高中生物选修一基因工程的基本操作程序优选ppt资料

高中生物选修一基因工程(jīyīngōngchéng)的基本操作程序第一页，共48页。基因工程(jīyīngōngchéng)的基本操作程序目的基因(jīyīn)的获取基因表达(biǎodá)载体的构建将目的基因导入受体细胞操作过程目的基因的检测与鉴定2022/11/302第二页，共48页。什么(shénme)叫基因？基因－－有遗传效应(xiàoyìng)的DNA片段。什么(shénme)叫遗传效应？

遗传效应－－能转录为mRNA，继而翻译为蛋白质；能转录为核糖体RNA；能转录为转运RNA。第三页，共48页。原核细胞的基因(jīyīn)结构编码(biānmǎ)区非编码(biānmǎ)区非编码区编码区上游编码区下游调控遗传信息的表达(调控序列)转录RNA(编码序列)第四页，共48页。编码区非编码区(下游)非编码区（上游）(与RNA聚合酶结合位点)启动子(转录终止标记)终止子原核细胞的基因(jīyīn)结构转录RNA(编码序列)第五页，共48页。RNA聚合酶能够识别调控序列中的结合(jiéhé)位点，并与其结合(jiéhé)。转录开始(kāishǐ)后，RNA聚合酶沿DNA分子移动，并以DNA分子的一条链为模板合成RNA。转录(zhuǎnlù)完毕后，RNA链释放出来，紧接着RNA聚合酶也从DNA模板链上脱落下来。启动子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质.终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录RNA聚合酶:能够识别启动子上结合位点的一种蛋白质.第六页，共48页。编码(biānmǎ)区非编码(biānmǎ)区非编码(biānmǎ)区外显子(能编码蛋白质)启动子内含子(不能编码蛋白质)真核细胞的基因结构上游终止子下游真核细胞的一个基因的编码区转录出mRNA，需把其中的内含子切除，外显子拼接成成熟mRNA。(结构基因)第七页，共48页。③启动子、终止子对于目的基因表达必不可少(与RNA聚合酶结合位点)第四十四页，共48页。②原理(yuánlǐ)：__________DNA分子(fēnzǐ)杂交技术过程详解——(即目的(mùdì)基因)检测转基因生物的染色体DNA上是否(shìfǒu)插入了目的基因基因文库的构建(ɡòujiàn)方法第五步，将抗体（一抗）与硝酸纤维素膜上的蛋白杂交，这时抗体（一抗）与目的基因表达的蛋白（抗原）会特异结合。——感受态细胞吸收DNA分子第二十三页，共48页。②要加趋化和诱导的物质(wùzhì)，一般为乙酰丁香酮等，目的是使农杆菌向植物组织的受伤部位靠拢（趋化性）和激活农杆菌的Vir区（诱导）的基因，使T-DNA转移并插入到染色体DNA上。(三)将目的(mùdì)基因导入受体细胞用上述探针和转基因生物的mRNA杂交,若出现杂交带,表明目的基因转录出了mRNA需把其中的内含子切除，外显子拼接成成熟mRNA。(三)将目的基因导入受体细胞真核细胞的基因(jīyīn)结构编码(biānmǎ)区非编码(biānmǎ)区外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列：有调控作用的核苷酸序列，包括位于编码区上游的RNA

聚合酶结合位点（启动子）。非编码序列：包括非编码区和内含子第八页，共48页。获得目的(mùdì)基因的方法从基因文库中获取目的(mùdì)基因（1）什么是基因文库？（2）怎样从基因文库中得到我们(wǒmen)所需的目的基因？种类：基因组文库：部分基因文库：(如cDNA文库)利用PCR技术扩增目的基因人工合成

含有一种生物的全部基因含有一种生物的部分基因未知序列基因较小已知序列已知序列2022/11/309第九页，共48页。提取(tíqǔ)某种生物的全部DNA用适当(shìdàng)的限制酶切一定大小(dàxiǎo)的DNA片段将DNA片段与载体连接导入受体菌中储存基因组文库（1）直接分离法(鸟枪法)1.构建基因文库——将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。第十页，共48页。某种生物(shēngwù)的单链mRNA单链互补(hùbǔ)DNA双链cDNA片段(piànduàn)导入受体菌中储存与载体连接cDNA文库反转录酶DNA聚合酶（2）反转录法：cDNA的合成流程图解第十一页，共48页。cDNA合成(héchéng)过程第一步，反转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA单链，形成RNA-DNA杂交分子(fēnzǐ)。第二步，核酸酶H使RNA-DNA杂交分子(fēnzǐ)中的RNA链降解，使之变成单链的DNA。第三步，以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子(fēnzǐ)。2022/11/3012第十二页，共48页。依据：目的基因的有关(yǒuguān)信息。如：根据(gēnjù)基因(jīyīn)的核苷酸序列基因(jīyīn)的功能、基因(jīyīn)在染色体上的位置基因(jīyīn)的转录产物mRNA基因(jīyīn)的表达产物蛋白质等特性。2．如何从基因文库中得到所需要的基因？2022/11/3013第十三页，共48页。基因组文库：一般针对原核生物的基因，因为基因少部分基因文库：一般针对真核生物的基因，如cDNA文库文库类型cDNA文库基因组文库文库大小小大基因中启动子无有基因中内含子无有基因多少某种生物的部分基因某种生物的全部基因物种之间的基因交流可以部分基因可以说明基因文库的组建过程就包含基因工程的基本操作步骤。从基因文库中获取目的基因的优点是操作简便，缺点是工作量大，具有一定的盲目性.基因文库的构建(ɡòujiàn)方法2022/11/3014第十四页，共48页。利用(lìyòng)PCR技术扩增目的基因2022/11/3015山西省孝义市第二(dìèr)中学第十五页，共48页。①概念(gàiniàn)：PCR全称为_______________，是一项在生物____复制___________的核酸合成技术③条件(tiáojiàn)：_______________________、_______________、___________、___________.前提条件(tiáojiàn)：②原理(yuánlǐ)：__________④方式：以_____方式扩增，即____（n为扩增循环的次数）⑤结果：选修3P10聚合酶链式反应体外特定DNA片段DNA双链复制已知基因的核苷酸序列四种脱氧核苷酸一对引物DNA聚合酶指数2n使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增利用PCR技术扩增目的基因2022/11/3016第十六页，共48页。⑥过程(guòchéng)：a、DNA变性(biànxìng)（90℃-95℃）：双链DNA模板在热作用下，_____断裂，形成___________b、退火（复性55℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成(xíngchéng)局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，从引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补的________。氢键单链DNA双链DNA链2022/11/3017PCR扩增仪第十七页，共48页。2022/11/3018第十八页，共48页。PCR技术DNA复制过程DNA变性（90～95℃）→退火（复性55~60℃）→子链延伸（70~75℃）→重复循环DNA复制起始，RNA引物形成→DNA片段生成→RNA引物水解→完整的DNA分子形成相同点原则碱基互补配对条件模板、原料（dCTP、dATP、dGTP、dTTP）、能量、酶、引物等不同点解旋方式氢键在高温下断裂，双链全部解开解旋酶催化氢键逐步断裂场所体外主要在细胞核中引物DNARNA酶热稳定DNA聚合酶（Taq酶）解旋酶、DNA聚合酶、DNA连接酶等结果在短时间内形成大量的DNA片段形成完整的DNA分子利用PCR技术扩增目的(mùdì)基因2022/11/3019第十九页，共48页。目的(mùdì)基因的mRNA单链DNA(cDNA）双链DNA(即目的(mùdì)基因)反转录(zhuǎnlù)合成1）反转录法：

以目的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基因。蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列目的基因推测推测化学合成2）根据已知的氨基酸序列合成DNA法：2022/11/3020人工合成的目的基因第二十页，共48页。2022/11/3021第二十一页，共48页。——基因工程(jīyīngōngchéng)的核心1、目的(mùdì)：使目的基因在受体细胞中稳定存在(cúnzài)，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。(二)基因表达载体的构建第二十二页，共48页。2、基因(jīyīn)表达载体的组成：复制原点+目的基因(jīyīn)+启动子+终止子+标记基因(jīyīn)它们各自的作用(zuòyòng)是什么?第二十三页，共48页。启动子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录标记基因的作用是为了鉴别受体细胞(xìbāo)中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞(xìbāo)筛选出来第二十四页，共48页。①载体与表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构②用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又用到DNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键③启动子、终止子对于目的基因表达必不可少④目的基因不能单独(dāndú)进入受体细胞，必需以表达载体的方式携带进去。注意(zhùyì)第二十五页，共48页。(三)将目的(mùdì)基因导入受体细胞常用(chánɡyònɡ)的受体细胞：动植物细胞、大肠杆菌(dàchánɡɡǎnjūn)、土壤农杆菌、枯草杆菌等。将目的基因导入受体细胞的原理：借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。转化——目的基因进入_________内，并且在受体细胞内维持_____和_____的过程受体细胞稳定表达2022/11/3026第二十六页，共48页。方法(fāngfǎ)导入植物(zhíwù)细胞导入动物细胞导入微生物细胞(xìbāo)农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法——显微注射法——

感受态细胞吸收DNA分子(三)将目的基因导入受体细胞2022/11/3027第二十七页，共48页。1、将目的基因导入植物细胞的方法：（1）农杆菌(gǎnjūn)转化法①农杆菌(gǎnjūn)特点：易感染双子叶植物(zhíwù)和裸子植物(zhíwù)，对大多数单子叶植物(zhíwù)没有感染能力②原理(yuánlǐ)：Ti质粒上的T---DNA可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。第二十八页，共48页。③过程(guòchéng)：④优点(yōudiǎn):经济和有效目的基因插入Ti质粒的T-DNA上农杆菌导入植物(zhíwù)细胞整合到受体细胞的染色体上目的基因的遗传特性得以维持稳定和表达第二十九页，共48页。（2）基因(jīyīn)枪法（3）花粉管通道法第三十页，共48页。2、将目的(mùdì)基因导入动物细胞①方法：显微注射法②程序：目的基因表达载体提纯取卵（受精卵）显微注射(zhùshè)受精卵培养新性状动物第三十一页，共48页。3、将目的基因导入微生物(shēngwù)细胞①原核生物(shēngwù)特点：繁殖快、单细胞、遗传物质少②方法：用Ca2+处理细胞感受态细胞表达载体与感受态细胞混合(hùnhé)感受态细胞吸收DNA分子第三十二页，共48页。细胞类型常用方法受体细胞转化过程植物细胞农杆菌转化法体细胞将目的基因插入Ti质粒的T-DNA上→转入农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的DNA动物细胞显微注射技术受精卵将含有目的基因的表达载体提纯→取卵→受精卵→显微注射→早期胚胎培养→胚胎移植→发育成为具有新性状的动物微生物细胞Ca2+处理法原核细胞用Ca2+处理细胞→感受态细胞→重组表达载体DNA分子与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子将目的基因(jīyīn)导入受体的方法2022/11/3033第三十三页，共48页。（一）、检测(jiǎncè)1、检测转基因生物(shēngwù)染色体的DNA上是否插入了目的基因①.首先取出转基因生物的基因组DNA②.用含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作标记,以此做探针(tànzhēn)③.使探针(tànzhēn)和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交带,表明染色体已插入染色体DNA中（1）方法:DNA分子杂交（2）过程:(四)目的基因的检测与鉴定——检查是否成功第三十四页，共48页。归纳(guīnà)步骤第三十五页，共48页。DNA分子(fēnzǐ)杂交技术过程详解——从转基因生物中取出含有目的基因片段的双链DNA，然后加热使之变性成两条单链。再用DNA探针与这两条单链分别杂交（即复性，产生双链）。所谓的探针就是(jiùshì)含有目的基因的同位素标记过的DNA片段。当目的基因成功导入我们要测的基因上时，探针就可以与之进行碱基配对。当目的基因未成功导入时，探针便无法与之正确配对形成双链产物。这样，通过检测新合成双链产物的放射性就可以判断导入是否成功了。第三十六页，共48页。（二）、鉴定(jiàndìng)（个体生物学水平）2、检测目的基因(jīyīn)是否转录出了mRNA3、检测目的基因(jīyīn)是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等①方法:分子杂交方法:抗原抗体杂交②过程:用上述探针和转基因生物的mRNA杂交,若出现杂交带,表明目的基因转录出了mRNA第三十七页，共48页。Western杂交(zájiāo)（抗原—抗体杂交(zájiāo)）具体做法是：第一步，将目的基因在大肠杆菌中表达出蛋白质；第二步，将表达出的蛋白质注射动物进行免疫，产生相应的抗体，并提取出抗体（一抗）；第三步，从转基因生物中提取蛋白质，走凝胶电泳；第四步，将凝胶中的蛋白转移到硝酸纤维素膜上；第五步，将抗体（一抗）与硝酸纤维素膜上的蛋白杂交，这时抗体（一抗）与目的基因表达的蛋白（抗原）会特异结合。由于这种抗原—抗体的结合显示不出条带，所以(suǒyǐ)加入一种称为二抗的抗体，它可以与一抗结合，二抗抗体上带有特殊的标记。如果目的基因表达出了蛋白质，则结果为阳性。第三十八页，共48页。归纳(guīnà)步骤第三十九页，共48页。

目的(mùdì)基因的检测与鉴定检测步骤目的方法原理工具现象1DNA分子杂交技术碱基互补配对放射性同位素作标记的含目的基因的DNA片段杂交带2检测目的基因是否转录出了mRNADNA分子杂交技术碱基互补配对放射性同位素作标记的含目的基因的DNA片段杂交带3检测目的基因是否翻译成蛋白质抗原-抗体杂交抗体的专一性特定抗体杂交带(阳性反应)检测转基因生物的染色体DNA上是否(shìfǒu)插入了目的基因2022/11/3040第四十页，共48页。归纳(guīnà):基因工程的基本操作程序获取目的基因从基因文库利用PCR化学方法人工合成构建基因表达(biǎodá)载体目的基因、启动子、终止子、标记基因将目的基因导入受体细胞农杆菌转化法、显微注射法目的基因的检测与鉴定检测：是否插入、转录、翻译鉴定：第四十一页，共48页。2022/11/3042第四十二页，共48页。寻根问底(xúngēnwèndǐ)——P9为什么要构建基因文库？直接从含有目的基因的生物体内提取不行吗？提示：构建基因文库是获取目的基因的方法之一，并不是惟一的方式。如果所需要的目的基因序列已知，就可以通过PCR方式从含有该基因的生物的DNA中，直接获得，也可以通过反转录，用PCR方式从mRNA中获得，不一定要构建基因文库。但如果所需要的目的基因的序列完全不知，或只知道(zhīdào)目的基因序列的一段，或想从一种生物体内获得许多基因，或者想知道(zhīdào)这种生物与另一种生物之间有多少基因不同，或者想知道(zhīdào)一种生物在个体发育的不同阶段表达的基因有什么不同，或者想得到一种生物的全基因组序列，往往就需要构建基因文库。2022/11/3043第四十三页，共48页。寻根问底：将目的基因直接导入受体细胞不是更简便(jiǎnbiàn)吗？如果这么做，结果会怎样？——P11提示：有人采用总DNA注射法进行遗传转化，即将(jíjiāng)一个生物中的总DNA提取出来，通过注射或花粉管通道法导入受体植物，没有进行表达载体的构建，这种方法针对性差，完全靠运气，也无法确定什么基因导入了受体植物。此法目前争议颇多，严格来讲不算基因工程。44第四十四页，共48页。思考与探究：1.作为基因工程表达载体(zàitǐ)，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。必须构建上述元件的主要理由是：（1）生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达；（2）通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录；（3）目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；（4）为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控元件，如增强子等；（5）有时需要确定(quèdìng)目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要