上海交通大学微生物实验实验八质粒提取课件

实验八

质粒提取、病毒培养实验目的理解碱裂解法制备质粒DNA的原理掌握提取质粒DNA的方法掌握DNA琼脂糖凝胶电泳的原理掌握DNA电泳操作及DNA分子量大小的测定一、质粒的一般生物学特性

质粒(plasmid)是独立于细菌染色体以外的能自我复制的环状闭合的双股DNA，质粒DNA一般为细菌染色体的3%左右,作为基因克隆质粒载体的所有质粒DNA分子都必定包括如下三个共同的组成部分:复制基因、选择标志基因和克隆位点。

质粒广泛存在于细菌细胞中,此外在霉菌、蓝藻、酵母和某些动植物细胞中也发现有质粒存在。

大肠杆菌乳糖操纵子简介：

I:调节基因P:启动子O:操纵基因

Z、Y、A:结构基因,其中Z编码β-半乳糖甘酶(β-galactosidase),Y编码透性酶(permease),A编码乙酰基转移酶(acetylase).IPOZYAOri:复制子．ＭＣＳ：multiplecloningsites,多克隆位点．二、碱裂解法制备质粒DNA

注意点：使用酚－氯仿时注意安全三、琼脂糖凝胶电泳技术（Agarosegelelectroghoresis）

注意点：制、看胶时，戴一次性手套，注意ＥＢ（溴化乙錠）碱裂解法制备质粒DNA（书上的原理不完全正确）

染色体DNA分子大，易断裂乘线型DNA分子质粒DNA共价闭合环型在碱性环境中线型的染色体DNA和环型的质粒DNA氢键发生断裂，双链解开而变性，但质粒DNA只部分发生断裂，两条互补链不会完全分离。当pH调至中性并在高盐浓度存在的条件下，已分开的染色体DNA互补链不能复性，交联形成不溶性网状结构，通过离心，大部分染色体DNA、不稳定的大分子RNA和蛋白质－SDS复合物等一起沉淀下来。部分变性的质粒DNA在中性环境中很快复性，呈可溶状态保存在溶液中，离心后，存在上清中。再通过酚、氯仿、乙醇沉淀，获得纯的DNA质粒的提取p143（1）新鲜培养含有质粒的细菌（2）取1ml培养物加入1.5ml离心管中，10000rpm离心2min。（3）倒掉上清，尽可能倒干净。（4）细菌沉淀重悬于100ul的溶液Ｉ中，用移液枪吹打至均匀。须确使细菌沉淀在溶液Ｉ中完全分散(三种成分各发挥什么作用？）。操作程序（8）加等体积的溶液Ⅵ，振荡、颠倒离心管几次以沉淀DNA，于室温放置２分钟，小心吸取上层水相至另一洁净的离心管中（为什么要用这3种试剂？）。（9）加入2倍体积的冷的无水乙醇，室温放置２分钟，10000rpm5min，在管底可见微量的DNA沉淀，小心吸弃上清液。（（10）加入1ml70%乙醇，将DNA沉淀悬浮起来后，4℃10000rpm离心５分钟。（（11）小心吸弃上清液，将离心管倒置于一张纸巾上以吸尽液体。在室温干燥10分钟。（（12）取30μl灭菌水，用枪头吹达沉淀，使其彻底溶解，取9μl的DNA样品进行琼脂糖电泳，其余-20℃保存备用。DNA电泳取9μl的DNA样品与1μl的10*样品缓冲液混合后，用微量取样器慢慢将混合物加至样品孔中。盖上电泳槽并通电，使DNA向阳极移动。当溴酚蓝在凝胶中移出适当距离（根据DNA的大小、1kb和3kb左右的指示剂来判断）后，切断电源，取出玻璃板，在紫外灯下观察，并拍照记录结果，估测质粒分子量的大小。实验要求每组同学看到质粒条带估算出质粒条带的分子量大小实验报告实验目的实验原理实验步骤结果与分析思考题P145（1），（2），（3）下次实验病毒的培养（鸡胚接种）病毒的分离与培养病毒的种类专性活细胞寄生动物病毒鸡胚接种细胞培养植物病毒细菌病毒从病料中分离病毒一、样本的采集与处理1、一般原则：合适的时间，合适的病变部位，合适的处理和保存方法

一般都要4℃保存采集病料应具有针对性：在采集病料时应有重点地采集有关脏器、内容物、分泌物、排泄物或其他材料。在无法估计病因时，可全面采集病料。进行流行病学调查、抗体检测、群体健康评估或环境卫生检测时，样品的采集数量不能太少，应具统计学意义。B.无菌采样：采集所用的器械、样品管等均应消毒灭菌，采集过程应保持无菌操作，不同个体、不同组织样品应作好标。C.采集新鲜病料：动物发病后应立即采集病料，否则，尸体腐败会影响采样和检测效果，特别是用于病理学检查的病料更应及时采集。3、送检病料样本的标记（1）送检病料的物种、年龄、性别、发病日期、死亡时间等。（2）流行病学、临床表现、病理剖检等等初步诊断材料。（3）免疫接种和用药治疗情况。（4）病料中是否加有一些特殊的保护剂。（5）送检的目的和要求。（6）姓名和联系方式。鸡胚接种基本原理鸡胚培养的优点：鸡胚作为病毒的敏感细胞，能支持病毒完成从吸附到基因组复制，转录，蛋白质合成，装配，裂解的整个生命过程，从而使得病毒得以繁殖。接种路径：羊膜腔，尿囊腔，绒毛尿囊膜，胚体和卵黄囊接种等不同的病毒必须采用不同的接种路径鸡胚培养病毒的用途：分离，繁殖，毒力测定，疫苗制备等动物病毒实验动物鸡胚多种细胞培养接种前的准备鸡胚的孵化鸡胚的活力鉴别样本的前处理确定采用的接种路径5、病毒接种

灭菌注射器取0.2毫升病毒液（鸡新城疫病毒），沿孔垂直插入约1.5厘米进行接种（尿囊腔接种）6、石蜡封闭接种孔（石蜡加热时温度不要太高，以防燃烧）7、鸡胚培养

标记后，于37