生化药品概述课件

第九章生化药品概述12/5/20221生化药品概念从生物体分离、纯化所得的一类结构上十分接近于人体内的正常生理活性物质，具有调节人体生理功能，达到预防和治疗疾病目的的物质。12/5/20222第一节生化药品分类氨基酸及其衍生物类多肽及蛋白质类酶类核酸及其降解物和衍生物糖类脂类12/5/20223胰岛素：猪、牛、人；菘蓝：板蓝根、大青叶；微生物：抗生素、蛋白质、酶等；12/5/202252、种类多、含量低

红豆杉——紫杉醇含量0.003%，约从38000棵紫杉树中方可分离提纯得到99％纯度的紫杉醇约25kg，2000美元/克12/5/202263、种属特性猪胰岛素牛胰岛素活性低高抗原性低高与人胰岛素结构相似性大小12/5/202274、活性与结构相关5、制备要求高12/5/20228一、生物材料的选择

1.来源应选用来源丰富的材料，尽量不与其他产品争原料，最好能一物多用，综合利用。胰脏制备弹性蛋白酶和激肽释放酶，胰岛素与胰酶等。12/5/2022103.有效成分的含量（1）合适的生物品种：催乳素，哺乳动物（2）合适的组织器官：（胃蛋白酶，胃）（3）生物的生长期：胸腺素，幼龄动物（4）合适的种属：人，猪（5）合适的生理状态：胰岛素，饭后12/5/202212（一）组织与细胞的破碎物理法化学法生物法三、生物材料预处理

12/5/2022141.物理法（1）磨切法工业：绞肉机，刨胰机，球磨机、磨粉机。实验室：匀浆机，研钵，高速组织捣碎机。（2）压力法有压榨法、高压法和减压法，渗透压法。（3）超声波法（4）反复冻融法12/5/202215超声细胞破碎仪

高压细胞破碎仪12/5/2022162.化学法

用稀酸、稀碱、浓盐、有机溶剂或表面活性剂处理细胞，可破坏细胞结构释放出内容物。12/5/202217（1）组织自溶法利用组织中自身溶解酶的作用改变、破坏细胞结构，释放出目的物称为组织自溶法。(2)酶解法用外来酶处理生物材料，如用溶菌酶处理某些细菌，蜗牛酶等3.生物法

12/5/202218（二）细胞器的分离

为获得结合在细胞器上的一些生化成分或酶系，常常要先得到细胞器再进一步分离有效成分。方法是匀浆破碎细胞，差速离心。12/5/202220（三）制备丙酮粉12/5/202221（一）物质的性质与提取方法的选择

要取得好的提取效果，最重要的是要针对生物材料和目的物的性质选择合适的溶剂系统与提取条件。

12/5/202223

其中最主要的是目的物与主要杂质在溶解度方面的差异以及它们的稳定性。操作者可根据文献资料及本人的试验摸索获得的有关信息，在提取过程中增加目的物的溶出度，尽可能减少杂质的溶出度。

12/5/202224

（2）添加保护剂

防止某些生理活性物质的活性基团及酶的活性中心受到破坏，巯基，极易被氧化，故提取时，常添加某些还原剂如半胱氨酸，－巯基乙醇。对易受重金属影响的，可添加EDTA等螯合剂。12/5/202226（3）抑制水解酶的作用：抑制剂、热等。（4）其它保护措施：冷、热、酸、碱12/5/202227１、温度提取温度↑溶解度↑。温度↑物料的粘度↓，有利于分子扩散和机械搅拌，对不耐热的生物活性物质的提取，一般在0~10℃进行提取。（三）影响提取的因素

12/5/202228盐溶作用：盐离子作用于生物大分子表面，增加了表面电荷，使之极性增加，水合作用增强，促使其形成稳定的双电层，此现象为盐溶作用。盐析作用：指溶液中加入无机盐类而使某种物质溶解度降低而析出的过程

３、盐浓度

12/5/202230（四）提取方法

１、用酸、碱、盐水溶液提取12/5/202231２、表面活性剂提取

表面活性剂分子兼有亲水与疏水基团，分布于油水界面时，有分散、乳化和增溶作用。表面活性剂分阴离子型、阳离子型与非离子型。离子型表面活性剂作用强，但是易引起蛋白质等生物大分子的变性，非离子表面活性剂变性作用小，适合于用水、盐系统无法提取的蛋白质或酶的提取。12/5/202232⑴.固－液提取丙酮从动物脑中提取胆固醇，溶剂分级提取：如先用丙酮，再用乙醇，最后用乙醚提取。石油醚，氯仿，乙酸乙酯，正丁醇，甲醇。

３、有机溶剂提取

12/5/202233

相似相溶

物质的性质与溶解度

12/5/202234⑵.液－液萃取

液－液萃取是利用溶质在两个互不混溶的溶剂中溶解度的差异，将溶质从一个溶剂相向另一个溶剂相转移的操作。分配系数和溶剂用量12/5/202235残留量计算公式

Xn=X0ｋｍｎ

ｋｍ＋ｖＸ０

：目的物总量（ｇ）Ｋ：分配系数，ｋ大，Xn大Ｖ：溶剂体积（ｍｌ），ｖ大，Xn小，ｖ＝２－５倍ｍ：生物材料重量（ｇ）ｎ：提取次数，ｎ大，Xn小，ｎ＝２－３次12/5/202236（一）盐析浓缩：硫酸铵沉淀蛋白质（二）有机溶剂沉淀浓缩在生物大分子的水溶液中，逐渐加入乙醇，丙酮等有机溶剂，可以使生化物质的溶解度明显降低，从溶液中沉淀出来。四、生物活性物质的浓缩与干燥

12/5/202237（三）用葡聚糖凝胶（Sephadex）浓缩（四）用聚乙二醇透析浓缩（五）超滤浓缩（六）真空减压浓缩与薄膜浓缩真空减压浓缩在药物生产中使用较为普遍，具有生产规模较大，蒸发温度较低，蒸发速度较快等优点。薄膜浓缩器的加速蒸发的原理是增加汽化表面积。12/5/20223812/5/202239（七）干燥的目的：提高药物或药剂的稳定性，以利于保存和运输；达到规格标准；便于进一步处理。（八）干燥方法：减压干燥、喷雾干燥、冷冻干燥等。

12/5/20224012/5/202241冷冻干燥机12/5/202242

１、生物制药中分离制备方法的特点（1）生物材料组成非常复杂。一种生物材料常含成千上万成分，各种化合物的形状、大小、分子量和理化性质都各不相同。没有固定操作方法。五、生化物质的分离纯化方法

12/5/202243（2）有些化合物在生物材料中含量极微，只达万分之一，甚至百万分之一。因此，分离操作步骤多，不易获得高收率。12/5/202244（3）生物活性物质离开生物体后，易变性，破坏，分离进程必须十分小心的保护这些化合物的生理活性。12/5/202245（4）生物制药的分离方法几乎都在溶液中进行，各种参数（温度，pH，离子强度）对溶液中各种组分的综合影响常常无法固定，以致许多实验设计理论性不强。12/5/202246（5）为了保护目的物的生理活性及结构上的完整性，生物制药中的分离方法多采用温和的逐级分离方法。亲和层析分离具有分离的专一性，高效性。12/5/202247（6）生物产品最后均一性的证明与化学纯度的概念不完全相同，因生物分子对环境反应十分敏感，结构与功能关系比较复杂。12/5/202248２、基本原理（1）根据分子形状和大小不同进行分离：如差速离心与超离心、

膜分离（透析，电渗析）与超滤，

凝胶过滤法。12/5/202249（2）根据分子电离性质的差异性进行分离。如离子交换法，电泳法，等电聚焦法。12/5/202250（3）根据分子极性大小及溶解度不同进行分离。如溶剂提取法，逆流分配法，分配层析法，盐析法，等电点沉淀法，及有机溶剂分级沉淀法。12/5/202251（4）根据物质吸附性质的不同进行分离。如选择性吸附法

吸附层析法。（5）根据配体特异性进行分离：亲和层析法。12/5/202252３、分离纯化的基本程序和实验设计

生物体内某一组分，特别是未知结构的组分的分离制备设计大致上分为五个基本阶段。12/5/202253（1）确定制备物的研究目的及建立相应的分析鉴定方法。（2）制备物理化性质稳定性的预备试验。（3）材料处理及抽提方法的选择。（4）分离纯化方法的摸索。（5）产物均一性测定。12/5/202254

⑴.分离纯化早期使用方法的选择早期分离纯化用萃取，沉淀，吸附等一些分辨力低的方法较为有利，这些方法负荷能力大，分离量多兼有分离提纯和浓缩的作用，为进一步分离纯化创造良好的基础。

４、分离纯化的策略：12/5/202255⑵.各种分离纯化方法的使用程序

在相同或相似条件下连续使用同一种分离方法就不太适宜。在安排纯化方法顺序时，还要考虑到有利于减少工序，提高效率。（盐析－吸附，吸附－盐析）对于一未知物通过各种方法的交叉应用，有助于进一步了解目的物的性质。12/5/202256⑶.分离后期的保护性措施

在分离操作的后期必须注意避免产品的损失，主要损失途径是器皿的吸附，操作过程样品液体的残留，空气氧化和某些事先无法了解的因素。12/5/202257５、分离纯化方法步骤优劣的综合评价

分辨能力重现性回收率比活性

12/5/202258

离心技术沉降作用—悬浮液静置时，在重力作用下，密度大于周围溶液的固体颗粒逐渐下沉，称为沉降作用。离心技术—在离心力场作用下，加速悬浮液中固体颗粒沉降速度的方法称为离心技术。相对离心力—通常用离心力与重力的比值表示离心机的离心能力，也称分离因素，用符号×g或g表示。12/5/202259r为离心转子的半径距离，以cm为单位；g为地球重力加速度（980cm/sec2）；N为转子每分钟的转数（rpm）。12/5/202260离心机

1．按转速高低来分（1）普通离心机，小于6000rpm（2）高速离心机，8000~25000rpm（3）超速离心机，25000~80000rpm12/5/2022612．按工作性质分类（1）制备型离心机（2）实验室用离心机3．按操作方式分类（1）连续离心机

（2）人工卸料（出渣）离心机；（3）自动卸料离心机（如螺旋式离心机）12/5/202262卧式螺旋卸料沉降离心机12/5/202263

膜分离技术分离范围分离动力一般过滤>1μm压力差微孔过滤0.01~1μm压力差透析5~100Å分子扩散超级过滤5~100Å压力差反渗透<5Å压力差电渗析<5Å电能12/5/202264海水脱盐淡化医药工业的纯化水、注射用水生物大分子物质的浓缩与纯化人工肾透析过滤除菌（溶液、空气）应用范围返回12/5/202265

凝胶层析

它是将样品化合物通过一定孔径的凝胶固定相，用于流经体积的差异，使不同分子量的组成得以分离的层析。12/5/202266VC大分子小分子返回12/5/202267离子交换法是利用溶液中各种带电粒子与离子交换剂之间结合力的差异进行物质分离的操作方法。带电粒子与离子交换剂间的作用力是静电力。它们结合是可逆的，在一定条件下能够结合，条件改变后也能被释放出来。离子交换剂由惰性的不溶性载体，功能基团和平衡离子组成。离子交换法

12/5/202268X＋X＋X＋X＋X＋X＋Y＋X＋Z＋X＋Y＋Z＋Z＋Y＋Y＋Y＋X＋Z＋X＋Z＋X＋Z＋Z＋X＋X＋X＋Y＋Z＋Y＋Z＋Ｘ＋Ｘ＋X＋X＋X＋X＋Ｚ＋X＋Ｚ＋X＋X＋OH－nX＋平衡上样吸附洗杂洗脱返回12/5/202269

固相析出分离法改变溶液条件，使溶质以固体形式从溶液中分出的操作技术称为固相析出分离法。析出物为晶体时称为结晶；析出物为无定形固体称为沉淀法。固相析出法主要有盐析法，有机溶剂沉淀法，等电点沉淀法，结晶法等。12/5/202270盐析法是利用各种生物分子在浓盐溶液中溶解度的差异，通过向溶液中引入一定数量的中性盐，使目的物或杂蛋白以沉淀析出，达到纯化目的的方法。12/5/202271盐析的机制高浓度的中性盐溶液中存在着大量的带电荷的盐离子，它们能够中和生物分子表面的电荷，使之赖以稳定的双电层受损，从而破坏分子外围的水化层；另外，大量盐离子自身的水合作用降低了自由水的浓度，从另一方面摧毁了水化层，使生物分子相互聚集而沉淀。12/5/20227212/5/20227312/5/202274向水溶液中加入一定量亲水性的有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出的分离纯化方法。有机溶剂沉淀法

12/5/202275主要机理：（1)亲水性有机溶剂加入溶液后降低了介质的介电常数，使得溶质分子之间的静电引力增加，聚集形成沉淀。(2)水溶性有机溶剂本身的水合作用降低了自由水的浓度，压缩了亲水溶质分子表面原有水化层的厚度，降低了它的亲水性，导致脱水凝集。12/5/202276等电点沉淀法

两性电解质，在溶液pH处于等电点（pI）时分子表面净电荷为零，导致赖以稳定的双电层及水化膜的削弱或破坏，分子间引力增加，溶解度降低。调节溶解的pH值，使两性溶质溶解度下降，析出沉淀的操作。12/5/202277

改变溶液的某些条件，使其中的溶质以结晶态析出的过程称作结晶。结晶法

12/5/202278盐析结晶法请在此键入您自己的内容Cytc12/5/202279化学反应结晶法

12/5/202280

吸附法

吸附是物质分子在两相界面上浓度的增加。我们称物质从流动性（气或液相）浓缩到固体表面从而达到分离的过程称为吸附作用。把在表面上能发生吸附作用的固体称为吸附剂；将被吸附的物质称为吸附物。12/5/202281预处理上样吸附洗杂洗脱再生12/5/202282常用吸附剂：1)活性炭是一种吸附能力很强的非极性吸附剂，其吸附作用在水溶液中最强，在有机溶剂中较弱，吸附能力的顺序：水>乙醇>甲醇>乙酸乙酯>丙酮>氯仿。2)人造沸石人造沸石是一种人工合成的无机阳离子交换剂。用于细胞色素C的分离。12/5/2022833)磷酸钙凝胶在蛋白质的分离、精制中，较为常用的吸附剂为磷酸钙凝胶。（羟基磷灰石）活性部位为钙离子。4)白陶土5)氢氧化铝凝胶用于蛋白质及酶的分离12/5/2022846)氧化铝活性氧化铝是最常用的一种吸附剂，特别适于亲脂性成分的分离，广泛地用于在醇，酚，生物碱，染料，甾体化合物，苷类，氨基酸，蛋白质以及维生素等物质的分离。7)硅胶最常用12/5/2022858)滑石粉惰性助滤剂9)硅藻土惰性助滤剂10)皂土11)聚酰胺粉12)大孔网格聚合物吸附树脂极性，弱极性，非极性大孔吸附树脂强酸性，弱酸性，强碱性，弱碱性等返回12/5/202286

利用生物大分子特异性亲和力而设计的层析技术称为亲核层析。在亲和层析中起可逆结合的特异性物质称为配基（Ligand），与配基结合的层析介质称为载体（Matrix）亲和层析

LSLS＋配基样品12/5/202287亲和层析的过程：1)配基固定化选择合适的配基与不溶性的支撑载体偶联，或共价结合成具有特异性亲和性分离介质。L＋L12/5/2022882)吸附样品亲和层析介质选择性吸附酶或其它生物活性物质，杂质与层析间没有亲和作用，故不能被吸附而被洗涤去除。S＋S＋杂质LL12/5/2022893)样品洗脱选择适宜的条件使被吸附的亲