第4部分分子生物学诊断技术进展课件

分子生物学诊断技术进展张正北京大学人民医院1分子生物学诊断技术进展1主要内容：分子生物学诊断技术在病原学检测中的应用简单介绍实验原理以PCR、荧光实时定量PCR、NASBA为例分子诊断技术在以下病原研究的应用进展乙型肝炎丙型肝炎结核分枝杆菌2主要内容：分子生物学诊断技术在病原学检测中的应用2病原学检测常用的实验室技术细胞培养与鉴定（“金标准”）、动物实验血清学、免疫学诊断技术电镜技术分子生物学诊断技术3病原学检测常用的实验室技术细胞培养与鉴定（“金标准”）、动物分子生物学诊断技术方法简介1、主体技术具体方法举例循环扩增PCR（聚合酶链反应）Real-timePCR,RT-PCR，巢式PCR，复合PCRPCR-ELISA，微孔板杂交，荧光探针标记法LCR（连接酶链反应）恒温NASBA（依赖核酸序列的扩增，主要用于RNA）SDA（链置换扩增术）CPT（环状探针技术）bDNA（枝链核酸信号放大系统）杂交捕获（如：检测HPV-DNA的试剂盒）4分子生物学诊断技术方法简介1、主体技术具体方法举例循分子诊断技术方法简介2、多标靶同时检测多重PCR毛细管电泳以测序分析为基础的检测技术5分子诊断技术方法简介2、多标靶同时检测5分子诊断技术方法简介3、核酸杂交DNA荧光原位杂交（FISH）将标记的探针直接原位杂交到染色体或DNA纤维切片上，再用与荧光素分子偶联的单克隆抗体与探针分子特异性结合来检测DNA序列在染色体或DNA纤维上的定位。

线性探针分析法（LiPA）杂交保护分析法（HPA）4、质谱利用色、质谱结合PCR技术6分子诊断技术方法简介3、核酸杂交6分子诊断的功能及扩展病原的诊断和鉴别诊断病原分型病毒载量监测---个体化治疗的依据疗效及预后标志其他：病原感染中发生、发展各阶段7分子诊断的功能及扩展7分子诊断的功能及扩展疾病分型及意义例如：HPV（30/100）高危---16，18，31，45低危---6，118分子诊断的功能及扩展疾病分型及意义8分子诊断的功能及扩展病毒载量与治疗例1.---北京地坛医院谢尧提供9分子诊断的功能及扩展病毒载量与治疗---北京地坛医院谢尧提分子诊断的功能及扩展病毒载量与治疗例2. HBV---干扰素 HBV<100pg/mL11/30阴转 HBV>100pg/mL1/30阴转 (HBeAgHBeAb)10分子诊断的功能及扩展病毒载量与治疗10分子诊断的功能及扩展病毒载量与治疗例3. HIV病毒载量与传播 15127人流行病学调查415对伴侣 30个月 HIV阳转22%（90/415） 51人RNA<1500copies/mL全阴11分子诊断的功能及扩展病毒载量与治疗11分子诊断的功能及扩展病毒载量与治疗例4. 血浆EBV载量与鼻咽癌复发 15个二年持续缓解：0copy/mL 10个复发： 32250copies/mL 17个随访：临床恶化前半年病毒载量升高12分子诊断的功能及扩展病毒载量与治疗12耐药病原的分子诊断WHO：人类死亡1/3是长期用药的毒副作用HBV的YMDD变异HIV耐药13耐药病原的分子诊断13血制品筛查300余万的血清阴性样品，分子生物学复测：HBV：47HCV：10HIV-1：2-2001年剑桥资料

HIV-1血清阴性而RNA阳性0.2-6.6%-Am.J.ChinAthol.200014血制品筛查300余万的血清阴性样品，分子生物学复测：14在基础研究领域中的应用；遗传病的基因诊断和产前基因诊断： 如血友病、地中海贫血等肿瘤基因和肿瘤标志物表达(mRNA)的检测；骨髓移植、器官移植供体配型选择；法医学、动植物学、古人类学、古生物学；与疾病相关的各种蛋白（细胞因子、酶、激素、受体）的基因表达的检测；药物基因组学、耐药基因的检测，等等分子生物学技术在其它领域的应用15在基础研究领域中的应用；分子生物学技术在其它领域的应用15简单介绍实验原理PCR

(PolymeraseChainReaction,聚合酶链反应)

荧光实时定量PCR（realtimePCR）NASBA（依赖核酸序列的扩增）16简单介绍实验原理PCR

(PolymeraseChainPCR原理:实质就是体外基因复制技术Mg2+dCTPdGTPdUTPdATPTaqDNA聚合酶AmpErasePrimer靶序列加热变性95°C靶序列引物退火55°C引物延伸72°C17PCR原理:实质就是体外基因复制技术Mg2+dCTPdGTPPCR循环第一步–加热变性靶序列靶序列 从外周血白细胞或绒毛、羊水细胞提取的DNA约1ug，在含有适当缓冲液、引物、dNTPs（dATP、dCTP、dGTP及dTTP）等的反应混合物中，在94℃下热变性1-4分钟，使之解为单链。18PCR循环靶序列靶序列 从外周血白细胞或绒毛、羊水细胞提PCR循环第二步–引物与靶序列退火靶序列靶序列Primer1Primer2BiotinBiotin5’3’5’5’3’5’3’3’引物与解为单链的DNA上互补序列杂交在一起，称之为退火。55℃左右19PCR循环靶序列靶序列Primer1Primer2BiPCR循环第三步-引物延伸靶序列靶序列Primer1Primer2BiotinBiotin5’3’5’5’3’5’3’3’TaqDNAPolymerase在DNA聚合酶催化作用下，以dNTPs为原料（底物），从引物的3’端A开始,沿着5’→3’的方向，合成每条模板的互补链，此称引物延伸。72℃左右20PCR循环靶序列靶序列Primer1Primer2B第1个PCR循环完成后靶序列靶序列BiotinBiotin21第1个PCR循环完成后靶序列靶序列BiotinBioti30次循环后靶序列扩增的数量No.of No.AmpliconCycles CopiesofTarget1 22 43 84 165 326 6420 1,048,57630 1,073,741,8241cycle=2Amplicon2cycle=4Amplicon3cycle=8Amplicon4cycle=16Amplicon5cycle=32Amplicon6cycle=64Amplicon7cycle=128Amplicon2230次循环后靶序列扩增的数量No.of No.Ampli5’3’RQ探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，所以检测不到荧光，此种现象称为荧光共振能量转移。荧光PCR原理–TaqManTM技术λ235’3’RQ探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收5’3’5’3’5’3’RQExtensionStep5’3’1.StrandDisplacementTaq3’QR5’5’3’3’QTaqR5’2.Cleavage3.PolymerizationComplete5’3’QTaqR3’5’4.Detection5’3’3’QTaqR5’lR荧光PCR原理–TaqManTM技术245’3’5’3’5’3’RQExtensionStep5’定量PCR测定的是扩增的指数扩增期;定性PCR测定的是扩增的终点（平台期）定量PCR与定性PCR测定的区别25定量PCR测定的是扩增的指数扩增期;定量PCR与定性PCR测市场上常见的实时荧光PCR仪罗氏LightcyclerMJopticon2伯乐icyclerABI7000杭州博日（原大和）linegene26市场上常见的实时荧光PCR仪罗氏LightcyclerMJ临床标本核酸提取技术NASBA扩增ECL-化学发光标记检测NASBA扩增+分子灯塔检测扩增过程中“分子灯塔”即时同相检测方法1-NucliSensECL方法2-NucliSensEasyQ加入裂解缓冲液和内置标准NASBA测定原理27临床标本核酸提取技术NASBA扩增ECL-化学发光标记检测NASBA扩增原理引物1逆转录酶RNaseH引物2逆转录酶T7RNA聚合酶引物2逆转录酶逆转录酶RNaseH引物1线性循环扩增循环28NASBA扩增原理引物1逆转录酶RNaseH逆转录酶T7NASBA和

PCR

的不同NASBA扩增目标为RNA同温扩增连续扩增扩增物为单链RNA引物次序不包含於最终产物中PCR扩增目标为DNA温度循环扩增循环扩增扩增物为双链DNA引物次序包含於最终产物中

29NASBA和PCR的不同NASBAPCR29乙型肝炎检测标志物：HBsAg，抗-HBs,HBeAg，抗-Hbe,抗HBc(IgG,IgM),HBV-DNADane颗粒（完整的病毒）形态乙型肝炎的分子诊断30乙型肝炎检测标志物：Dane颗粒（完整的病毒）形态乙型肝炎的乙型肝炎的分子诊断1.重要性全球20亿人感染慢性3.5亿人中国、东南亚、非洲50％肝硬化，70-90％肝癌7-30％携带者感染变异体31乙型肝炎的分子诊断312.HBV基因型与血清型关系及流行病学分布基因型与血清型不完全一致临床突变率不同有地域分布特点乙型肝炎的分子诊断32乙型肝炎的分子诊断32表1：基因型血清学亚型基因长度(nt)临床突变率主要流行地域PC*(G1896A)BCP**(1762/1764)Aadw2ayw132216.5％（少）C185845％（常）西欧、北欧、北美、中非、印度Badw2ayw1321550％（常）T185816％东南亚、中国、日本Cayr;adrq+;Adrq-;adr;adw2321550％（常）T1858或C185858％（常）东南亚、中国、日本、澳洲、美国Dayw2;ayw3;ayw4318243%(常）T185812％（低）地中海、俄罗斯、印度、美国33表1：基因型基因长度临床突变率PC*BCP**Aadw232表1(续）:基因型血清学亚型基因长度(nt)临床突变率主要流行地域PC*(G1896A)BCP**(1762/1764)Eayw4321227％（中）7％（低）西非Fayw4;adw2;Adw4q-321516％（少）C1858未定中美、南美、波利尼西亚GAdw23248100％（高）未定中美、美国、法国、德国Hadw43215未定未定中美、南美、美国PC**:前核心BCP**:基本核心启动子（科华生物2004.07.21）34表1(续）:基因型基因临床突变率PC*BCP**Eayw433.基因型与临床实验室表现不同（表2）病情与转归：C较B差抗病毒治疗：A优于DB优于Cadw/ayw20:1乙型肝炎的分子诊断35乙型肝炎的分子诊断35表2:B基因C基因HBeAg(+)少多免疫清除期短长严重急性加剧少多组织学活动性低高血清HBV-DNA水平低高PC1896突变率高低BCP双突变率低高抗病毒治疗应答好差临床转归（硬化、癌变）好差36表2:B基因C基因HBeAg(+)少多免疫清除期短长严重急性4.一般实验室分型方法测序PCR-RELP（限制性片断长度多态性）PCR核酸杂交（谱线探针法）血清学：单抗可区分A-F各基因型乙型肝炎的分子诊断37乙型肝炎的分子诊断375.抗病毒治疗的耐药性问题拉米夫定耐药性的检测乙型肝炎的分子诊断38乙型肝炎的分子诊断38拉米夫定耐药性的检测耐药性与HBV多聚酶基因YMDD氨基酸序列中的核酸变异有关I型：YMDD变异为HBV聚合酶基因(P区基因)区第741个核苷酸位,A-G置换，使第552个密码子蛋氨酸(M)被缬氨酸(V)取代，成为YVDD变异II型：YMDD变异为P基因区743个核苷酸的G-T置换，使第55个密码子蛋氨酸(M)被异亮氨酸(工)取代，成为YIDD变异YMDD变异：Y（酪氨酸）

M（蛋氨酸） V（缬）：YVDD变异D（天冬氨酸） I（异亮）：YIDD变异D（天冬氨酸）最近报道：YSDD（ATGAGT）应用拉米夫定耐药位点基因芯片检测突变位点乙型肝炎的分子诊断39拉米夫定耐药性的检测乙型肝炎的分子诊断39乙型肝炎的分子诊断40乙型肝炎的分子诊断40乙型肝炎的分子诊断41乙型肝炎的分子诊断41HCV的基因型/亚型6个型，68个亚型1a,b,c,d,e,f,g,h,i,j,k,l,m2a,b,c,d,e,f,g,h,i,k,l,m3a,b,c,d,e,f,g,h,i,k4a,c,d,e,f,g,h,k,l,m,n,o,p,q,r,s,t5a6a,b,d,f,g,h,i,j,k,l,m,n丙型肝炎的分子诊断42HCV的基因型/亚型6个型，68个亚型1a,b,c,HCV基因分型方法测序型特异性引物PCR分型法线性探针杂交（InnoLipa)限制性片段长度多态性分析（RFLP）TRUGENEHCV5’NCGenotypingAssay丙型肝炎的分子诊断43HCV基因分型方法测序丙型肝炎的分子诊断435’UTR(5’Non-CodingRegion)高度保守HCVRNA诊断实验的常用区域有一套良好的多态性特征，因此可用于基因分型许多HCV分型商业试剂盒都采用该区进行分型TRUGENEHCV5’NCGenotypingAssayVERSANTHCVGenotypingAssay(LiPA)HCVNS5B区各亚型间基因差异较大扩增效率较低若成功扩增，序列分析可区别HCV各亚型。HCV基因分型常选用的区域丙型肝炎的分子诊断445’UTR(5’Non-CodingRegion)HCV临床工作目前常用的基因型检测方法（RFLP,InnoLipa,Trugene)通常建立在5’非编码区，因为该区序列保守，检测灵敏度高，是HCVRNA诊断实验的常用区域。在临床工作中，对5’UTR进行分型的RFLP,InnoLipa,Trugene分型都可以满足分型的需要，为制定治疗方案和判断预后提供指导。常只需将1型和4型与其它基因型相区别，以决定抗病毒治疗的疗程和利巴韦林的剂量，因此上述的任何一种方法均可以采用。丙型肝炎的分子诊断45临床工作目前常用的基因型检测方法（RFLP,InnoLipHCV5’UTRgeneSecondPCRproduct=257bpSchemeACleavagewithBsrBⅠ,HinfⅠandHaeⅡ93and91bpGenotype2aand2b257bpGenotype3b,4aand5a127and91bp104,74bp160,74bp2a2b160,74bp234bp3b4aand5aCleavagewithHaeⅢSchemeCCleavagewithApoⅠ183,74bp257bp4a1b197bpGenotype1a,1band6a166/169and91bpCleavagewithBstUⅠSchemeB1a227bp5aGenotype3a6a257bpHCV5’非编码区ABC程序复合酶切分型法流程图-北京大学人民医院肝病研究所提供46HCV5’UTRgeneSecondPCRprodu抗HCV的确认实验确认的重要性（灰区的遗漏）目的：解决血液筛查实验（如ELISA）的非特异性问题方法：例如：PCR–活动性病毒血症的检测是一个很好的检测方法RIBA3.0–抗体的确认新流程：丙型肝炎的分子诊断47抗HCV的确认实验丙型肝炎的分子诊断47

抗-HCV筛查检测报告阴性或根据S/Co比值判定为阳性所有阳性结果高S/Co比值阳性*报告低S/Co比值阳性*RIBAHCV检测或阳性报告阴性报告不确定报告阳性阴性RIBAHCV检测HCVRNA的NAT检测阳性报告阴性报告不确定报告报告*以S/Co3.8(OCDHCVELISA3.0)或8.0(OCDVITROSECi/ECiQHCV)为“界值”。CDC抗-HCV实验室检测结果报告导则48抗-HCV筛查检测报告阴性或根据S/Co比值判定靶序列来源:a.单抗检出的TB抗原蛋白编码基因b.TB特异性核酸片段克隆c.插入序列结核分枝杆菌(TB)的分子诊断

TB检测实验设计特点49靶序列来源:结核分枝杆菌(TB)的分子诊断

TB检测实65KD，165bp;MPB64，240bp;IS6110，123bp;IS986，245bp;16sDNA，584bp.举例结核分枝杆菌(TB)的分子诊断

TB检测50举例结核分枝杆菌(TB)的分子诊断

TB检测50•标本处理：痰液化，抑制物去除•试剂质控及灵敏度注意事项结核分枝杆菌(TB)的分子诊断

TB检测51•标本处理：痰液化，抑制物去除注意事项结核分枝杆菌(TB结核的PCR临床主要应用a.结核与其他分枝杆菌区分b.结核耐药基因c.对含菌量低的标本的分离d.为临床可疑者捕捉信息临床评价结核分枝杆菌(TB)的分子诊断

TB检测52结核的PCR临床主要应用临床评价结核分枝杆菌(TB)•PCR方法与痰涂片及TB培养的比较应做比对研究临床评价结核分枝杆菌(TB)的分子诊断

TB检测53•PCR方法与痰涂片及TB培养的比较临床评价结核分枝杆菌(RFP（利福平）INH（异烟肼）SM（链霉素）EMB（乙胺丁醇）PZA（吡嗪酰胺）喹诺酮类已确定的耐药的抗结核药物结核分枝杆菌(TB)的分子诊断

耐药监测54RFP（利福平）已确定的耐药的抗结核药物结核分枝杆菌(TB)单耐药基因检测耐利福平：突变一般发生在RNA聚合酶B亚单位编码基因（rpoB基因）突变位点：531位丝氨酸亮氨酸 526位组氨酸酪氨酸突变导致RFP不能与RNA聚合酶B亚单位结合耐异烟肼：与三种基因突变有关katG基因（突变位点：463位精氨酸亮氨酸）inhA基因（突变位点：94位丝氨酸丙氨酸）ahpC基因结核分枝杆菌(TB)的分子诊断

耐药监测55单耐药基因检测耐利福平：结核分枝杆菌(TB)的分子诊断

耐同时对利福平、异烟肼这两种或以上的抗结核药物耐药大多数耐多药菌株是各种药物作用靶分子的编码基因逐步突变所致;靶结构变化与耐药水平有关少数耐多药菌株是由一个耐多药位点的突变所致耐多药基因检测结核分枝杆菌(TB)的分子诊断

耐药监测56同时对利福平、异烟肼这两种或以上的抗结核药物耐药耐多药基因检样品的制备PCR扩增已知的与耐药有关的基因片段扩增产物耐药基因分析SSCP（单链构象多态性分析）RFLP（限制性片段长度多态性分析）DNA序列分析耐药基因的检测方法结核分枝杆菌(TB)的分子诊断

耐药监测57样品的制备耐药基因的检测方法结核分枝杆菌(TB)的分子诊断需面对的问题高费用感染与患病与传统医学的矛盾技术本身的缺陷（污染、生物安全）58需面对的问题高费用58其它需要关注的问题：标本采集、运送和保存：供分离病毒、检出核酸及抗原的标本，要求做到：1.早：特别是对用于病毒分离、抗原或核酸检测的标本。2.快：病毒离活体后在室温下很易死亡，故采得标本应尽快送检。不能及时检测的标本应放入装有冰块或干冰的容器内送检。短时间可低温保存，冻存的标本忌反复冻融。3.近：用于病毒分离、抗原或核酸检测的标本应尽量取自病变部位或接近病变部位(如脑炎取脑脊液，腹泻取粪便，呼吸道感染取鼻咽分泌物或支气管灌洗液，有病毒血症时采取血液)。4.多：标本的量不能太少，如有可能一次取多种标本，在病程急性期和恢复期都取标本。5.净：避免污染标本，特别是用于病毒分离或PCR检测的标本实验室生物安全保护实验室室内、室间质量控制59其它需要关注的问题：59谢谢2007年11月60谢谢2007年11月60分子生物学诊断技术进展张正北京大学人民医院61分子生物学诊断技术进展1主要内容：分子生物学诊断技术在病原学检测中的应用简单介绍实验原理以PCR、荧光实时定量PCR、NASBA为例分子诊断技术在以下病原研究的应用进展乙型肝炎丙型肝炎结核分枝杆菌62主要内容：分子生物学诊断技术在病原学检测中的应用2病原学检测常用的实验室技术细胞培养与鉴定（“金标准”）、动物实验血清学、免疫学诊断技术电镜技术分子生物学诊断技术63病原学检测常用的实验室技术细胞培养与鉴定（“金标准”）、动物分子生物学诊断技术方法简介1、主体技术具体方法举例循环扩增PCR（聚合酶链反应）Real-timePCR,RT-PCR，巢式PCR，复合PCRPCR-ELISA，微孔板杂交，荧光探针标记法LCR（连接酶链反应）恒温NASBA（依赖核酸序列的扩增，主要用于RNA）SDA（链置换扩增术）CPT（环状探针技术）bDNA（枝链核酸信号放大系统）杂交捕获（如：检测HPV-DNA的试剂盒）64分子生物学诊断技术方法简介1、主体技术具体方法举例循分子诊断技术方法简介2、多标靶同时检测多重PCR毛细管电泳以测序分析为基础的检测技术65分子诊断技术方法简介2、多标靶同时检测5分子诊断技术方法简介3、核酸杂交DNA荧光原位杂交（FISH）将标记的探针直接原位杂交到染色体或DNA纤维切片上，再用与荧光素分子偶联的单克隆抗体与探针分子特异性结合来检测DNA序列在染色体或DNA纤维上的定位。

线性探针分析法（LiPA）杂交保护分析法（HPA）4、质谱利用色、质谱结合PCR技术66分子诊断技术方法简介3、核酸杂交6分子诊断的功能及扩展病原的诊断和鉴别诊断病原分型病毒载量监测---个体化治疗的依据疗效及预后标志其他：病原感染中发生、发展各阶段67分子诊断的功能及扩展7分子诊断的功能及扩展疾病分型及意义例如：HPV（30/100）高危---16，18，31，45低危---6，1168分子诊断的功能及扩展疾病分型及意义8分子诊断的功能及扩展病毒载量与治疗例1.---北京地坛医院谢尧提供69分子诊断的功能及扩展病毒载量与治疗---北京地坛医院谢尧提分子诊断的功能及扩展病毒载量与治疗例2. HBV---干扰素 HBV<100pg/mL11/30阴转 HBV>100pg/mL1/30阴转 (HBeAgHBeAb)70分子诊断的功能及扩展病毒载量与治疗10分子诊断的功能及扩展病毒载量与治疗例3. HIV病毒载量与传播 15127人流行病学调查415对伴侣 30个月 HIV阳转22%（90/415） 51人RNA<1500copies/mL全阴71分子诊断的功能及扩展病毒载量与治疗11分子诊断的功能及扩展病毒载量与治疗例4. 血浆EBV载量与鼻咽癌复发 15个二年持续缓解：0copy/mL 10个复发： 32250copies/mL 17个随访：临床恶化前半年病毒载量升高72分子诊断的功能及扩展病毒载量与治疗12耐药病原的分子诊断WHO：人类死亡1/3是长期用药的毒副作用HBV的YMDD变异HIV耐药73耐药病原的分子诊断13血制品筛查300余万的血清阴性样品，分子生物学复测：HBV：47HCV：10HIV-1：2-2001年剑桥资料

HIV-1血清阴性而RNA阳性0.2-6.6%-Am.J.ChinAthol.200074血制品筛查300余万的血清阴性样品，分子生物学复测：14在基础研究领域中的应用；遗传病的基因诊断和产前基因诊断： 如血友病、地中海贫血等肿瘤基因和肿瘤标志物表达(mRNA)的检测；骨髓移植、器官移植供体配型选择；法医学、动植物学、古人类学、古生物学；与疾病相关的各种蛋白（细胞因子、酶、激素、受体）的基因表达的检测；药物基因组学、耐药基因的检测，等等分子生物学技术在其它领域的应用75在基础研究领域中的应用；分子生物学技术在其它领域的应用15简单介绍实验原理PCR

(PolymeraseChainReaction,聚合酶链反应)

荧光实时定量PCR（realtimePCR）NASBA（依赖核酸序列的扩增）76简单介绍实验原理PCR

(PolymeraseChainPCR原理:实质就是体外基因复制技术Mg2+dCTPdGTPdUTPdATPTaqDNA聚合酶AmpErasePrimer靶序列加热变性95°C靶序列引物退火55°C引物延伸72°C77PCR原理:实质就是体外基因复制技术Mg2+dCTPdGTPPCR循环第一步–加热变性靶序列靶序列 从外周血白细胞或绒毛、羊水细胞提取的DNA约1ug，在含有适当缓冲液、引物、dNTPs（dATP、dCTP、dGTP及dTTP）等的反应混合物中，在94℃下热变性1-4分钟，使之解为单链。78PCR循环靶序列靶序列 从外周血白细胞或绒毛、羊水细胞提PCR循环第二步–引物与靶序列退火靶序列靶序列Primer1Primer2BiotinBiotin5’3’5’5’3’5’3’3’引物与解为单链的DNA上互补序列杂交在一起，称之为退火。55℃左右79PCR循环靶序列靶序列Primer1Primer2BiPCR循环第三步-引物延伸靶序列靶序列Primer1Primer2BiotinBiotin5’3’5’5’3’5’3’3’TaqDNAPolymerase在DNA聚合酶催化作用下，以dNTPs为原料（底物），从引物的3’端A开始,沿着5’→3’的方向，合成每条模板的互补链，此称引物延伸。72℃左右80PCR循环靶序列靶序列Primer1Primer2B第1个PCR循环完成后靶序列靶序列BiotinBiotin81第1个PCR循环完成后靶序列靶序列BiotinBioti30次循环后靶序列扩增的数量No.of No.AmpliconCycles CopiesofTarget1 22 43 84 165 326 6420 1,048,57630 1,073,741,8241cycle=2Amplicon2cycle=4Amplicon3cycle=8Amplicon4cycle=16Amplicon5cycle=32Amplicon6cycle=64Amplicon7cycle=128Amplicon8230次循环后靶序列扩增的数量No.of No.Ampli5’3’RQ探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，所以检测不到荧光，此种现象称为荧光共振能量转移。荧光PCR原理–TaqManTM技术λ835’3’RQ探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收5’3’5’3’5’3’RQExtensionStep5’3’1.StrandDisplacementTaq3’QR5’5’3’3’QTaqR5’2.Cleavage3.PolymerizationComplete5’3’QTaqR3’5’4.Detection5’3’3’QTaqR5’lR荧光PCR原理–TaqManTM技术845’3’5’3’5’3’RQExtensionStep5’定量PCR测定的是扩增的指数扩增期;定性PCR测定的是扩增的终点（平台期）定量PCR与定性PCR测定的区别85定量PCR测定的是扩增的指数扩增期;定量PCR与定性PCR测市场上常见的实时荧光PCR仪罗氏LightcyclerMJopticon2伯乐icyclerABI7000杭州博日（原大和）linegene86市场上常见的实时荧光PCR仪罗氏LightcyclerMJ临床标本核酸提取技术NASBA扩增ECL-化学发光标记检测NASBA扩增+分子灯塔检测扩增过程中“分子灯塔”即时同相检测方法1-NucliSensECL方法2-NucliSensEasyQ加入裂解缓冲液和内置标准NASBA测定原理87临床标本核酸提取技术NASBA扩增ECL-化学发光标记检测NASBA扩增原理引物1逆转录酶RNaseH引物2逆转录酶T7RNA聚合酶引物2逆转录酶逆转录酶RNaseH引物1线性循环扩增循环88NASBA扩增原理引物1逆转录酶RNaseH逆转录酶T7NASBA和

PCR

的不同NASBA扩增目标为RNA同温扩增连续扩增扩增物为单链RNA引物次序不包含於最终产物中PCR扩增目标为DNA温度循环扩增循环扩增扩增物为双链DNA引物次序包含於最终产物中

89NASBA和PCR的不同NASBAPCR29乙型肝炎检测标志物：HBsAg，抗-HBs,HBeAg，抗-Hbe,抗HBc(IgG,IgM),HBV-DNADane颗粒（完整的病毒）形态乙型肝炎的分子诊断90乙型肝炎检测标志物：Dane颗粒（完整的病毒）形态乙型肝炎的乙型肝炎的分子诊断1.重要性全球20亿人感染慢性3.5亿人中国、东南亚、非洲50％肝硬化，70-90％肝癌7-30％携带者感染变异体91乙型肝炎的分子诊断312.HBV基因型与血清型关系及流行病学分布基因型与血清型不完全一致临床突变率不同有地域分布特点乙型肝炎的分子诊断92乙型肝炎的分子诊断32表1：基因型血清学亚型基因长度(nt)临床突变率主要流行地域PC*(G1896A)BCP**(1762/1764)Aadw2ayw132216.5％（少）C185845％（常）西欧、北欧、北美、中非、印度Badw2ayw1321550％（常）T185816％东南亚、中国、日本Cayr;adrq+;Adrq-;adr;adw2321550％（常）T1858或C185858％（常）东南亚、中国、日本、澳洲、美国Dayw2;ayw3;ayw4318243%(常）T185812％（低）地中海、俄罗斯、印度、美国93表1：基因型基因长度临床突变率PC*BCP**Aadw232表1(续）:基因型血清学亚型基因长度(nt)临床突变率主要流行地域PC*(G1896A)BCP**(1762/1764)Eayw4321227％（中）7％（低）西非Fayw4;adw2;Adw4q-321516％（少）C1858未定中美、南美、波利尼西亚GAdw23248100％（高）未定中美、美国、法国、德国Hadw43215未定未定中美、南美、美国PC**:前核心BCP**:基本核心启动子（科华生物2004.07.21）94表1(续）:基因型基因临床突变率PC*BCP**Eayw433.基因型与临床实验室表现不同（表2）病情与转归：C较B差抗病毒治疗：A优于DB优于Cadw/ayw20:1乙型肝炎的分子诊断95乙型肝炎的分子诊断35表2:B基因C基因HBeAg(+)少多免疫清除期短长严重急性加剧少多组织学活动性低高血清HBV-DNA水平低高PC1896突变率高低BCP双突变率低高抗病毒治疗应答好差临床转归（硬化、癌变）好差96表2:B基因C基因HBeAg(+)少多免疫清除期短长严重急性4.一般实验室分型方法测序PCR-RELP（限制性片断长度多态性）PCR核酸杂交（谱线探针法）血清学：单抗可区分A-F各基因型乙型肝炎的分子诊断97乙型肝炎的分子诊断375.抗病毒治疗的耐药性问题拉米夫定耐药性的检测乙型肝炎的分子诊断98乙型肝炎的分子诊断38拉米夫定耐药性的检测耐药性与HBV多聚酶基因YMDD氨基酸序列中的核酸变异有关I型：YMDD变异为HBV聚合酶基因(P区基因)区第741个核苷酸位,A-G置换，使第552个密码子蛋氨酸(M)被缬氨酸(V)取代，成为YVDD变异II型：YMDD变异为P基因区743个核苷酸的G-T置换，使第55个密码子蛋氨酸(M)被异亮氨酸(工)取代，成为YIDD变异YMDD变异：Y（酪氨酸）

M（蛋氨酸） V（缬）：YVDD变异D（天冬氨酸） I（异亮）：YIDD变异D（天冬氨酸）最近报道：YSDD（ATGAGT）应用拉米夫定耐药位点基因芯片检测突变位点乙型肝炎的分子诊断99拉米夫定耐药性的检测乙型肝炎的分子诊断39乙型肝炎的分子诊断100乙型肝炎的分子诊断40乙型肝炎的分子诊断101乙型肝炎的分子诊断41HCV的基因型/亚型6个型，68个亚型1a,b,c,d,e,f,g,h,i,j,k,l,m2a,b,c,d,e,f,g,h,i,k,l,m3a,b,c,d,e,f,g,h,i,k4a,c,d,e,f,g,h,k,l,m,n,o,p,q,r,s,t5a6a,b,d,f,g,h,i,j,k,l,m,n丙型肝炎的分子诊断102HCV的基因型/亚型6个型，68个亚型1a,b,c,HCV基因分型方法测序型特异性引物PCR分型法线性探针杂交（InnoLipa)限制性片段长度多态性分析（RFLP）TRUGENEHCV5’NCGenotypingAssay丙型肝炎的分子诊断103HCV基因分型方法测序丙型肝炎的分子诊断435’UTR(5’Non-CodingRegion)高度保守HCVRNA诊断实验的常用区域有一套良好的多态性特征，因此可用于基因分型许多HCV分型商业试剂盒都采用该区进行分型TRUGENEHCV5’NCGenotypingAssayVERSANTHCVGenotypingAssay(LiPA)HCVNS5B区各亚型间基因差异较大扩增效率较低若成功扩增，序列分析可区别HCV各亚型。HCV基因分型常选用的区域丙型肝炎的分子诊断1045’UTR(5’Non-CodingRegion)HCV临床工作目前常用的基因型检测方法（RFLP,InnoLipa,Trugene)通常建立在5’非编码区，因为该区序列保守，检测灵敏度高，是HCVRNA诊断实验的常用区域。在临床工作中，对5’UTR进行分型的RFLP,InnoLipa,Trugene分型都可以满足分型的需要，为制定治疗方案和判断预后提供指导。常只需将1型和4型与其它基因型相区别，以决定抗病毒治疗的疗程和利巴韦林的剂量，因此上述的任何一种方法均可以采用。丙型肝炎的分子诊断105临床工作目前常用的基因型检测方法（RFLP,InnoLipHCV5’UTRgeneSecondPCRproduct=257bpSchemeACleavagewithBsrBⅠ,HinfⅠandHaeⅡ93and91bpGenotype2aand2b257bpGenotype3b,4aand5a127and91bp104,74bp160,74bp2a2b160,74bp234bp3b4aand5aCleavagewithHaeⅢSchemeCCleavagewithApoⅠ183,74bp257bp4a1b197bpGenotype1a,1band6a166/169and91bpCleavagewithBstUⅠSchemeB1a227bp5aGenotype3a6a257bpHCV5’非编码区ABC程序复合酶切分型法流程图-北京大学人民医院肝病研究所提供106HCV5’UTRgeneSecondPCRprodu抗HCV的确认实验确认的重要性（灰区的遗漏）目的：解决血液筛查实验（如ELISA）的非特异性问题方法：例如：PCR–活动性病毒血症的检测是一个很好的检测方法RIBA3.0–抗体的确认新流程：丙型肝炎的分子诊断107抗HCV的确认实验丙型肝炎的分子诊断47

抗-HCV筛查检测报告阴性或根据S/Co比值判定为阳性所有阳性结果高S/Co比值阳性*报告低S