灭活的仙台病毒介导两种细胞融合10min40min168利用细胞融合技术观察膜蛋白的侧向运动灭活的仙台病毒介导两种细成斑成帽现象观察膜蛋白的侧向运动成斑现象（patching）成帽现象（capping）169成斑成帽现象观察膜蛋白的侧向运动成斑现象（patching）荧光漂白恢复技术（FRAP）观察膜蛋白的侧向运动170荧光漂白恢复技术（FRAP）观察膜蛋白的62影响膜蛋白流动的因素温度蛋白质自身的大小与蛋白的相互作用与膜脂的相互作用171影响膜蛋白流动的因素63膜流动性的生理意义质膜的流动性是保证其正常功能的必要条件。当膜的流动性低于一定的阈值时，许多酶的活动和跨膜运输将停止，反之如果流动性过高，又会造成膜的溶解。172膜流动性的生理意义质膜的流动性是保证其正常功能的必要条件。当2.2膜的不对称性

质膜内外两层的组分和功能的差异，称为膜的不对称性。膜脂的不对称性膜蛋白的不对称性糖的不对称性1732.2膜的不对称性

质膜内外两层的组分和功能的差异，称为膜细胞质膜各膜面名称样品经冰冻断裂处理后，细胞膜可从脂双层中央断开，各断面命名为：细胞外表面（extrocytoplasmicsurface,ES）：外小叶细胞外小叶断面（extrocytoplasmicface,EF）原生质表面（protoplasmicsurface,PS）原生质小叶断面（protoplasmicface,PF)：内小叶。174细胞质膜各膜面名称样品经冰冻断裂处理后，细胞膜可从脂双层中央小鼠肝细胞膜冰冻蚀刻175小鼠肝细胞膜冰冻蚀刻67细胞内膜各膜面名称原生质表面（PS）：与细胞质机制接触的膜面细胞外表面（ES）：与囊泡腔中液体接触的膜面在膜泡出芽、转运及融合过程中，其拓扑学结构不变。176细胞内膜各膜面名称原生质表面（PS）：与细胞质机制接触的膜面膜脂的不对称性同一种脂分子在脂双层中呈不均匀分布，与其合成部位相关。膜脂的不对称性还表现在膜表面具有胆固醇和鞘磷脂等形成的微结构域-脂筏。膜脂的不对称性与其生物学功能密切相关。SM：鞘磷脂PC：卵磷脂PS：磷脂酰丝氨酸（血小板）PE：磷脂酰乙醇胺PI：磷脂酰肌醇CI：胆固醇177膜脂的不对称性SM：鞘磷脂69膜蛋白的不对称性每种膜蛋白分子在细胞膜上都具有特定的方向性和分布的区域性。膜蛋白的不对称性在合成时就已经确定，其拓扑学结构始终保持不变。膜蛋白的不对称性是生物膜完成复杂的在时间与空间上有序的各种生理功能的保证。)((HEthyleneBrassinosteroidsPPPCytokinins178膜蛋白的不对称性)((HEthyleneBrassinost糖脂和糖蛋白只分布于细胞膜的外表面。糖蛋白和糖脂的糖基均位于细胞质膜的外侧。糖的不对称性人的ABO血型抗原寡糖链结构的比较179糖脂和糖蛋白只分布于细胞膜的外表面。糖的不对称性人的ABO血膜不对称性的生理意义膜的不对称性导致了膜功能的不对称性和方向性。细胞间的识别、运动、物质运输、信号转导等都具有方向性。180膜不对称性的生理意义膜的不对称性导致了膜功能的不对称性和方向维持稳定的内环境；分隔细胞和细胞器水溶性物质和大分子难以通透选择性地进行物质交换；可调控性高度选择性细胞种类的特异性吸收与分泌提供生化识别与反应的场所；酶促反应免疫识别等与外界保持信息交流；激素识别受体-配体反应等细胞识别（免疫等）运动性：温度等环境因素的影响信号传递和物质交换细胞质膜的基本功能脂双层膜（磷脂，固醇）膜蛋白脂双层膜（磷脂，固醇）膜蛋白（受体）糖脂，糖蛋白等脂双层膜（磷脂，固醇）脂筏膜蛋白（受体）等181维持稳定的内环境；细胞质膜的基本功能脂双层膜（磷脂，固醇）细胞质膜的生物功能边界与通透性屏障组织和功能定位运输作用信号检测细胞间通讯182细胞质膜的生物功能边界与通透性屏障74举例：质膜蛋白的定位和功能研究---GFP融合表达蛋白设计引物，扩增基因（PCR）构建GFP融合表达载体（质粒）转化拟南芥转基因植株的鉴定183举例：质膜蛋白的定位和功能研究设计引物，扩增基因（PCR）7转基因植株的鉴定PCRRT-PCRWestern184转基因植株的鉴定PCRRT-PCRWestern76PCR鉴定以筛选出的苗子DNA为模板，用载体上的一个引物与目的基因上的一个引物进行PCR扩增，根据扩增条带的大来判断是否是阳性植株。185PCR鉴定77RT-PCR以单链的mRNA为模板逆转录生成双链的cDNA，再以此cDNA为模板用引物进行PCR扩增，根据扩增产物的量对原初mRNA的含量进行半定量。186RT-PCR78RT-PCRInterestedGeneLoadingControlWT

KDOECOM

RNA样品定量和参照基因扩增保证样品

中mRNA含量的一致性

调整扩增循环数以区分差异187RT-PCRInterestedGeneWTKWestern通过特异性抗体对凝胶电泳分离后的蛋白样品进行着色。通过分析着色部位的分子量大小和着色深度获知特定蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达情况。188Western通过特异性抗体对凝胶电泳分离后的蛋白样品进行着WesternInterestedProteinLoadingControlWT

KOCOMOE

蛋白样品定量和参照蛋白杂交保证样品

中蛋白含量的一致性

调整曝光时间以区分差异189WesternInterestedProteinWT荧光显微镜（FluorescenceMicroscope）特异性标记并观察目标（生物大分子，信号物质等）。利用生物物质的自发荧光或标记荧光。Nikon公司公开材料190荧光显微镜（FluorescenceMicroscope激光扫描共聚焦显微镜技术（LaserScanningConfocalMicroscopy）北京林业大学实验中心，LeicaSP5激光共聚焦显微镜191激光扫描共聚焦显微镜技术北京林业大学实验中心，LeicaS普通荧光显微镜与共聚焦显微镜的比较分辨率提高1.4-1.7倍小鼠肾小球细胞192普通荧光显微镜与共聚焦显微镜的比较分辨率提高1.4-1.7倍实例利用激光共聚焦显微镜进行的双通道扫描李瑞丽….林金星(2012)PlantCell193实例利用激光共聚焦显微镜进行的双通道扫描李瑞丽….林金星实例微丝（FABD2-GFP）微管（Tubulin-mCheery）194实例微丝（FABD2-GFP）微管（Tubulin-mChe

当光从高折射率(n1)的介质入射到低折射率(n2)的介质时，一部分发生反射，另一部分则会在介质的交界处发生折射进入低折射率介质。当入射角大到一定程度时，光不再折射到低折射率的介质里，而是发生全反射。实际上，由于光的波动效应，有一部分光的能量会穿过界面渗透到介质2中，平行于界面传播。这部分波就是所谓的隐失波，因此全内反射荧光显微术也通常被称为隐失波显微术。全内反射荧光显微术(totalinternalreflectionfluorescencemicroscopy,TIRFM)195当光从高折射率(n1)的介质入射到低折射率TIRFM的优点优点：较高信噪比S/N=35成像速度快200帧/s较小的光漂白和光损伤

利用全内反射产生的隐失波照明样品，

使照明区域限定在样品表面100-400nm范围内，可以实现对细胞膜表面的单个

分子进行活体观测。196TIRFM的优点优点：利用全内反射产生的隐失波照明样品，TIRFM的优