温度对发酵的影响

温度对发酵的影响影响产物生成速率和产率.温度越高，酶反应速度越快，微生物细胞生长代谢加快，产物提前生成。改变发酵液的物理性质而间接影响发酵.改变培养液的物理性质会影响到微生物细胞的生长。例如，温度通过影响氧在培养液中的溶解、传递速度等，进而影响发酵过程。影响生物合成的方向：金色链霉菌的四环素发酵中，在低于30°C主要合成金霉素，温度达35C则只产四环素。通过改变酶的调节机制实现。影响酶系组成及酶的特性：温度越高，酶反应速度越快，微生物细胞生长代谢加快，产物提前生成。但温度升高，酶的失活也越快，表现出微生物细胞容易衰老，使发酵周期缩短，从而影响发酵过程最终产物的产量。同一种生产菌，菌体生长和积累代谢产物的最适温度也往往不同。最适温度：最适于菌的生长或发酵产物生成的温度。如谷氨酸菌的生长最适温度为30C-32C，产谷氨酸的最适温度为34C-37C。pH值对发酵的影响发酵液pH的改变将对发酵产生很大的影响。改变细胞膜的电荷性质，影响新陈代谢的正常进行。原生质体膜具有胶体性质，在一定pH时原生质体膜可以带正电荷，而在另一pH值时，原生质体膜则带负电荷。这种电荷的改变同时会引起原生质体膜对个别离子渗透性的改变，从而影响微生物对培养基中营养物质的吸收及代谢产物的分泌，妨碍新陈代谢的正常进行。如产黄青霉的细胞壁厚度随pH的增加而减小，其菌丝的直径在pH6.0时为2〜3um，在pH7.4时，则为2〜1.8um，呈膨胀酵母状细胞，随pH下降菌丝形状可恢复正常。影响菌体代谢方向。培养液的pH对微生物的代谢有更直接的影响。在产气杆菌中，与毗咯并喹吟醍(PQQ)结合的葡萄糖脱氢酶受培养液pH影响很大。在钾营养限制性培养基中，pH8.O时不产生葡萄糖酸，而在pH5.0〜5.5时产生的葡糖酸和2-酮葡萄糖酸最多。此外，在硫或氨营养限制性的培养基中，此菌生长在pH5.5下产生葡萄酸与2-酮葡萄酸，但在pH6.8时不产生这些化合物。发酵过程中在不同pH范围内以恒定速率(0.055%/h)加糖，青霉素产量和糖耗并不一样，见表8—4。表8—4在不同pH范围内恒定速率加糖，青霉素产量和糖耗的关系pH范围糖耗残糖PenG相对单位pH范围糖耗残糖PenG相对单位pH6.。〜6.3加糖10%0.5%较高pH7.3〜7.67%>0.5%低pH6.6〜6.9加糖7%0.2%高pH6.8控制加糖<7%<0.2%最高影响代谢产物合成。如采用基因工程菌毕赤酵母生产重组人血清白蛋白，生产过程中最不希望产生蛋白酶。在pH5.0以下，蛋白酶的活性迅速上升，对白蛋白的生产很不利；而pH在5.6以上则蛋白酶活性很低，可避免白蛋白的损失。不仅如此，pH的变化还会影响菌体中的各种酶活以及菌体对基质的利用速率，从而影响菌体的生长和产物的合成。故在工业发酵中维持生长和产物合成的最适pH是生产成败的关键之一。co2对发酵的影响CO2可作为重要的基质。如在以氨甲酰磷酸为前体之一的精氨酸的合成过程中，无机化能营养菌能以CO2作为唯一的碳源加以利用。异养菌在需要时可利用补给反应来固定CO2,细胞本身的代谢途径通常能满足这一需要。若发酵前期大量通气，可能出现CO2减少，导致这种异养菌延迟期延长。溶解在发酵液中的CO对氨基酸、抗生素等发酵有抑制或刺激作用。大多数微生物2适应低含量CO2(0.02%〜0.04%)。当尾气CO2含量高于4%时，微生物的糖代谢与呼吸速率下降；当吐分压为0.08X105Pa时，青霉素比合成速率降低40%。又如发酵液中溶解C02为0.0016%时会强烈抑制酵母的生长。当进气C02含量占混合气体流量的80%时，酵母活力只有对照值的80%。在充分供氧条件下，即使细胞的最大摄氧率得到满足，发酵液中的C02浓度对精氨酸和组氨酸发酵仍有影响。组氨酸发酵中C02分压大于0.05X10sPa时，其产量随C02分压的提高而下降。精氨酸发酵中有一最适C02分压，即1.25X105Pa，高于此值对精氨酸合成有较大影响。因此，即使供氧已足够但应考虑通气量，以控制发酵液中的co2含量。C02抑对氨基糖苷类抗生素如紫苏霉素的合成也有影响。当进气中的C02含量为1%和2%时，紫苏霉素的产量分别为对照组的2/3和1/7。C02对细胞的作用机制溶解于培养液中的co2主要作用在细胞膜的脂溶性部位，而co2溶解于水后形成的HC03-则影响细胞膜上的膜磷脂、膜蛋白质等亲水性部位。当细胞膜的脂质相中co2浓度达一临界值时，使膜的流动性及表面电荷密度发生变化，这将导致许多基质的跨膜运输受阻，影响了细胞膜的运输效率，使细胞处于“麻醉”状态，细胞生长受到抑制，形态发生了变化。为了排除co2的影响，工业生产中需要综合考虑发酵液的温度、通气状况和co2在发酵液中的溶解度。用呼吸商RQ表示：RQ=CER/OUR=Qc"X/Qo2*X式中：CER——C02释放率0UR——菌耗氧速率Qo2——呼吸强度mol/(g.h)Qco2比释放速率mol/(g.h)X菌体干重g/L发酵过程中尾气02含量的变化恰与C02含量的变化成反向同步关系，由此可判断菌的生长、呼吸情况，求得菌的呼吸商RQ值。3、呼吸商与发酵的关系RQ可以反映菌的代谢情况：如酵母发酵过程RQ=1，表示糖代谢走有氧分解代谢途径，仅生成菌体，无产物形成；RQ>1.1，表示走EMP途径，生成乙醇.菌在利用不同基质时，RQ值也不相同.如大肠杆菌发酵,丙酮酸RQ=1.26,葡萄糖RQ=1.02在抗生素发酵的不同阶段，RQ值也不相同:菌体生长RQ=0.909,菌体维持RQ=1,青霉素合成RQ=4基质浓度对发酵的影响（1）momod模型u=u*S/（Ks+S）式中：u比生长速率umax最大的比生长速率S——基质浓度Ks——饱和常数，是在u=0.5Umax时的基质浓度解释P148图9-34（2）、基质浓度对发酵的影响1）高浓度基质制菌体生长和产物形成：主要是通过高渗压脱水、酶中毒、分解代谢物阻遏作用实现的。2）培养基过于丰富，菌体生长过盛，对产物合成不利。染菌的主要途径1）种子带菌2）无菌空气带菌3）操作不当4）培养基和设备灭菌不彻底5）冷却管等设备渗滤6）泡沫外溢杂菌污染的预防1）杜绝种子染菌强无菌室管理、严格接种的无菌操作、定期取样无菌检验。2）消灭设备和管道死角检查设备消除死角、发酵罐每使用一次应彻底洗刷一次。3）防止设备渗漏经常检查，按时更换和修理4）加强空气净化，防止空气带菌减少进口空气中的含菌数、加强对空气的除油除水保证介质过滤的高效率、合理设计过滤器、按要求装填过滤介质、定期检查分过滤器。发酵产物的提取与精制过程一般包括如下四个阶段：（1）发酵液的预处理即去除细胞及不溶性物质，主要单元操作方法是离心和过滤。此阶段产品浓度和质量仅有少量改善，其主要任务是去除发酵液中的固体物质，为后续阶段提供澄清、洁净的原料液。（2）产品的提取主要单元操作方法有萃取、吸附、沉淀、蒸发等典型方法。此阶殷主要任务是去除与目的产物有较大差异的物质以提高产品浓度，而提高产品质量为辅。（3）产品的精制主要单元操作方法有层析法、膜分离法、离子交换法、沉淀法、电泳法等。此阶段的主要任务是去除与目的产物有类似化学性质和物理性质的杂质，使产物的纯度有较大程度的提高。（4）产品的最后加工主要单元操作方法有结晶、干燥、蒸馏等。最终产品的使用要求决定了此阶段可采用的方法。提取与精制的工艺流程从该程序可见，各种发酵醪特性不同，含菌体不同，发酵产物的化学结构和物理性质不同，提取和精制的方法的选择也不同。对于某些发酵产品，在提取和精制过程中要注意防止变性和降解现象的发生。例如，酶制剂、抗生素、单细胞蛋白、氨基酸及核酸等，由于其大分子空间结构主要依靠氢键、盐键和范德华引力而形成，过酸、过碱、高温、剧烈的机械作用、强烈的辐射等都可能导致大分子活性的丧失和不稳定。因此，在提取和精制过程中要注意避免pH值过高或过低，避免高温、剧烈搅拌而产生大量泡沫，避免和重金属离子及其他蛋白质变性剂接触。有必要用有机溶剂处理的，必须在低温下，短时间内进行。有些酶以金属离子或小分子有机化合物为辅基，在进行提取和精制时，要防止这些辅基的流失。此外，在发酵液中，除所需要的酶以外，常常还同时存在蛋白酶，为防止发酵醪中所需的酶被蛋白酶分解，要及早除去蛋白酶或使其失活。生产效率又称发酵速率，是指单位操作时问、单位发酵体积所产生的发酵产物量，它是评价发酵生产的主要指标之一。生产效率有如下两种表示方法：发酵过程的生产速率和发酵设备的生产能力。发酵液中的产物浓度一般以g/L表示，也有用质量百分比表示的，对于活性物质产品，则常采用活性单位，称为发酵单位或发酵效价，以U/mL表示.发酵产物浓度在一定情况下可以代表菌种和发酵水平的高低，如酶试剂、抗生素等基质转化率是指发酵工艺中所使用的主要基质（一般指碳源或其他成本较高的基质）转化为发酵产物的得率，常以g/kg或%表示。对于微生物代谢产物的发酵，基质转化率通常是指发酵使用的碳源转化为目的产物的得率。对于细胞产品，则指碳源合成细胞的得率。对于生物转化产品，基质转化率表示前体物质转化为产物的得率。对于活性物质产品，基质转化率的含义中还必须包括活力单位。基质转化率是原材料成本效益的指示值以好氧发酵产品为例，试述生产工艺流程和工艺控制要点谷氨酸发酵生产工艺（一）、工艺流程淀粉-一糖液-一发酵-一提取-一精制-一包装-一成品■菌种（二）、操作要点1、淀粉水解糖的制备（1）酸水解工艺流程原料（淀粉、水、盐酸）一调浆（调浆）一糖化一冷却一中和、脱色一过滤一糖液（2）工艺要点1）调浆：淀粉乳浓度为10—11。波美，用盐酸调pH值1.5左右。2）糖化：在糖化锅内进行，直接蒸汽加热，压力（表压）控制29.34*104—34.43*104Pa，时间为25min。3）冷却：将糖化醪温度控制在80°C以下。4）中和：用烧碱配成一定浓度调pH值4.0—5.0左右，使糖液中蛋白质和其它胶体物质沉淀析出。5）脱色：用粉末活性炭脱色，用量为淀粉原料的0.6%--0.8%，在70C及酸性条件下进行搅拌脱色6）过滤：过滤温度控制在45--60C。2、菌种的扩大培养（1）工艺流程菌种斜面培养一级种子培养二级种子培养发酵(2)工艺要点1)菌种：我国生产谷氨酸的菌种有北京棒状杆菌AS1229、钝齿棒状杆菌AS1542、HU7251及7338、B9、T6-13、672等。斜面培养：A、培养基：葡萄糖0.1%、牛肉膏1%、蛋白胨1%、氯化钠0.5%、琼脂2%，40%氢氧化钠溶液调pH7.0—7.2；B、装试管：传代用斜面每支18*180试管装约10毫升，生产用斜面每支25*200毫升装约25毫升；C、灭菌：120°C,30min，取出冷至45°C摊成斜面，凝固后入培养箱32--34°C培养48h，经检验无杂菌后包扎备用；D、经分离复壮、活化至第三代的斜面菌种，在无菌操作下移种(1支接10支左右)，于32--34C培养22--24h。一级种子培养A、培养基：葡萄糖2.5%、尿素0.5%、硫酸镁0.04%、磷酸氢二钾0.1%、硫酸亚铁2ppm、硫酸锰2ppm、玉米浆3%--3.5%，40%氢氧化钠溶液调pH7.0—7.2；B、装三角瓶：1000毫升三角瓶液量约200毫升，瓶口包扎要紧；C、灭菌：120C，30min；D、接种培养：一支斜面菌接5瓶，34C恒温振荡培养，T6-13菌培养10.5h,7338菌培养12h；E、质量标准：种龄11--12h、pH6.4±0.1、OD净增0.5以上、残糖0.5%以下、无杂菌和噬菌体，镜检菌体生长均匀、粗壮、排列整齐、革兰氏阳性反应。二级种子培养：A、接种培养：培养基与一级相似，主要区别在于用水解糖代替葡萄糖，一般于32C下进行通气培养7--10h；B、质量标准：种龄7--10h、pH7.2左右、OD净增0.5左右、残糖消耗1%左右、无杂菌和噬菌体，镜检菌体生长旺盛、排列整齐、革兰氏阳性反应，活菌数为每毫升含108—109个细胞。3、谷氨酸发酵发酵过程中代谢变化以P216图25—6为例说明。初期：菌体生长的迟滞期，糖基本没有利用，pH因尿素分解有所上升，一般为2--4h；对数生长期：主要是菌体生长，耗糖快，pH先升后降，溶氧急剧下降后维持在一定水平上，菌体浓度(OD)迅速增大。操作时通过流加尿素以供给氮源和调pH7.5—8.0，控温在30--32C；谷氨酸合成期：微生物利用糖与尿素分解后产生的a-酮戊二酸和氨合成谷氨酸。流加尿素控制pH7.2—7.4,加大通风，提高发酵温度至34--37°C；发酵后期：当营养耗尽酸不再增加时，应及时放罐，发酵周期一般为30多小时。4、谷氨酸提取提取方法一般有等电点法、离子交换法、金属盐沉淀法、盐酸盐法和电渗析法及其组合法，以等电点法为例讲述其工艺流程：发酵液I起晶中和点PH4—4.5I20。波美盐酸育晶2hI等电搅拌PH3—3.22I静置沉淀4—6hI一母液菌体及细小GA——离心分离谷氨酸等电点法提取谷氨酸工艺流程工艺控制要点：温度pH溶解氧二氧化碳和呼吸商基质浓度泡沫对发酵的影响与控制发酵过程中pH值的变化规律(1)不同生长阶段的pH值1)生长阶段：pH值有上升或下降的趋势2)生产阶段：pH值趋于稳定3)自溶阶段：pH值有上升的趋势(2)引起pH值变化的原因1)pH值上升的原因A、培养基中C/N偏低B、生理碱性物质存在，如硝酸钠C、中间补料中氨水或尿素等碱性物质加入过量2)pH值下降的原因A、培养基中C/N偏高B、生理酸性物质存在，如硫酸铵C、消泡油加入过量1、温度对微生物发酵有何影响？2、pH值影响发酵的机理是什么？3、CO2对细胞作用的机理是什么？4、名词解释：呼吸商、产物浓度、生产效