细胞周期和细胞凋亡课件

细胞周期和细胞凋亡技术第一节细胞增殖周期一、细胞周期概述

细胞周期:

细胞从一次分裂结束开始到下一次分裂结束为止所经历的过程

G1SG2M

细胞周期G1期（DNA合成前期）S期（DNA合成期）G２期（DNA合成后期）有丝分裂期（M期）间期前期中期后期末期G1SG2MTc=TG1+TS+TG2+TM二、细胞周期各时相的特点(一)G1期限制点(R点):在G1期存在一个调节细胞周期的开或关的“阀门”，即限制点（亦称为检验点）。（控制细胞从G1A态转为G1B态的临界点）RG20G1DG1AG1BG0SG2MS0G1１.G1期细胞的生长合成三种RNA核糖体的组装结构蛋白酶蛋白的合成ＮＰ

＝（核质比）细胞核体积细胞质体积＝ＶnVc－Vn＝0.3~0.52.G1期细胞的增殖状态G1期细胞类型增殖细胞群暂不增殖细胞群(保持着增殖能力但处于休止状态）永不增殖细胞群G1D永不增殖细胞群G０暂不增殖细胞群

增殖细胞群死亡(二)S期:

合成DNA(三)

G2期:

为M期的细胞分裂作好物质和能量贮备(四)M期把复制好的染色体平均地分到两个子细胞中去一.细胞凋亡的特征形态学特征：细胞膜向外突起，细胞体积缩小↓染色质凝缩，然后断裂成碎片↓形成数个大小不等的由膜包裹的凋亡小体↓凋亡小体被邻近细胞吞噬（2）细胞坏死（necrosis）概念：细胞受到激烈的物理、化学刺激或严重的病理性刺激后，引起的细胞损伤和死亡。特征：胞膜通透性增高，使细胞肿胀，细胞器变形或肿大，细胞核破碎，最后细胞溶解破裂，溶酶体泄漏，引起炎症反应。特性推荐使用手段说明形态学细胞表面改变扫描电镜微绒毛消失,芽状突起,可见凋亡小体胞浆改变相差显微镜细胞皱缩,质膜变形,胞浆空泡染色质凝聚核裂解相差显微镜或光镜适用于组织切片荧光显微镜用结合DNA的染料标记,适用于培养细胞流式细胞仪定量测定DNA含量,细胞的大小和蛋白,适于培养细胞超微结构透射电镜完整的细胞器,胞浆空泡,核染色质凝聚裂解,

凋亡小体适用于组织切片或培养细胞生化改变DNA裂解琼脂糖凝胶电泳梯状条带磁场反转凝胶电泳可测50bp或300bp的HMW片段

TUNEL法原位缺口平移法基因表达可从mRNA、蛋白层次测定，可用免疫组化、原位杂交、Northern印迹法等二、细胞凋亡的检测方法1、透射电镜形态学观察法收集细胞→PBS洗两遍→戊二醛固定→电镜切片形态特点：细胞膜起泡、出芽，染色体凝集，形成的凋亡小体。缺点：①只能定性不能定量②标本处理过程复杂、设备昂贵，不适合作大批标本检测2、扫描电镜形态学观察法主要观察细胞表面的结构变化凋亡的肝癌细胞表面微绒毛消失凋亡细胞表面有众多凋亡小体正常的肝癌细胞3、流式细胞分析仪（FlowCytometry，FCM）流式细胞仪是将流体喷射技术、激光技术、空气计数、γ-射线能谱术及电子计算机等技术与显微荧光光度计结合的一种大型的精密仪器，它通过测量在一定波长的激光激发快速流动的粒子（细胞或微粒）荧光和散射激光来获得粒子的一些成分及其变化情况，进行多参数的、快速的定量分析和分选的技术。FCM应用标志着细胞学、肿瘤学、免疫学等进入了细胞和分子水平的研究。概念：基本原理待测单细胞悬液细胞（染色后）→压入流动室→鞘液在高压下从鞘液管喷出→鞘液包绕着样品高速流动，使细胞排列成较稳定的单细胞队列→激光垂直照射在样品流上，使被染色的细胞在激光束的照射下产生散射光和激发荧光→散射光和荧光分别被光电二极管和光电倍增管接收→转换成电压脉冲和积分脉冲→信号经模-数转换后进入计算机G2MG0G1s0

200

400

600

8001000G0/G1sG2/MDNAAnalysisDNAcontent2N4NNormalCellCycleCellnumber02004006008001000PIFluorescenceDNAAnalysis2N4N区分细胞碎片和凋亡细胞凋亡的细胞核因核浓缩而具有高SSC值，因此很容易与低SSC值的碎片的相区别；凋亡的细胞核的荧光的信道值为10~250，而碎片的信道值一般为1~5，因此可以将PI荧光的设定在10信道上，从而去掉碎片。双参数分析双参数分析：应用两种荧光染料标记细胞的成分。

例：AnnexinV-PI的双染色法。

AnnexinⅤ是一种分子量为35-36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与细胞凋亡过程中翻转到膜外的磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine，PS）高亲和力特异性结合。以标记了FITC的AnnexinⅤ作为荧光探针，利用流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。将AnnexinⅤ与PI匹配使用，可以将凋亡早期的细胞和晚期的细胞以及死细胞区分开来。坏死细胞活细胞AnnexinV/PI的双染色法：左下象限显示正常活细胞，为FITC-/PI-；右上象限为坏死细胞，为FITC+/PI+；右下象限为凋亡细胞，呈现FITC+/PI-FITCPI凋亡细胞AnnexinV/PI的双染色法检测凋亡细胞优点：①对早期凋亡细胞检测灵敏②细胞不需固定，省时省力。③结果更可靠。注意：胰酶的消化时间三、凋亡调控基因及凋亡相关因子的检测㈠与细胞凋亡有关的基因和相关因子1.生存基因（死亡抑制基因）①促进细胞存活的基因：bcl-2基因家族：

主要功能：延长细胞的寿命，对细胞周期和分化不产生影响；抑制多种模型的细胞凋亡。

存在部位：bcl-2蛋白主要定位在核膜、ER膜、mi膜上。②促进细胞增殖的基因

如：c-myc、c-abl、ras相关基因2.死亡基因(1)促进细胞死亡的基因

caspase基因家族：

Bax基因：Bax过度表达，可拮抗bcl-2的促进细胞增殖作用及抑制程序性细胞死亡。⑵抑制细胞生长的基因:

P53基因、Rb基因(二)凋亡调控基因和因子的检测方法1、免疫组织化学方法

适用于冰冻或石蜡包埋的标本2、流式细胞术

可检测细胞悬液或培养细胞中荧光标记的凋亡相关的基因产物3、RT-PCR法检测凋亡调控基因的mRNA表达4、基因芯片思考题1、简述细胞凋亡的分子机制（可以选择三种通路其中一种）2、简述检测细胞凋亡最新的几种方法。侧向散射光侧向散射光前向散射光前向散射光（FSC）：检测细胞大小侧向散射光（SSC）：检测细胞内部结构

（胞浆内颗粒多少,核质比）

根锯FSC/SSC，就可以分开全血样本中的淋巴细胞，单核细胞和中性粒细胞。LaserBeamShapingLensesFlowCellForwardScatterDetectorSideScatterDetector525BPFL1(FITC)575BPFL2(PE)620BPFL3(PI)675BPFL4(PC5)488DL488BK550DL600DL645DL荧光检测器常用荧光染料的特性荧光染料激发波长(nm)发射波长(nm)用途颜色FITC488525免疫荧光绿色PE(RD1)488575免疫荧光橙色

ECD488620免疫荧光橙红PeCy5488675免疫荧光红PI488620DNA染色橙红PECy7 488 755 免疫荧光 深红PerCP 488 670APC633 670超高频电晶体充电后振动→液流断裂为均匀的液滴→将液滴充以正负不同的电荷→当液滴流经带有几千伏特的偏转板时，在高压电场的作用下偏转→落入各自的收集容器中，不予充电的液滴落入中间的废液容器，从而实现细胞的分离。分选原理DNA含量

AnnexinV-PI的双染色法检测细胞凋亡原理：AnnexinV质膜磷脂酰丝氨酸结合新月状八字形花瓣状黑洞样眼球状环状细胞核断裂成碎片染色质浓缩，形成多种形态图：细胞凋亡时超微结构的变化凋亡早期细胞上皮细胞巨噬细胞凋亡小体形成被巨噬细胞吞噬的凋亡小体凋亡小体迅速被巨噬细胞吞噬由膜包裹的凋亡小体染色质浓缩细胞核破裂形成凋亡小体细胞膜向外突起DNAladder（2）Bcl-2蛋白家族成员及生物学效应Bcl-xl、Bcl-xs、Bax、Bad和线虫的ced-9等（共同具有BH1和BH2两个保守区域）Bax：诱导凋亡，以同源二聚体形式存在，也可与Bcl-2形成异源二聚体Bcl-xl、Bcl-xs：由bcl-x基因通过mRNA不同剪切形成，Bcl-xl抑制凋亡，Bcl-xs促进凋亡Bcl-2、Bax和Bcl-xs三者形成一个凋亡调控系统（1）当Bax同源二聚体形成，便诱导凋亡（2）随Bcl-2蛋白表达量上升，Bax二聚体分开，与Bcl-2形成比Bax–Bax更稳定的Bax-Bcl-2异源二聚体（3）当Bcl-xs存在时，优先与Bcl-2形成异源二聚体，使游离的Bax形成同源二聚体诱导凋亡。Bad：诱导凋亡，能和Bcl-2或Bcl-xl形成二聚体Bad与Bcl-xl形成稳定的异二聚体后，使原来的的Bax-Bcl-xl解体，将Bax置换出来，形成Bax同源二聚体，启动凋亡。Bad、Bax和Bcl-xl三者可形成一个凋亡调控系统AO和EB双染正常细胞：AO－绿色荧光强，

EB－染色红色荧光较弱；凋亡细胞：AO－绿色荧光强度弱减，

EB－染色红色荧光加强；坏死细胞：AO－绿色荧光强度弱或消失

EB－染色红色荧光强

概念：Caspases(Cysteine-containingaspartate-specificproteases)：天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶

—在靶蛋白的特异天冬氨酸残基部位进行切割。特点：Caspase自身以非活化的Procaspase存在，其激活依赖于其他的Caspase在它的天冬氨酸位点裂解活化或自身活化。同源活化和异源活化,活化后形成四聚体的蛋白水解酶，发挥生物学作用。大小亚基结合（二聚体）

caspase活化（四聚体）Pro-caspase-8：NH2末端结构域、20KD亚基、10KD亚基剪切Caspase家族的结构与分类：有14个成员(Caspase1-14)

（1）凋亡启动亚类Caspase蛋白酶：Caspase8，Caspase9，Caspase10。（2）凋亡效应亚类Caspase蛋白酶：Caspase2，Caspase3，Caspase6，Caspase7

2、参与死亡受体信号转导的接头蛋白：（死亡结构域蛋白deathdomainprotein）TRADD：TNF受体相关的死亡结构域蛋白TNF+TNFRI（死亡结构域）+TRADD—细胞凋亡FADD：Fas相关的死亡结构域蛋白FasL+Fas（死亡结构域）+FADD—细胞凋亡

TRAIL+DR4/DR5（死亡结构域）+

FADD—细胞凋亡(一)细胞凋亡的死亡受体途径1、死亡受体：

TNFR、Fas、DR4、DR5是一类通过与相应配体结合，传递细胞凋亡信号的细胞膜蛋白。FASL+FAS+FADD

死亡诱导信号复合物（DISC）胞质中游离的pro-caspase8聚集到这个复合物上细胞有足够caspase8细胞caspase8浓度不够被死亡受体活化，切割BidtBid从胞质到线粒体细胞凋亡

CtyC释放FSAL

FADDPro-caspase-8Caspase-8Caspase-3Pro-caspase-3细胞凋亡生长因子、信号、Fas抗体FASFADD（Fas-associateddeathdomain）；DD（deathdomain）；DED（deatheffectordomain）。DEDDEDDDcaspase-10（二）细胞凋亡的线粒体途径AIF：凋亡诱导因子Apaf-1（apoptosisproteaseactivatingfactor）：凋亡蛋白酶活化因子细胞色素C（cytochromeC）：细胞色素C+Apaf-1+pro-caspase9—apoptosome(凋亡体)膜通透性↑、线粒体肿胀、△m↓Apaf-1活化Cyt.cCa2+NO缺血缺氧活性氧MPT开放Cyt.c+Pro-caspase-9Caspase-9ATPApaf-1+Apaf-1活化Cyt.cCARDapoptosome

AIFcaspase-independentapoptosisPro-Caspase-3凋亡Caspase-3Pro-caspase-2caspase-2Pro-caspase-6Caspase-6Pro-caspase-7caspase-7Pro-caspase-9ICAD（抑制性CAD）CAD（caspase活化DNA酶）CAD进入细胞核内降解DNA细胞凋亡剪切细胞内结构蛋白caspase-9．Activationofcaspase-3（共同通路）(Effectorcaspase)Caspase-3Pro-caspase-3CAD(Caspases-activateddeoxyribonuclease):caspase激活的DNA酶c-FLIP:cellularFas-associateddeathdomain-likeIL-1beta-convertingenzymeinhibitoryprotein下游Caspases活化后，作用底物：裂解核纤层蛋白，导致细胞核形成凋亡小体；裂解DNase结合蛋白，使DNase释放，降解DNA形成DNALadder;裂解参与细胞连接或附着的骨架和其他蛋白，使凋亡细胞皱缩、脱落，便于细胞吞噬；导致膜脂PS重排，便于吞噬细胞识别并吞噬。【促凋亡机制】

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P53通过与Bcl-2基因相互作用，下调Bcl-2的表达。■

P53诱导细胞凋亡的靶蛋白表达（线粒体和死亡受体介导）。■

P53诱导线粒体内凋亡的相关蛋白（Bax、NOXA、PUMA）表达，并触发细胞色素C释放和caspase活化。■

P53诱导死亡受体Fas表达。■

P53能使死亡受体再定位于细胞膜上。

2．p53基因（抑癌基因）

Asatranscriptionfactor,p53regul