血清球蛋白的分离纯化与鉴定

关于血清球蛋白的分离纯化与鉴定第1页，共27页，2022年，5月20日，5点32分，星期六一、目的和要求学习盐析法分离血清蛋白的原理和技术掌握凝胶过滤层析法脱盐的基本操作技术掌握用醋酸纤维膜电泳法分离血清蛋白的原理及方法第2页，共27页，2022年，5月20日，5点32分，星期六二、原理（一）盐析1.概念和原理盐析是指溶液中加入无机盐类而使某种物质溶解度降低而析出的过程。

蛋白质在纯水中溶解度较低，若稍加一些无机盐则溶解度增加，这种现象称为“盐溶”(saltin)。而当盐浓度继续增加到某一浓度时，蛋白质又变得不溶而自动析出，这种现象称为“盐析”(saltout)。

第3页，共27页，2022年，5月20日，5点32分，星期六“盐析”破坏了蛋白质作为亲水胶体的两个稳定因素但当盐浓度增加到一定浓度时，一方面大量的水同盐分子结合，使得蛋白质没有足够的水维持溶解状态，破坏了维持蛋白质亲水胶的水化膜另一方面加入的盐离子中和了蛋白质分子相互排斥的电荷相互聚集沉淀出来表面电荷水化膜第4页，共27页，2022年，5月20日，5点32分，星期六2.常用中性盐：盐析可用硫酸钠、氯化钠、磷酸钠和硫酸铵等中性盐，其中运用最广的是硫酸铵。硫酸铵的优点

1.在水中化学性质稳定，2.溶解度大，3.溶解度的温度系数变化较小，4.硫酸铵价廉易得，分离效果好，5.性质温和，高浓度时也不会影响蛋白质的生物学活性。第5页，共27页，2022年，5月20日，5点32分，星期六3.盐浓度计算各种蛋白质“盐析”出来所需的盐浓度各异，所需的最小盐量称做盐析浓度。A，GAG↓半饱和(NH4)2SO4饱和(NH4)2SO4A↓血清中清蛋白和球蛋白的分离按体积：

12（50%）；

14（25%）第6页，共27页，2022年，5月20日，5点32分，星期六(1)饱和硫酸铵溶液法

将饱和硫酸铵溶液的饱和度定为100%或1按体积：

12（50%）；

14（25%）(2)固体硫酸铵法可采用直接加入固体硫酸铵的方法。硫酸铵饱和度的计算第7页，共27页，2022年，5月20日，5点32分，星期六离心力(F)等于被离心的物体质量与向心加速度的乘积向心加速度=4π2V2r

（其中V为每秒的转数，r为离心半径，单位cm）

F=m

4π2V2r相对向心加速度=4π2V2rg多少个g（二）离心(centrifugation)----分离1.离心力第8页，共27页，2022年，5月20日，5点32分，星期六2.离心机分类根据离心机的转数分类可以分为三类

①<5000rpm普通离心机②5,000-25,000rpm高速离心机③25,000-10,000rpm超速离心机因离心时与空气摩擦产热很多，所以高速离心机有制冷装置超速离心机不但有制冷装置，而且离心室密封真空第9页，共27页，2022年，5月20日，5点32分，星期六3.离心机的使用0.1g50g2000rpmr=12cm配平

在对称位置重量一致Balancedloadingpatternsfora12-positoncentrifugerotor第10页，共27页，2022年，5月20日，5点32分，星期六三、操作2ml血清+2mlPBS逐滴加入饱和(NH4)2SO42ml2→6ml33%弃上清，2mlPBS+1ml饱和(NH4)2SO4

1→3ml33%弃上清，1mlPBS+0.5ml饱和(NH4)2SO4

0.5→1.5ml33%弃上清，洗涤0.5mlPBS溶解↓摇匀

↓

混匀静置30min，离心3000rpm10min↓

↓

混匀静置30min，离心3000rpm10min↓

混匀静置30min，离心3000rpm10min第11页，共27页，2022年，5月20日，5点32分，星期六层析利用物质在固定相（stationaryphase）与流动相（mobilephase）之间不同的分配比例，达到分离待测物质的技术。

(三)层析(chromatography)---纯化凝胶过滤层析法（gelfiltrationchromatography）离子交换层析法（ionexchangechromatography）亲和层析法（affinitychromatography）第12页，共27页，2022年，5月20日，5点32分，星期六凝胶过滤层析法（gelfiltrationchromatography）第13页，共27页，2022年，5月20日，5点32分，星期六葡聚糖凝胶（Sephadex）第14页，共27页，2022年，5月20日，5点32分，星期六离子交换层析法（ionexchangechromatography）第15页，共27页，2022年，5月20日，5点32分，星期六亲和层析法（affinitychromatography）第16页，共27页，2022年，5月20日，5点32分，星期六脱盐常用透析法和凝胶过滤层析法前者的优点是透析后样品终体积较小，但所需时间较长，且盐不易除尽凝胶过滤法则能将盐除尽，所需时间也明显缩短，但其凝胶过滤后样品体积较大。本实验中样品体积较小，凝胶过滤后样品体积不会太增加，所以选用凝胶过滤法。第17页，共27页，2022年，5月20日，5点32分，星期六透析(dialysis)第18页，共27页，2022年，5月20日，5点32分，星期六凝胶过滤层析法（gelfiltrationchromatography）第19页，共27页，2022年，5月20日，5点32分，星期六按流出的时间收集不同组分第20页，共27页，2022年，5月20日，5点32分，星期六结果12345678910proteinNH4+11121314151617181920proteinNH4+-

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±++

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第21页，共27页，2022年，5月20日，5点32分，星期六(四)电泳(electrophoresis)---鉴定带电粒子在电场中移动的现象称为电泳血清蛋白包括多种蛋白质，它们的等电点大都在pH7.0以下，清蛋白的等电点为4.6，球蛋白为5-7在PH高于它们等电点的缓冲液均带负电荷，在电场中向正极移动由于各种蛋白质所带电荷的数量和分子的大小有差别，在电场中泳动的速度也不同第22页，共27页，2022年，5月20日，5点32分，星期六血清中清蛋白电荷数量较多，分子量小，泳动最快。γ球蛋白则相反，泳动最慢，适当的时间电泳后，不同的蛋白泳动到不同的位置。Albuminα1α2βγ+-血清样品电泳法可以将血清蛋白质分成多条区带

第23页，共27页，2022年，5月20日，5点32分，星期六原理

1.蛋白的分离2.纯化3.鉴定

利用醋酸纤维薄膜为支持物可将血清蛋白分开，经染色可显示五条区带，从正极端起，依次为清蛋白、α1球蛋白、α2球蛋白、β球蛋白、γ球蛋白。第24页，共27页，2022年，5月20日，5点32分，星期六操作方法一、仪器和薄膜的准备1．将醋酸纤维薄膜浸泡于TEB缓冲液中，一小时以上备用。2．在电泳槽内加TEB缓冲液每槽100ml（视槽的大小而定）。放置