原核表达操作步骤及注意事项

原核表达操作步骤及注意事项原核表达操作步骤及注意事项原核表达操作步骤及注意事项原核表达操作步骤及注意事项编制仅供参考审核批准生效日期地址：电话：传真:邮编:原核表达操作步骤及注意事项时间：2010-03-0314:05:01来源：作者：点击：1046次将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点：易于生长和控制；用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵；有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。但是，在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。表达载体在基因工程中具有十分重要的作用，原核表达载体通常为质粒，典型的表达载体应具有以下几种元件：（1）选择标志的编码序列；

（2）可控转录的启动子；

（3）转录调控序列(转录终止子，核糖体结合位点)；

（4）一个多限制酶切位点接头；

（5）宿主体内自主复制的序列。原核表达一般程序如下：获得目的基因－准备表达载体－将目的基因插入表达载体中（测序验证）－转化表达宿主菌－诱导靶蛋白的表达－表达蛋白的分析－扩增、纯化、进一步检测一、试剂准备1、LB培养基。

2、100mMIPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38gIPTG溶于100mlddH2O中，μm滤膜抽滤，-20℃二、操作步骤（一）获得目的基因1、通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR循环获得所需基因片段。

2、通过RT-PCR方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA，以mRNA为模板，逆转录形成cDNA第一链，以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。（二）构建重组表达载体1、载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。

2、PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入载体。（三）获得含重组表达质粒的表达菌种1、将连接产物转化大肠杆菌DH5α，根据重组载体的标志（抗Amp或蓝白斑）作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。

2、测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确，进入下步操作。否则应筛选更多克隆，重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。

3、以此重组质粒DNA转化表达宿主菌的感受态细胞。（四）诱导表达1、挑取含重组质粒的菌体单斑至2mlLB（含Amp50μg/ml）中37℃过夜培养。

2、按1∶50比例稀释过夜菌，一般将1ml菌加入到含50mlLB培养基的300ml培养瓶中，37℃震荡培养至OD600≌（最好，大约需3hr）。

3、取部分液体作为未诱导的对照组，余下的加入IPTG诱导剂至终浓度0.4mM作为实验组，两组继续37℃震荡培养3hr。

4、分别取菌体1ml，离心12000g×30s收获沉淀，用100μl1%SDS重悬，混匀，70℃三、注意事项1、选择表达载体时，要根据所表达蛋白的最终应用考虑。如为方便纯化，可选择融合表达；如为获得天然蛋白，可选择非融合表达。

2、融合表达时在选择外源DNA同载体分子连接反应时，对转录和转译过程中密码结构的阅读不能发生干扰。如何做原核表达（prokaryoticexpression）2010-03-2622:54:25来源：易生物实验浏览次数：673网友评论0条首先来一些大肠杆菌表达的基本概念：一个完整的表达系统通常包括配套的表达载体和表达菌株，如果是特殊的诱导表达还包括诱导剂，如果是融合表达还包括纯化系统或者Tag检测等等。选择表达系统通常要根据实验目的来考虑，比如表达量高低，目标蛋白的活性，表达产物的纯化方法等等。主要归结在表达载体的选择上。

关键词：原核原核表达prokaryoticexpression人们合成与生物相关的物质是从尿素开始的，1828年，德国化学家维勒人工合成了存在于生物体的这种有机物。在1960年我国科学家采用化学方法首次成功地合成了具有生物活性的蛋白质——胰岛素。随着内切酶的发现和基因工程技术的发展，人们发现用各种不同的载体在原核、真核系统中进行蛋白表达更为行之有效。而这其中大肠杆菌表达系统发展得最为迅速、成熟。原核表达具有操作方便、快捷，需时较短，表达量大，适合工业化生产等优点。虽然也有缺少糖基化和表达后加工等问题，当有了其它多种表达系统后，原核系统仍是我们合成外源蛋白的首选。

在网上看到有人把原核表达技术分成四个等级：初次尝试扫盲、乱棍打枣入门、系统优化中级和自成一体高手，觉得十分有意思。但是根据笔者自己的经验以及耳闻目睹的一些经历告诉我：做表达那是谋事在人，成事在天。有时候你把克隆做出来了，双酶切鉴定没问题，测序没问题，可是就是看不到表达带。原因当然可以分析，实验也是可以改进，但是窜改一下戈尔泰的话：“成功的实验都是一样的，失败的实验各有各的不幸。”在实验遇到瓶颈的时候要如何进行分析，找到问题的症结是我们的实验关键所在。在准备进行原核表达的时候需要考虑的因素很多，市面上可供选择的载体、菌株也很多，要如何进行正确的选择，找到适合自己的载体是十分重要的。所以，现在要对目前常用的一些载体进行介绍，让我们对其相关产品及其表达原理进行了解，以方便实验设计。

首先来一些大肠杆菌表达的基本概念：一个完整的表达系统通常包括配套的表达载体和表达菌株，如果是特殊的诱导表达还包括诱导剂，如果是融合表达还包括纯化系统或者Tag检测等等。选择表达系统通常要根据实验目的来考虑，比如表达量高低，目标蛋白的活性，表达产物的纯化方法等等。主要归结在表达载体的选择上。表达载体：我们关心的质粒上的元件包括启动子，多克隆位点，终止密码，融合Tag（如果有的话），复制子，筛选标记/报告基因等。通常，载体很贵，我们可以通过实验室之间交换得到免费的载体。但是要小心，辗转多个实验室和多个实验室成员之手的载体是否保持原来的遗传背景MCS是否还是原来那个MCS是我们要特别注意的。

复制子：通常表达载体都会选用高拷贝的复制子。pSC101类质粒是严谨方式复制，拷贝数低，pCoE1，pMBI(pUC)类的复制子的拷贝数高达500以上，是表达载体常用的。通常情况下质粒拷贝数和表达量是非线性的正相关，当然也不是越多越好，超过细胞的承受范围反而会损害细胞的生长。如果碰巧需要2个质粒共转化，就要考虑复制元是否相容的问题。

筛选标记和报告基因：氨苄青霉素抗性是最常见的筛选标记，卡那霉素或者是新霉素次之，通常是另一个载体的筛选标记用。四环素，红霉素和氯霉素等已经日渐式微。抗性基因的选择要注意是否会对研究对象产生干扰，比如代谢研究中要留意抗性基因编码的酶是否和代谢物相互作用。在表达筛选中要注意的问题应该就是LB倒板前加抗生素的温度，温度过高容易导致抗生素失效。今天耐青霉素的超级细菌泛滥，不知道是否有我们实验人员的功劳呢大家“随便倒掉”已经获得氨苄抗性的大肠杆菌之前有没有经过煮沸或者消毒等处理呢从以前的一针50万单位到现在100多万个单位，青霉素剂量似乎越来越大了。

对于做表达来说，如果不是要研究启动子的强弱，通常比较少关心或者用到报告基因吧。绿色荧光蛋白是最常用的报告基因了（注意选择适用原核表达版本的GFP），其他还有半乳糖苷酶啊，荧光素酶啊等等。一些融合表达Tag也有报告基因的功能。

启动子、终止子和核糖体结合位点

启动子：启动子的强弱是对表达量有决定性影响的因素之一。从转录模式上看有组成型表达和诱导调控型表达。lac和Tac，PL和PR，T7是最常用的启动子。

组成型表达：表达载体的启动子为组成型启动子，也就是一直努力不停表达目的蛋白的启动子，如pMAL系统。持续性表达通常表达量比较高，成本低，但是不适合表达一些对宿主细菌生长有害的蛋白。因为过量或者有害的表达产物会影响细菌的生长，反过来影响表达量的积累。

诱导调控型表达：表达载体采用诱导型启动子，只有在诱导剂存在的条件下才能表达目的产物。这种方法有助于避免菌体生长前期高表达对菌体生长的影响，又可减少菌体蛋白酶对目标产物的降解。特别适合解决有毒蛋白的表达。另外也有启动子是组成型的，但是启动子所依赖的转录酶是诱导表达的，也属于诱导表达系统。

融合表达：表达载体的多克隆位点上有一段融合表达标签（Tag），表达产物为融合蛋白（有分N端或者C端融合表达），方便后继的纯化步骤或者检测。对于特别小的分子建议用较大的Tag（如GST）以获得稳定表达；而一般的基因多选择小Tag以减少对目的蛋白的影响。His-Tag是最广泛采用的Tag。

分泌表达：在起始密码和目的基因之间加入信号肽，可以引导目的蛋白穿越细胞膜，避免表达产物在细胞内的过度累积而影响细胞生长，或者形成包含体，而且表达产物是可溶的活性状态不需要复性。通常这种分泌只是分泌到细胞膜和细胞壁之间的周质空间。

可溶性表达：大肠杆菌表达效率很高，特别是强启动子，目的蛋白来不及折叠而形成不溶的包含体颗粒，包含体容易纯化但是复性效率不高。分泌表达可以得到可溶的产物，也有部分融合Tag有助于提高产物的可溶性，比如Thio，pMAL系统。

转录终止子对外源基因在大肠杆菌中的高效表达有重要作用——控制转录的RNA长度提高稳定性，避免质粒上异常表达导致质粒稳定性下降。放在启动子上游的转录终止子还可以防止其他启动子的通读，降低本底。转录终止子有两类，Rho因子作用下使转录终止mRNA和根据模版上的对称序列形成发夹结构而终止mRNA。常见的是rrnB

rRNA操纵子的T1T2串连转录终止子。

核糖体结合位点：启动子下游从转录起始位点开始延伸的一段碱基序列，其中能与rRNA16S亚基3'端互补的SD序列对形成翻译起始复合物是必需的，多数载体启动子下游都有SD序列，也有些载体没有，适合自带SD序列的基因表达，要留意。

表达菌株：我们往往最容易忽视的一点。不同的表达载体对应有不同的表达菌株，一些特别设计的菌株更有助于解决一些表达难题，这一点生物通会有专门的介绍。同样的，交换获得的免费菌株，要小心其遗传背景是否已经发生改变当心。

注：以上各种特性是可以相互组合的，不是排他的！首先来一些大肠杆菌表达的基本概念：一个完整的表达系统通常包括配套的表达载体和表达菌株，如果是特殊的诱导表达还包括诱导剂，如果是融合表达还包括纯化系统或者Tag检测等等。选择表达系统通常要根据实验目的来考虑，比如表达量高低，目标蛋白的活性，表达产物的纯化方法等等。主要归结在表达载体的选择上。

关键词：原核原核表达prokaryoticexpression几个常用的启动子和诱导调控表达系统

最早应用于的表达系统是Lac乳糖操纵子，由启动子Plac+操纵基因lacO+

结构基因组成。其转录受CAP正调控和lacI负调控。lacUV5突变能够在没有CAP的存在下更有效地起始转录，该启动子在转录水平上只受lacI的调控，因而随后得到了更广泛采用。lacI产物是一种阻遏蛋白，能结合在操纵基因lacO

上从而阻遏转录起始。乳糖的类似物IPTG可以和lacI产物结合，使其构象改变离开lacO，从而激活转录。这种可诱导的转录调控成为了大肠杆菌表达系统载体构建的常用元件。tac启动子是trp启动子和lacUV5的拼接杂合启动子，且转录水平更高，比lacUV5更优越。trc启动子是trp启动子和lac启动子的拼合启动子，同样具有比trp更高的转录效率和受lacI阻遏蛋白调控的强启动子特性。在常规的大肠杆菌中，lacI阻遏蛋白表达量不高，仅能满足细胞自身的lac操纵子，无法应付多拷贝的质粒的需求，导致非诱导条件下较高的本底表达，为了让表达系统严谨调控产物表达，能过量表达lacI阻遏蛋白的lacIq突变菌株常被选为Lac/Tac/trc表达系统的表达菌株。现在的Lac/Tac/trc载体上通常还带有lacIq基因，以表达更多lacI阻遏蛋白实现严谨的诱导调控。IPTG广泛用于诱导表达系统，但是IPTG有一定毒性，有人认为在制备医疗目的的重组蛋白并不合适，因而也有用乳糖代替IPTG作为诱导物的研究。另外一种研究方向是用lacI的温度敏感突变体，30度下抑制转录，42度开发。热诱导不用添加外来的诱导物，成本低，但是由于发酵过程中加热升温比较慢而影响诱导效果，而且热诱导本身会导致大肠杆菌的热休克蛋白激活，一些蛋白酶会影响产物稳定。

以λ噬菌体再起转录启动子PL、PR构建的载体也为大家所熟悉。这两个强启动子受控于λ噬菌体cI基因产物。cI基因的温度敏感突变体cI857(ts)常常被用于调控PL、PR启动子的转录。同样也是30度下阻遏启动子转录，42度下解除抑制开发转录。同样的，PL、PR

表达载体需要携带cI857(ts)菌株作为表达载体，现在更常见的做法是在载体上携带cI857(ts)基因，所以可以有更大的宿主选择范围。另外一种思路是通过严谨调控cI产物来间接调控PL、PR启动子的转录。比如Invitrogen的PL表达系统，就是将受trp启动子严谨调控的cI基因溶源化到宿主菌染色体上，通过加入酪氨酸诱导抑制trp启动子，抑制cI基因的表达，从而解除强大的PL启动子的抑制。

T7启动子是当今大肠杆菌表达系统的主流，这个功能强大兼专一性高的启动子经过巧妙的设计而成为原核表达的首选，尤其以Novagen公司的pET系统为杰出代表。强大的T7启动子完全专一受控于T7

RNA聚合酶，而高活性的T7RNA聚合酶合成mRNA的速度比大肠杆菌RNA聚合酶快5倍——当二者同时存在时，宿主本身基因的转录竞争不过T7表达系统，几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白；诱导表达后仅几个小时目的蛋白通常可以占到细胞总蛋白的50%以上。由于大肠杆菌本身不含T7

RNA聚合酶，需要将外源的T7RNA聚合酶引入宿主菌，因而T7RNA

聚合酶的调控模式就决定了T7系统的调控模式——非诱导条件下，可以使目的基因完全处于沉默状态而不转录，从而避免目的基因毒性对宿主细胞以及质粒稳定性的影响；通过控制诱导条件控制T7RNA聚合酶的量，就可以控制产物表达量，某些情况下可以提高产物的可溶性部分。

有何高招且看我为你一一道来：

有几种方案可用于调控T7RNA聚合酶的合成，从而调控T7表达系统。

1.噬菌体DE3是lambda噬菌体的衍生株，含有lacI抑制基因和位于lacUV5启动子下的T7RNA

聚合酶基因。DE3溶源化的菌株如BL21(DE3)就是最常用的表达菌株，构建好的表达载体可以直接转入表达菌株中，诱导调控方式和lac一样都是IPTG诱导。

2.另一种策略是用不含T7RNA聚合酶的宿主菌克隆目的基因，即可完全避免因目的蛋白对宿主细胞的潜在毒性而造成的质粒不稳定。然后用λCE6噬菌体侵染宿主细胞——CE6是lambda噬菌体含温度敏感突变(cI857ts)和pL/pR启动子控制T7RNA聚合酶的衍生株，在热诱导条件下可以激活T7RNA聚合酶的合成。

此了噬菌体之外，还可以通过共转化质粒提供T7RNA聚合酶。比如有人用受溶氧浓度控制的启动子调控T7RNA聚合酶合成，据说这比较适合工业化发酵的条件控制。

由于T7RNA聚合酶的调控方式仍有可能有痕量的本底表达，控制基础表达的手段之一是培养基外加葡萄糖，有助于控制本底表达水平。二是采用带有T7lac启动子的载体——在紧邻T7启动子的下游有一段lacI操纵子序列编码表达lac阻遏蛋白(lacI)，lac阻遏蛋白可以作用于宿主染色体上T7RNA聚合酶前的lacUV5启动子并抑制其表达，也作用于载体T7lac启动子，以阻断任何T7RNA聚合酶导致的目的基因转录。pLacI工转化也是同样的原理。如果这还不够，更为严谨调控手段还有——在宿主菌中表达另一个可以结合并抑制T7RNA聚合酶的基因——T7融菌酶，降低本底。常用的带溶菌酶质粒有pLysS和pLysE，相容的ori都不会影响后继的表达质粒转化，前者表达的溶菌酶的水平要比后者低得多，对细胞生长影响小，而pLysE会明显降低宿主菌的生长水平，容易出现过度调节，增加蛋白表达的滞后时间，从而降低表达水平。通过几种不同方法来巧妙调控T7聚合酶合成，T7启动子发展出了史上功能最强大，最丰富的表达系统。真核表达载体和原核表达载体的区别浏览次数：456次悬赏分：30|提问时间：2010-7-2219:52|提问者：紫云鸠|问题为何被关闭越详细越全面越好推荐答案主要是因为原核和真核表达系统所需的表达元件不同。比如说启动子，终止子在两种表达系统中是不一样的。带有真核表达元件的是真核载体，能在真核生物内表达；带有原核表达元件的是原核载体，能在原核生物内表达。两者都具有的为穿梭载体。1)真核表达载体和原核表达载体就是能在真核生物或原核生物中表达的载体,它们一般都带有能在真核生物或原核生物中表达的必需表达元件;2)真核表达和原核表达的目的都是为了能够大量获得自己所需要的目的基因的表达产物,最好有生物活性,以便下一步的实验需要.3)原核表达载体一般只能在原核生物中表达外源基因,但有些穿梭载体可以分别在真核和原核生物中表达它们的表达元件.原核表达原核表达将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点：易于生长和控制；用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵；有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。但是，在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。

表达载体在基因工程中具有十分重要的作用，原核表达载体通常为质粒，典型的表达载体应具有以下几种元件：

（1）选择标志的编码序列；

（2）可控转录的启动子；

（3）转录调控序列(转录终止子，核糖体结合位点)；

（4）一个多限制酶切位点接头；

（5）宿主体内自主复制的序列。

原核表达一般程序如下：

获得目的基因－准备表达载体－将目的基因插入表达载体中（测序验证）－转化表达宿主菌－诱导靶蛋白的表达－表达蛋白的分析－扩增、纯化、进一步检测。

一、试剂准备

1、LB培养基。

2、100mMIPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：IPTG溶于100mlddH2O中,μm滤膜抽滤，-20℃保存。

二、操作步骤

（一）获得目的基因

1、通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR循环获得所需基因片段。

2、通过RT-PCR方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA，以mRNA为模板，逆转录形成cDNA第一链，以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。

（二）构建重组表达载体

1、载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。

2、PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入载体。

（三）获得含重组表达质粒的表达菌种

1、将连接产物转化大肠杆菌DH5α，根据重组载体的标志（抗Amp或蓝白斑）作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。

2、测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确,进入下步操作。否则应筛选更多克隆，重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。

3、以此重组质粒DNA转化表达宿主菌的感受态细胞。

（四）诱导表达

1、挑取含重组质粒的菌体单斑至2mlLB（含Amp50μg/ml）中37℃过夜培养。

2、按1∶50比例稀释过夜菌，一般将1ml菌加入到含50mlLB培养基的300ml培养瓶中,37℃震荡培养至OD600≌（最好，大约需3hr）。

3、取部分液体作为未诱导的对照组,余下的加入IPTG诱导剂至终浓度作为实验组,两组继续37℃震荡培养3hr。

4、分别取菌体1ml,离心12000g×30s收获沉淀，用100μl1%SDS重悬，混匀,70℃10min。

5、离心12000g×1min，取上清作为样品,可做SDS等分析。

三、注意事项

1、选择表达载体时，要根据所表达蛋白的最终应用考虑。如为方便纯化，可选择融合表达；如为获得天然蛋白，可选择非融合表达。

2、融合表达时在选择外源DNA同载体分子连接反应时，对转录和转译过程中密码结构的阅读不能发生干扰。

原核表达的原理与实验方案Time：2010-01-31AM09:32Author:bioerHits:388times一、\o"原核表达专题"原核表达的原理

1、E.coli表达系统

E.coli是重要的\o"原核表达专题"原核表达体系。在重组基因转化入E.coli菌株以后，通过温度的控制，诱导其在宿主菌内表达目的蛋白质，将表达样品进行SDS以检测表达蛋白质。

2、外源基因的诱导表达

提高外源基因表达水平的基本手段之一，就是将宿主菌的生长与外源基因的表达分成两个阶段，以减轻宿主菌的负荷。常用的有温度诱导和药物诱导。本实验采用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导外源基因表达。

不同的表达质粒表达方法并不完全相同，因启动子不同，诱导表达要根据具体情况而定。二、\o"原核表达专题"原核表达的材料

1、诱导表达材料

(1)LB（Luria-Bertani）)培养基

酵母膏(Yeastextract)

5g

蛋白胨(Peptone)

10g

NaCl

10g

琼脂(Agar)

1-2%

蒸馏水(Distilledwater)

1000ml

pH

适用范围：大肠杆菌

(2)IPTG贮备液：

2gIPTG溶于10mL蒸馏水中，0.22μm滤膜过滤除菌，分装成1mL/份，-20℃保存。

(3)l×凝胶电泳加样缓冲液：

50mmol/L

Tris-CI(pH6.8)

50mmol/L

DTT

2%

SDS（电泳级）

%溴酚蓝

10

%

甘油

2、大肠杆菌\o"包涵体的分离专题"包涵体的分离与蛋白纯化材料

1）酶溶法

（1）裂解缓冲液：

50mmol/L

Tris-CI(pH8.0)

1mmol/LEDTA

100mmol/LNaCI

（2）50mmol/L苯甲基磺酰氟（PMSF）。

（3）10mg/mL溶菌酶。

（4）脱氧胆酸。

（5）1mg/mLDNaseI。

2）超声破碎法

(1)TE缓冲液。

(2)2×SDS凝胶电泳加样缓冲液：

100mmol/L

Tris-HCI(pH8.0)

100mmol/L

DTT

4%SDS

%溴酚蓝

20%甘油三、实验方案

1、外源基因的诱导表达

(1)用适当的限制性内切核酸酶消化载体DNA和目的基因。

(2)按连接步骤连接目的基因和载体，并转化到相应的宿主菌。

(3)筛选出含重组子的转化菌落，提取质粒DNA作限制性内切核酸酶图谱，DNA序列测定，确定无误后进行下一步。

(4

)如果表达载体的原核启动子为PL启动子，则在30-32℃培养数小时，使培养液的OD600达，迅速使温度升至42℃继续培养3-5h；如果表达载体的原核启动子为tac等，则37℃培养细菌数小时达到对数生长期后加IPTG至终浓度为1mmol/L。继续培养3-5h。

(5

)取上述培养液1mL，1000g离心，1min，沉淀，加100μL聚丙烯酰胺凝胶电泳上样缓冲液后，作SDS检测。

2、大肠杆菌\o"包涵体的分离专题"包涵体的分离与蛋白质纯化

1）细菌的裂解

常用方法有：①高温珠磨法；②高压匀浆；③超声破碎法；④酶溶法；⑤化学渗透等。前三种方法属机械破碎法，并且方法①、②已在工业生产中得到应用，后三种方法在实验室研究中应用较为广泛。下面介绍酶溶法和超声破碎法的实验步骤。（1）酶溶法

常用的溶解酶有溶菌酶、β-1,3-葡聚糖酶、β-1,6-葡聚糖酶、蛋白酶、壳多糖酶、糖苷酶等。溶菌酶主要对细菌类有作用，而其他几种酶对酵母作用显著。主要步骤为：

①4℃，5000rpm离心，15min，收集诱导表达的细菌培②每克菌加8μLPMSF及80μL溶菌酶，搅拌20min；边搅拌边每克菌加4mg脱氧胆酸（在冷室中进行）。

③37℃，玻棒搅拌，溶液变得粘稠时每克菌加20μLDNaseI。室温放置至溶液不再粘稠。

（2）超声破碎法

声频为15-20kHz的超声波在高强度声能输入下可以进行细胞破碎，在处理少量样品时操作简便，液体量损失较少，同时还可对染色体DNA进行剪切，大大降低液体的粘稠度。

①收集1L诱导表达的工程菌，40℃，5000rpm离心，15min；弃上清，约每克湿菌加3mLTE缓冲液。

②按超声处理仪厂家提供的功能参数进行破菌；10000g离心，15min，分别收集上清液和沉淀。

③分别取少量上清和沉淀，加入等体积的2×凝胶电泳加样缓冲液，进行SDS。

注意事项：超声破碎与声频、声能、处理时间、细胞浓度、菌种类型等因素有关，应根据具体情况掌握；超声波破菌前，标本经3-4次冻溶后更容易破碎。

2）\o"包涵体的分离专题"包涵体的分离

蛋白质在细菌中的高水平表达，常形成相差显微镜下可见的细胞质颗粒，即为包涵体，经离心沉淀后可用Triton-X100/EDTA或尿素洗涤，若为获取可溶性的活性蛋白，须将洗涤过的包涵体重新溶解并进行重折叠。

（1）试剂与配制

①洗涤液I：

%TritonX-100

10mmol/L

EDTA(pH8.0)

溶于细胞裂解液中。

②2×凝胶电泳加样缓冲液。

（2）细胞裂解混合物12000g离心，15min,4℃；弃上清，沉淀用9×洗涤液l悬浮；室温放置5min;12000g离心15min,4℃；吸出上清，用100μL水重新悬浮沉淀；分别取10μL上清和重新悬浮的沉淀，加10μL2×凝胶电泳加样缓冲液，进行SDS。

3）包涵体的溶解和复性

（1）试剂与配制

①缓冲液I：

1mmol/LPMSF

8mol/L尿素

10mmol/LDTT

溶于前述裂解缓冲液中。

②缓冲液Ⅱ：

50mmol/LKH2PO4

1mmol/LEDTA(pH8.0)

50mmol/LNaCI

2mmol/L还原型谷胱甘肽

1mmol/L氧化型谷胱甘肽

③KOH和HCI

④2×凝胶电泳加样缓冲液。

（2）用100μL缓冲液I溶解包涵体；室温放置lh；加9×缓冲液Ⅱ，室温放置30min，用KOH调pH到；用HCI调至pH8.0，在室温放置至少30min；1000g四、注意事项

（1）不同的大肠杆菌表达载体带有不同的启动子和诱导成分。实验者必须根据特定系统和用途决定相应的实验方案。

（2）表达和检测时，应设置对照组，如转化载体和非诱导细胞。

（3）由于大肠杆菌中表达的重组蛋白质缺少哺乳动物细胞特异的翻译后加工，所以，其生物活性无法与天然蛋白质相提并论原核表达目录1定义2原核表达系统1定义2原核表达系统展开编辑本段1定义广义的原核表达，是指发生在原核生物内的基因表达。狭义的原核表达，常出现于生物工程中。是指通过基因克隆技术，将外源目的基因，通过构建表达载体并导入表达菌株的方法，使其在特定原核生物或细胞内表达。编辑本段2原核表达系统一个完整的表达系统通常包括配套的表达载体和表达菌株。如果是特殊的诱导表达还包括诱导剂，如果是融合表达还包括纯化系统或者Tag检测等等。选择表达系统通常要根据实验目的来考虑，比如表达量高低，目标蛋白的活性，表达产物的纯化方法等等。表达载体为了获得高水平的基因表达产物，人们通过综合考虑控制转录、翻译、蛋白质稳定性及向胞外分泌等诸多方面的因素，设计出了许多具有不同特点的表达载体，以满足表达不同性质、不同要求的目的基因的需要。通常关心的表达载体质粒上的元件包括：启动子、多克隆位点、终止密码、融合Tag（如果有的话）、复制子、筛选标记或报告基因等。复制子：通常表达载体都会选用高拷贝的复制子。pSC101类质粒是严谨方式复制，拷贝数低，pCoE1，pMBI(pUC)类的复制子的拷贝数高达500以上，是表达载体常用的。通常情况下质粒拷贝数和表达量是非线性的正相关，当然也不是越多越好，超过细胞的承受范围反而会损害细胞的生长。如果碰巧需要2个质粒共转化，就要考虑复制元是否相容的问题。筛选标记和报告基因：氨苄青霉素抗性是最常见的筛选标记，卡那霉素或者是新霉素次之，通常是另一个载体的筛选标记用。四环素，红霉素和氯霉素等已经日渐式微。抗性基因的选择要注意是否会对研究对象产生干扰，比如代谢研究中要留意抗性基因编码的酶是否和代谢物相互作用。在表达筛选中要注意的问题应该就是LB倒板前加抗生素的温度，温度过高容易导致抗生素失效。对于做表达来说，如果不是要研究启动子的强弱，通常比较少关心或者用到报告基因吧。绿色荧光蛋白是最常用的报告基因了。其他还有半乳糖苷酶、荧光素酶等。一些融合表达Tag也有报告基因的功能。启动子：启动子的强弱是对表达量有决定性影响的因素之一。从转录模式上看有组成型表达和诱导调控型表达。lac和Tac，PL和PR，T7是最常用的启动子。终止子：转录终止子对外源基因在大肠杆菌中的高效表达有重要作用，即控制转录的RNA长度提高稳定性，避免质粒上异常表达导致质粒稳定性下降。放在启动子上游的转录终止子还可以防止其他启动子的通读，降低本底。转录终止子有两类，Rho因子作用下使转录终止mRNA和根据模版上的对称序列形成发夹结构而终止mRNA。常见的是rrnBrRNA操纵子的T1T2串连转录终止子。核糖体结合位点：启动子下游从转录起始位点开始延伸的一段碱基序列，其中能与rRNA16S亚基3'端互补的SD序列对形成翻译起始复合物是必需的，多数载体启动子下游都有SD序列，也有些载体没有。表达菌株表达菌株是我们往往最容易忽视的一点。目前绝大多数重要的目的基因都是在大肠杆菌中表达的。不同的表达载体对应有不同的表达菌株，一些特别设计的菌株更有助于解决一些表达难题。yhbdxs:实验思路是这样的，将目的基因连接到含有GFP的表达载体上，得到GFP和目的基因的融合蛋白，再纯化。我现在还没有选定用哪个载体，请你们帮帮我，太多不清楚的地方了。:通常在进行原核表达实验时，选择使用pET系列载体居多。但是pET系列载体不带有GFP基因，其上的HisTag标签是专门用于分离纯化的。通常情况下，目的基因与GFP蛋白融合，用于真核表达的实验较多。yhbdxs:谢谢的回答，我爱！！希望给我带来好运气！由于时间紧迫，真核表达周期长，只能选择原核表达了。1、用clontech的pGFP载体可以做原核表达吗2、先把目标基因连接到GFP载体上，切下来，连接到pET载体上，可以吗3、为什么pET系列载体不带有GFP基因啊:clontech的pGFP载体是原核表达载体，应该符合你的实验要求，但是我没有使用过，因此对其具体操作注意不是很了解。如果你一定要求使用pET载体表达带有GFP报告基因的目的基因，在进行载体构建时，加入GFP报告基因与目的基因融合应该是可行的。不过这样构建起来也是挺麻烦的，不如使用商品化载体方便些。yhbdxs:在进行载体构建时，加入GFP报告基因与目的基因融合应该是可行的。如果这样的话，是不是要用到一个辅助载体啊，就是说我一共要用三个载体：目的基因先克隆到T载体送去测序，然后亚克隆到含有GFP的载体融合，最后再把融合基因连接到pET载体上，进行表达，是这样的思路吗我很急，一直在这里等着看结果呢，谢谢:我认为在进行载体构建时，需要根据你的实验要求选择实验步骤：1.如果在进行目的基因与GFP基因融合时，中间有酶切位点可以满足你的实验要求，可以：1).将目的基因扩增后克隆至中间载体上测序。（目的基因去除终止密码子）2).将1).测序好的片段通过酶切位点克隆至pET载体上。3).如果你现有的GFP基因两侧的酶切位点满足已克隆目的基因的pET载体MCS的要求，可以直接将GFP基因克隆至2).构建好的载体上。但是这样在目的基因与GFP基因间会存在有酶切位点，至少一个。并且在进行GFP基因克隆时，需要严格考查读码框的准确性，不可以移码。2.如果在进行目的基因与GFP基因融合时，中间必须紧密相连，不允许有其它碱基，可以：1).将目的基因扩增后克隆至中间载体上测序。（目的基因去除终止密码子）2).克隆GFP基因，T载体即可。3).使用1)./2).质粒为模板，设计引物搭链扩增目的基因与GFP基因，两侧加入与pETMCS相匹配的酶切位点。并克隆至T载体，测序。4).将3).测序好的片段通过酶切位点克隆至pET载体上。3.如果在进行目的基因与GFP基因融合表达后，你需要进一步将GFP融合蛋白切除，那么依据2.所示步骤，在进行第3).步搭链扩增时，还需要在搭链引物上设计蛋白酶识别位点，其余相同。以便在进行蛋白表达后，可以使用蛋白酶将GFP融合蛋白切除。具体的蛋白酶识别位点设计情况，你可以参照pETVectormanual.乱七八糟的，希望可以对你的实验有所帮助。yhbdxs:今天下午和老板商量了一下，最终决定用clontech的pGFP载体，虽然还没有把握，现在我只能祈求自己好运气了！wangjiali:你好：为什么不直接连在载体上酶切测序，还要连接在中间载体上测序:目的基因在进行扩增时，有可能会产生突变。将目的基因克隆至中间载体后，如果测序发现有突变，进行突变修复时比较容易操作。而且PCR产物进行TA克隆的难度远比酶切后克隆至表达载体的难度要小，阳性克隆率高，也比较有利于实验。pET原核表达金标准作者：转载：admin来源：生物吧点击数：5975更新时间：2008年03月23日pET

载体中，目标基因克隆到

T7

噬菌体强转录和翻译信号控制之下，并通过在宿主细胞提供

T7

RNA

聚合酶来诱导表达。

Novagen

的

pET

系统不断扩大，提供了用于表达的新技术和选择，目前共包括

36

种载体类型、

15

种不同宿主菌和设计用于有效检测和纯化目标蛋白的许多其它相关产品。

优点

·

是原核蛋白表达引用最多的系统

·

在任何大肠杆菌表达系统中，基础表达水平最低

·

真正的调节表达水平的“变阻器”控制

·

提供各种不同融合标签和表达系统配置

·

可溶性蛋白生产、二硫键形成、蛋白外运和多肽生产等专用载体和宿主菌

·

许多载体以

LIC

载体试剂盒提供，用于迅速定向克隆

PCR

产物

·

许多宿主菌株以感受态细胞形式提供，可立即用于转化

阳性

pFORCE

TM

克隆系统具有高效克隆

PCR

产物、阳性选择重组体和高水平表达目标蛋白等特点。

pET

系统概述

pET

系统是在大肠杆菌中克隆和表达重组蛋白的最强大系统。根据最初由

Studier

等开发的

T7

启动子驱动系统，

Novagen

的

pET

系统已用于表达成千上万种不同蛋白。

控制基础表达水平

pET

系统提供

6

种载体

-

宿主菌组合，能够调节基础表达水平以优化目标基因的表达。没有单一策略或条件适用于所有目标蛋白，所以进行优化选择是必要的。

宿主菌株

质粒在非表达宿主菌中构建完成后，通常转化到一个带有

T7

RNA

聚合酶基因的宿主菌（

λ

DE3

溶原菌）中表达目标蛋白。在

λ

DE3

溶原菌中，

T7

RNA

聚合酶基因由

lacUV5

启动子控制。未诱导时便有一定程度转录，因此适合于表达其产物对宿主细胞生长无毒害作用的一些基因。而宿主菌带有

pLysS

和

pLyE

时调控会更严紧。

pLys

质粒编码

T7

溶菌酶，它是

T7

RNA

聚合酶的天然抑制物，因此可降低其在未诱导细胞中转录目标基因的能力。

pLysS

宿主菌产生低量

T7

溶菌酶，而

pLysE

宿主菌产生更多酶，因此是最严紧控制的

λ

DE3

溶原菌。

有

11

种不同DE3

溶原化宿主菌。使用最广泛的为

BL21

及其衍生菌株，它的优点在于缺失

lon

和

ompT

蛋白酶。

B834

菌株为甲硫氨酸营养缺陷型，因此可用

35

S-

甲硫氨酸和硒代甲硫氨酸对目标蛋白进行高特异活性标记。

BLR

为

recA

-

衍生菌株，改善了质粒单体产量，有助于稳定含有重复序列的目标质粒。两个硫氧还蛋白还原酶

(

trxB

)

突变菌株

(AD494,BL21

trxB

)

，有利于大肠杆菌胞浆中二硫键形成。

Origami

TM

和

OrigamiB

菌株为

trxB/gor

双突变，这两个酶是主要还原途径的关键酶。

Origami

和

OrigamiB

宿主菌的主要优点是能形成正确折迭的含有二硫键的蛋白。新的

Rosetta

TM

菌株补充了四种大肠杆菌稀有密码子的

tRNA

，改善了由于密码子使用频率不同而引起的一些真核蛋白低表达。其它菌株背景包括

K-12

菌株

HMS174

和

NovaBlue

，象

BLR

一样为

recA

-

。这些菌株可稳定表达其产物可能导致

DE3

噬菌体丢失的某些目标基因。由于存在

F

附加体编码的高亲和力

lacIq

阻遏蛋白，

NovaBlue

为一个有用的严紧型宿主菌。此外，

Novagen

提供了

λ

DE3

溶原化试剂盒，用于制备其它遗传背景的新表达宿主菌。表达高毒性基因或制备新的

λ

DE3

溶原菌的另一替代方法是通过

l

CE6

感染提供

T7

RNA

聚合酶。虽然不如用

IPTG

诱导

λ

DE3

溶原菌方便，这种策略也被优先用于一些应用中。

高严紧性

T7

lac

启动子

除了在宿主菌水平选择三种基本的表达严紧性，

pET

系统中

T7

启动子本身提供了两种不同的严紧性选择：普通

T7

启动子和

T7

lac

启动子。

T7

lac

启动子在启动子区下游

17bp

处含有一个

25bp

的

lac

操纵序列。该位点结合

lac

阻遏蛋白能够有效降低

T7

RNA

聚合酶的转录，这样提供了在

λ

DE3

溶原菌中抑制基础表达的第二种基于

lacI

的机制（除了抑制

lacUV5

）。含

T7

lac

启动子的

pET

质粒还具有它们自己的

lacI

，确保足够的阻遏蛋白结合到操纵基因位点上。<BR<p>在实际应用中，为了获得最高产量的蛋白，通常应该测试多种不同的载体

/

宿主菌组合。

控制诱导的表达水平

在许多情况下，表达活性可溶性最好的蛋白依赖于宿主细胞的背景、培养条件和合适的载体配置。通常，目标蛋白活性最高的条件与产量最高的条件不一致。除了根据载体

/

宿主菌组合控制

T7

RNA

聚合酶的基础表达提供不同严紧性，

pET

系统还根据诱导物（

IPTG

）浓度，对目标蛋白表达提供了真正的“变阻器”控制。

Tuner

和

OrigamiB

宿主菌的

lacY

突变使这种控制成为可能。

选择

pET

载体

所有的

pET

载体均来自

pBR322

，但彼此间先导序列、表达信号、融合标签、相关限制性位点和其它特点有所不同。有两大类

pET

质粒，即转录载体和翻译载体：

转录载体（包括

pET-21

、

pET-23

和

pET-24

）表达目标

RNA

，但不提供翻译信号。它们用于从自身带有细菌翻译信号的目标基因表达蛋白。（注意：转录载体通过命名后面的一个缺失字母后缀加以区分）

翻译载体含有设计用于蛋白表达的有效翻译起始信号。许多载体在读码框

a

、

b

和

c

中带有克隆位点，分别对应于

BamH

I

位点的

GGA

、

GAT

和

ATC

三联体。

选择要点

选择用于表达的

pET

载体通常涉及多种因素。考虑以下三个主要因素：

·

所表达蛋白的用途

·

所表达蛋白的已知信息

·

克隆策略

pET

载体表达的蛋白用途各种各样。例如，表达量为分析级的蛋白可用于活性研究、突变体筛选和定性、筛选配体相互作用和抗原制备。大量活性蛋白用于结构研究、试剂或亲和基质制备。许多载体适合表达用于筛选或抗原制备的分析量蛋白，然而只有载体、宿主菌和培养条件组合十分适宜才可能用于大量纯化。如果需要活性蛋白连续高产，应该试验多种载体、宿主菌和培养条件组合以找到最优化结果。

任何关于目标蛋白的已知信息都有助于载体选择。例如，一些蛋白的活性要求一个或两个末端没有外源序列。许多

pET

载体能够克隆非融合序列，然而如果特定翻译起始序列不能在大肠杆菌中有效利用，表达水平可能受影响。在这些情况下，常可用有效表达的氨基末端序列构建融合蛋白，然后在纯化后用位点特异性蛋白酶消化去除融合序列。

LIC

（连接非依赖的克隆）策略对这种方法特别有用，因为克隆操作通过肠激酶和因子

Xa

能够去除所有氨基端载体编码序列。

由于限制性位点和读码框相容性的需要，克隆策略也会影响载体选择。由于许多

pET

载体具有共同的限制性位点配置，通常可能将一次制备的目标基因克隆到几个载体中。采

PCR

克隆策略时则有不同的考虑。

LIC

载体试剂盒推荐用于此目的，可通过

PCR

制备插入片段，而不需要限制性消化载体或插入片段。

溶解性和细胞定位

考虑了目标蛋白的应用和克隆策略，还应该确定目标蛋白的细胞定位和溶解性，这一点十分重要。在许多实际应用中常希望表达可溶的活性蛋白。

特定目标蛋白的溶解性取决于多种因素，包括各自的蛋白序列。在许多情况下，溶解性不是有或无的现象，载体、宿主菌和培养条件可被用来增加或减少获得的可溶或不可溶形式的比例。

PET-32

载体系列使目标序列与通常能够增加可溶性蛋白比例的硫氧还蛋白

)

融合。新推出的

系列具有通过大量系统筛选而得到的一种过量表达时具有极高溶解性的大肠杆菌蛋白

融合伴侣，从而进一步提高了目标蛋白的可溶性。此外，

trxB

突变株

AD494

和

BL21

trxB

，或

trxB/gor

OrigamiTM

和

OrigamiB

菌株可用于在胞浆中形成许多真核蛋白正确折迭和活性所要求的二硫键。低温诱导（

15

-25

°

C

）也可增加可溶性目标蛋白的比例。

获得可溶性活性蛋白的另一策略是使蛋白外泌到胞外周质中，为折迭和二硫键形成有更适宜的环境。为了达到这一目的，通常使用带信号肽的载体。

一些纯化策略可以优化胞质中不溶性包涵体的产量。抽提包涵体并溶解，然后目标蛋白在体外重新折迭

(

如使用

Novagen

的蛋白折迭试剂盒

)

。该过程通常产生高产量初始蛋白并防止宿主细胞中的蛋白降解。然而，重新折迭成活性蛋白的效率随不同蛋白变化很大，可能相当低。

pET-31b

（

+

）载体专为产生不可溶融合蛋白而设计，提供了生产小蛋白和多肽的有效方法。满足不同需要的融合标签

如果融合序列不影响应用，生产带有

、

a

、

a

和

a

的融合蛋白会很方便后续操作，并易于通过蛋白杂交检测。这些多肽（融合序列很小），它们的检测试剂极特异和灵敏。通过使用相应树脂和缓冲液试剂盒，

、

和

序列可用于亲和纯化。

使用

和

分析试剂盒可对粗提或纯化的融合蛋白准确定量。采用一种新颖底物的

FRETWorks

分析试剂盒可通过荧光检测到少于

1fmol

的融合蛋白。

a

序列作为纯化蛋白的融合伴侣非常有用，尤其对那些以包涵体形式表达的蛋白来说，它可以使亲和纯化可在溶解蛋白的完全变性条件下进行。

a

在低费用亲和纯化中非常有用。它们也特别适用于重新折迭（特别是带有

CBD

clos

.Tag

a

序列的

pET-34b

（

+

）和

35b

（

+

））。因为只有正确重新折迭的

CBDs

结合到纤维素基质上，

CBIND

亲和纯化步骤能够从制备物中去除不正确折迭的分子。任何标签可用于固定目标蛋白，但由于

序列的低非特异性结合以及与纤维素基质的生物相容性，使它更适合用于这一目的。

、

和

序列用来增加其融合伴侣的溶解性。

和

载体与利于在胞浆中形成二硫键的

Origami

宿主菌相容。

各种融合标签和相应

pET

载体见列表。一些

pET

载体带有数个***的融合标签，作为

5'

融合伴侣。此外，许多载体通过目标基因序列符合读码框的通读而表达末端带有不同多肽标签的融合蛋白。使用在

5'

标签和目标序列之间含有蛋白酶切割位点（凝血酶、因子

Xa

和肠激酶）的载体，可以在纯化后选择性去除一个或多个标签。

pET-30

Ek/LIC

、

pET-32

Ek/LIC

、

pET-34

Ek/LIC

和

pET-36

Ek/LIC

是细胞定位和亲和标签配置良好的代表。

pET

Ek/LIC

载体

Combo

试剂盒包括所有

4

种即用型载体，可直接用于构建数种目标基因构型。

pET

NusA

融合系统

在大肠杆菌中生产可溶性活性蛋白

新推出的

pET

NusA

融合系统设计用于克隆和高水平表达与

495aa

NusA

（

）蛋白融合的多肽序列。对数据库中

4000

个以上蛋白进行可溶性建模，

NusA

蛋白被确认为具有最高的可溶性。在用四种不同

NusA

融合蛋白进行的试验中，大于

85%

的表达蛋白都是可溶的。

载体含有

融合伴侣并与

trx/gor

突变体

Origami

和

OrigamiB

菌株相容，有利于在胞浆中形成二硫键。使用

载体和这些

trx/gor

宿主菌组合可能获得二硫键结合的蛋白。

优点

·

高可溶性的

N-

末端

融合伴侣

·

上游

a

、

和可选择的

C-

末端

a

、

融合标签

·

凝血酶和肠激酶切割位点

·

多克隆位点位于所有读码框中

·

与

AD494

和

Origami

宿主菌株相容，可促进表达蛋白的正确折迭

pET

宿主菌株感受态细胞

所有

pET

系统宿主菌以预测试的感受态细胞形式提供，可立即用于转化。

（

DE3

）指宿主为

λ

DE3

溶原菌，其染色体上带有一拷贝由

lacUV5

启动子控制的

T7

RNA

聚合酶基因。这类菌株适用于从克隆到

pET

载体的目标基因生产蛋白。命名为

pLysS

和

pLysE

的宿主菌带有编码

T7

溶菌酶（为

T7

RNA

聚合酶的天然抑制物）的

pET

相容性质粒。带有

pLysS

的细胞产生少量溶菌酶，而

pLysE

宿主菌产生更大量酶。这些菌株用于在诱导前抑制

T7

RNA

聚合酶的基础表达，这样可以稳定编码影响细胞生长和活力的目标蛋白的

pET

重组体。带有

pLacI

的宿主菌产生额外的抑制

pETBlue

和

pTriEx

载体基础表达的

lac

阻遏蛋白。

λ

DE3

溶原化试剂盒用于制备其它遗传背景的新表达宿主菌。

<BR<p>vAD494

菌株为硫氧还蛋白还原酶

(

trxB

)

突变菌株，能够在胞浆内形成二硫键，提供了生产正确折迭的活性蛋白的潜力。

TrxB

突变可用卡那霉素选择，因此该菌株建议用于带氨苄抗性标记

bla

的质粒。

B834

为

BL21

的亲本菌株。这些蛋白酶缺陷宿主菌为甲硫氨酸营养缺陷型，可用

35

S-

甲硫氨酸和硒代甲硫氨酸对目标蛋白进行高特异活性标记，从而用于结晶学研究。

BL21

应用最广的宿主菌来源，具有

lon

和

ompT

蛋白酶缺陷的优点。

BL21

TrxB

菌株在蛋白酶缺陷

BL21

背景上具有与

AD494

菌株相同的硫氧还蛋白还原酶突变

(

trxB

)

。由于

trxB

宿主有利于胞浆内二硫键形成，它们的使用可增加正确折迭的蛋白组分。

TrxB

突变可用卡那霉素选择，因此该菌株建议用于带氨苄抗性标记

bla

的质粒。

BLR

为

BL21

的

recA

-

衍生菌株，能够改善质粒单体产量，有助于稳定含有重复序列或其产物能够引起

DE3

噬菌体丢失的目标质粒。

HMS174

菌株在

K-12

背景上提供了

recA

突变。与

BLR

一样，这些菌株能够稳定其产物能够引起

DE3

噬菌体丢失的某些目标基因。

NovaBlue

适合

用作初始克隆宿主菌的

K-12

菌株，具有高转化效率、蓝

/

白斑筛选能力（与合适质粒）和导致优质质粒

DNA

高产的

recA

endA

突变。由于存在

F

附加体编码的

lacI

q

阻遏蛋白，

NovaBlue

的

DE3

溶原菌是一个非常有用的严紧型宿主菌。

Origami

为

K-12

衍生的宿主菌，硫氧还蛋白还原酶突变

(

trxB

)

和谷胱甘肽还原酶

(

gor

)

基因均为突变，能够大大增强胞浆内二硫键的形成。研究表明即使总体表达水平相似，

Origami

（

DE3

）表达的活性蛋白比其它宿主菌高

10

倍以上。

Origami

宿主菌与氨苄抗性质粒相容，可用于

pET-32

载体，硫氧还蛋白标签能够进一步增强在胞浆内形成二硫键。

TrxB

和

gor

突变可分别用卡那霉素和四环素选择，因此该菌株建议用于带氨苄抗性标记

bla

的

pET

质粒。

Origami

B

宿主菌来源于

BL21

lacZY

突变株，还带有与原始

Origami

菌株相同的

TrxB

/

gor

突变。

Origami

B

菌株集

BL21

、

Tuner

和

Origami

宿主菌的优点于一体。

TrxB

和

gor

突变可分别用卡那霉素和四环素选择，因此该菌株建议用于带氨苄抗性标记

bla

的

pET

质粒。

Rosetta

宿主菌从

BL21

衍生而来，可增强带有大肠杆菌稀有密码子的真核蛋白的表达。该菌株通过一个相容性氯霉素抗性质粒补充密码子

AUA

、

AGG

、

AGA

、

CUA

、

CCC

和

GGA

的

tRNAs

。这样

Rosetta

菌株提供了“万能”的翻译，从而避免因大肠杆菌密码子使用频率导致的表达限制。

tRNA

基因由它们的天然启动子驱动。在

Rosetta

（

DE3

）

pLysS

和

Rosetta

（

DE3

）

pLacI

中，稀有

tRNA

基因存在于分别带有

T7

溶菌酶和

lac

阻遏基因的同一质粒上。

<BR<p>Tuner

菌株为

BL21

的

lacZY

缺失突变株，能够调整培养物中所有细胞的蛋白表达水平。

lac

通透酶（

lacY

）突变使得

IPTG

均匀进入群体所有细胞，从而具有浓度依赖、水平均一的诱导表达。通过调整

IPTG

浓度，表达可从极低水平调节到极强、完全诱导的表达水平（通常与

pET

载体相关）。低水平表达有时可能增强难表达蛋白的溶解性和活性。

Tuner

（

DE3

）

pLacI

菌株与

pETBlue

和

pTriEx

载体的表达相容。

这个帖子来源于丁香园

由一程山水一程歌总结

eeflying

：原核表达系统中，哪种载体最好

原核表达没有最好，可以说一般都是在碰，

和你要表达蛋白的性质有关，也和你表达后的用途，及因此而选择的表达策略有关。

比如，

１。你是否介意有亲和标签，亲和纯化当然纯化相对容易，但有时亲和标签的存在会影响蛋白的功能，

２。如果用亲和标签，用什么亲和纯化策略，his

或GSH还是染料抑或是IgG-ProteinA亲和，LAB的IMPAC-TWIN,还是别的如转铁蛋白等，亲和层析的策略也有很多，

３。最终产物是否有必要将亲和标签去掉，如用蛋白酶切掉标签，或

IMPAC-TWIN会自己切掉，用因子X切掉HIS,

4。表达的部位，是可溶性表达还是包涵体表达，是周质表达还是分泌表达还是分泌表达。

５。是否加入开关诱导、或是加入IPTG诱导噬菌体T7系统。

６。你表达的蛋白质是否会与细菌内某些蛋白相互作用而致表达失败。

７。如果不用亲和标签，纯化用什么方法纯化

８。即使都考虑全了，表达也未必成功，换载体是很常见的是。

９。载体选好后，表达条件的优化，如培养温度，培养时间，IPTG浓度

等，我们一般在这部用正交设计或析因设计决定。

１０。蛋白纯化条件的优化，用均匀设计或球面设计或正交设计作曲线拟合，通过导数求极值的方法优化蛋白纯化条件。

这些问题是相互关联的，在实践中可得有一段时间去摸索了。

YONG:原核表达系统中，哪种载体最好

载体没有最好，看哪一种最合适你的实验目的。

这几年新发展的载体一般具有下列特点的一个或多个：

1）更多的融合标签选择（提供多种亲和纯化方便）

2）严紧的表达调控，更低的渗漏表达

3）分子伴侣蛋白，促进折叠和可溶性表达

此外，具有更好的质粒稳定性并能够纠正遗传密码偏爱的新的蛋白酶缺陷的宿主细胞也是一个很好的工具。

最新的不一定是最好的，pBV220经常可以给出不错的表达，虽然多半是包含体。

YONG:关于表达载体不同的载体的特点不同，主要的差别有启动子类型，质粒拷贝数等，基因本身的因素基因5’非编码区的二极结构，密码子的偏爱性等，宿主菌的特点也很重要（BL21是蛋白酶缺陷的菌株），融合表达策略也有利于顺利表达外源蛋白。这些就决定了对某一个特定的基因而言，并非所有的表达载体都适合。现在还没有谁可以用大肠杆菌成功表达每一个基因，尤其是使用指定的表达系统更是不可能。根据研究的目的以及基因和载体的特点选择表达系统，说说容易，做起来很难。

SDS所显示的不表达很多情况下是低表达，尤其是当目的蛋白迁移率与菌体中某种丰富蛋白一致时，不高的表达带常被遮盖。Western

blotting的灵敏度高，可以用来检测很低的表达。

对于某些研究来说，表达是为了在细胞内提供某种功能，不需要高表达；更多的情况是把大肠杆菌作为制备重组蛋白的细胞工厂，此时表达量具有重要意义，低表达为蛋白纯化带来困难，对于某些研究或开发来说，低表达意义不大。

当然，通过western

blotting检测可以排除一些基因表达中的不确定或待确定因素，而且某些时候即使是高表达，western

blotting也是蛋白定性的重要指标。

YONG:请教-pET表达

我试着说一下：

1）如何获得非融合高效表达

高效的非融合表达很多情况下是大肠杆菌表达最愿意看到的结果，如果是可溶性的，可能会让大部分研究者更加兴奋。但理想和现实是有差距的。凭心而论，你做的还是不错的，毕竟看到了高效表达，虽然是包含体，虽然信号肽的切割情况不明，毕竟你可以拿到东西了。可以试一下包含体的复性和纯化，测测活吧！否定一个信心苦苦得出的结果要慎重呀！

下面讨论一下如