代谢一、代谢工程的产生及沿革

代谢工程代谢工程二、代谢工程的理论基础三、代谢工程的研究概要五、代谢工程的研究策略六、代谢工程的重要应用和发展前景一、代谢工程的产生及沿革1234一、代谢工程的产生及沿革1234半个多世纪微生物生理与育种知识的累积工程理论和技术的成熟代谢流定量分析技术的发展生化工程检测和建模方法的发展1半个多世纪微生物生理与育种知识的累积微生物生理学、遗传育种学和生物化学的发展，1半个多世纪微生物生理与育种知识的累积微生物生理学、遗传育种学和生物化学的发展，使得人类可以用代谢途径操作的来改造微生物以获得期望的性质，如在氨基酸（谷氨酸）、抗生素、溶剂和维生素的发酵法生产中，都可以找到采用这个路子实现人类理想的一些突出的例子。至此，代谢控制发酵得以出现和发展。这些方法主要依赖于用化学诱变剂处理微生物这些方法主要依赖于用化学诱变剂处理微生物，并用进行设计的筛选技术来检出已获得优良性状的突变株。尽管这种方法已被广泛地接受并已取得好的效果，但人们对突变株的遗传和代谢性状的精确变化，知之甚少。尽管在所有的菌种改良方案中都有某种定尽管在所有的菌种改良方案中都有某种定向的含义，但传统的诱变是随机的。“定向”与随机诱变没有直接关系但我们早就根据随机诱变后从突变株中筛得的高产突变株遗传标记，及这些突变株的优良性质的实验结果，来推测代谢途径及其控制的机制。2工程理论和技术的成熟工程的理论和DNA重组的生物学技术已成熟。DNA重组的生物学技术的开发和应用，把代谢操作引进了一个新的层面2工程理论和技术的成熟工程的理论和DNA重组的生物学技术已成熟。DNA重组的生物学技术的开发和应用，把代谢操作引进了一个新的层面，人们已能对代谢途径的指定酶反应进行精确的修饰，因此，有可能构建精心设计的遗传背景。63代谢流量分析技术的发展3代谢流量分析技术的发展（metabolicfluxanalysis）是一种研究胞内代谢的方法，根据已有的代谢网络的信息建立胞内主要反应的化学计量模型泌到胞外的代谢中间产物的浓度，来推算代谢流量。3代谢流定量分析技术的发展这种分析方法的基础是拟稳态假设，即假设在产物形成速率最大的阶段各种3代谢流定量分析技术的发展这种分析方法的基础是拟稳态假设，即假设在产物形成速率最大的阶段各种代谢中间物的胞内浓度变化速率为零。根据质量平衡，由n个中间代谢物即可得到n个关于速率的方程，通过测定胞外代谢产物的浓度，计算未知途径的流量。4生化工程检测和建模方法的发展色谱、质谱、红外等检测，以检测4生化工程检测和建模方法的发展色谱、质谱、红外等检测，以检测及生物传感技术的发展，可为发酵和反馈提供可靠的原始数据。建模方法也有发展。代谢工程重要时间意义1956用野生的生物素缺陷型菌株发酵生产谷氨酸和发展1974粒，提高降解樟脑和萘等有机物能力用实例1991“TowardaScienceofMetabolic代谢工程重要时间意义1956用野生的生物素缺陷型菌株发酵生产谷氨酸和发展1974粒，提高降解樟脑和萘等有机物能力用实例1991“TowardaScienceofMetabolic第一次用代谢工程这一术语程作为一门确定的 展的转折点1996，“代谢工程——让细胞为人类工作”报告方向代谢控制发酵得以出现和发展、工程理论和技术的成熟、代谢控制发酵得以出现和发展、工程理论和技术的成熟、代谢流定量分析技术的发展、生化工程检测和建模方法的发展最终使得代谢工程学科的建立和发展。二、二、代谢工程的理论基础（一）基本概念（二）代谢工程要解决的问题（三）代谢工程的研究对象、目标与依据（四）代谢工程的实质（五）代谢工程理论涉及的内容的的，而代谢网络是由一系列酶的级联化学反应以特异性的膜转化系统构成。，活细胞自身固有的代谢网络的遗传特性并不是最佳的，为了积累大量的某种代谢产物，就必须要打破并重建细胞的代谢平衡。13•代谢工程概念演变•代谢工程概念演变，最早由美国加州理工学院化学工程系教授BailyJ.E.于1991年提出的。随后Stephanopoulos认为，代谢工程是一种提高菌体生物量功代谢物产量的理性化方法。Cameron认为代谢工程是动用重组DNA技术有目的地改造中间代谢的方法。：通过某些特定生化反应的修饰来定向改善细胞的特性或运用重组DNA技术来创造新的化合物。141515代谢工程（定义）把量化代谢流及其控制的工程分析方法与根据分析结果制定的遗传修饰方案付之实施的生物学技术结合起来代谢工程（定义）把量化代谢流及其控制的工程分析方法与根据分析结果制定的遗传修饰方案付之实施的生物学技术结合起来，以反复分析、校验和修正的方式进行实际操作，改善微生物的产物形成的能力和微生物的细胞性能，从而满足人类对生物的特定需求的生物工程的分支。主要应用方向(1)提高细胞现存代谢途径中天然产物的产量；主要应用方向(1)提高细胞现存代谢途径中天然产物的产量；，使其合成新产物，这种新产物可以是中间代谢产物或修饰型的最终产物；，构建全新的代谢通路，从而产生细胞自身不能合成的新产物；，如：生长速率、极端环境条件和耐受性等。17•代谢工程研究思路•代谢工程研究思路，找到能反映细胞生理状态的主要参数；计，并确定合理靶点以修饰构建特定的物种；，以实施新一轮的代谢网络修饰直到确立最佳状态，从而取代普通的定向靶点筛选程序；代谢工程关注的是代谢途径的组合而单一的反应，因此必须考察完整的生化反应网络，重视代谢，代谢流及其控制。与代谢流及其体内条件的控制相关联。18生化反应途径和代谢途径一系列按序进行的生物化学反应生化反应途径和代谢途径一系列按序进行的生物化学反应构成生化反应途径；若这条途径在活细胞里运行，则为代谢途径。生化反应网络和代谢网络生化反应途径按生物化学规律生化反应网络和代谢网络生化反应途径按生物化学规律汇成生化反应网络；代谢途径与跨膜输送系统按代谢规律汇成（物质）代谢网络。••细胞代谢的网络由上万种酶催化的系膜传递系统、信号传递系统组成，并且既受精密调节，又彼此互相协调。，而是相互作用、相互、统一、灵敏的调节系统。•代谢网络的联网问题代谢中间化合物都在代谢网络上，有些有机化合物虽然不在代谢网络上但仍有可能与代谢网络“联网”。所谓“联网”就是用化学或生物化学反应把指定的化合物连接到代谢网络上去，从而使它与微生物的代谢建立。“联网”代谢网络的联网问题代谢中间化合物都在代谢网络上，有些有机化合物虽然不在代谢网络上但仍有可能与代谢网络“联网”。所谓“联网”就是用化学或生物化学反应把指定的化合物连接到代谢网络上去，从而使它与微生物的代谢建立。“联网”可以用化学或生物学方法（含DNA重组技术）来实现。广义的“联网”包含代谢网络细节不同的生命有机体之间接力赛式的代谢。已在“网”上或者可以“联网”或原料。的化合物都可能被开发为工业发酵的产物代谢流和碳架物质流代谢物在代谢网络中形成代谢流。代谢流和碳架物质流代谢物在代谢网络中形成代谢流。广义的代谢流还包括能量流和信息流。在代谢分析和代谢工程中，代谢流往往首先是指有机物流（碳架物质流）。代谢主流在一定的培养条件下，代谢物在代谢网络中，代谢主流在一定的培养条件下，代谢物在代谢网络中，流量相对集中的代谢流叫做该培养条件下的代谢主流。代谢主流的流量测定是代谢工程的重要组成部分。载流途径与载流路径从字面上讲，有代谢物流通过的代谢途载流途径与载流路径从字面上讲，有代谢物流通过的代谢途径即载流途径。载流路径是工业发酵领域的术语。在工业发酵的目的产物生产阶段，碳架物质从原料到目的产物流经的各段代谢途径（即载流途径），按流经的先后次序首尾衔接，组载流路径。代谢工程没有必要有的载流途径，但必须研究载流路径上的代谢流，也就是生产阶段的代谢主流。代谢主流的变动性和选择性微生物的代谢主流的方向代谢主流的变动性和选择性微生物的代谢主流的方向、流量甚至所流经的途径都可能发生变化。这就是微生物代谢主流的变动性和代谢主流对代谢网络中的途径的选择性。这种变动和选择的根据在于微生物细胞的遗传物质，选择的原因是微生物所处的环境条件的变化。理想载流路径为了提高产物对原料的转化率，就要求代谢主流（根据代谢分析的结果）理想载流路径为了提高产物对原料的转化率，就要求代谢主流（根据代谢分析的结果）经设定的载流路径流到目的产物。因为这样的载流路径是带有导向性的虚拟的载流途径，所以把它们叫做理想载流路径。微生物生物工程的难题既然微生物的代谢主流对网络中的途径有的选择性，而工业发酵的目标又微生物生物工程的难题既然微生物的代谢主流对网络中的途径有的选择性，而工业发酵的目标又是要微生物的代谢主流经理想载流途径流到目的产物，因此就有必要去解决理想载流途径的设计问题和对代谢主流的合理导向问题。代谢的“五段式”代谢的“五段式”在工业发酵生产中，培养器中的微生物细胞的代谢是分步进行的。胞外营养物质（一般要经胞外酶降解后）从培养介质跨膜进入细胞（一般要）经过“向心途径”、“中心途径”和“离心途径”等三段连续的代谢途径的代谢，才能在胞内生成目的产物，最后，目的产物跨过细胞质膜排出细胞回到培养介质。代谢的“五段式”因此，典型的理想载流途径应该由以上五段承担不同代谢分工的依次衔接代谢的“五段式”因此，典型的理想载流途径应该由以上五段承担不同代谢分工的依次衔接的代谢途径组成。这就是载流途径的“五段式”。在这条载流途径上的代谢主流对应地也有五段，这就是代谢主流的“五段式”。工业发酵的五字策略在“载流路径”、“代谢主流”和“五段式”等概念的基础上工业发酵的五字策略在“载流路径”、“代谢主流”和“五段式”等概念的基础上，从统筹的角度出发，提出能作为一个整体用于设计育种以及发酵工艺控制的五字策略：“进、通、节、堵、出”。工业发酵的五字策略①进，促进细胞对碳源营养物质工业发酵的五字策略①进，促进细胞对碳源营养物质的吸收；能畅通地流向目的产物；③节，阻塞与目的产物的形成无关或关系不大产物；④堵，消除或削弱目的产物进一步代谢的途径；。⑤出，促进目的产物向胞外空间代谢网络的节点及其刚性微生物代谢网络中的途径的交叉点（代谢流的集散处）叫做节点（node代谢网络的节点及其刚性微生物代谢网络中的途径的交叉点（代谢流的集散处）叫做节点（node），微生物自动节点处代谢物流量分配比率的改变的特性叫做节点的刚性。节点的刚性取决于微生物代谢的自动调节机制。因此在应用“五字策略”制订育种方案时必须认真考虑节点刚性问题，尽量采用解除调节的育种。代谢网络的刚性微生物自动代谢网络中代谢物流量分布的改变的特性叫做代谢网络的刚性代谢网络的刚性微生物自动代谢网络中代谢物流量分布的改变的特性叫做代谢网络的刚性。代谢网络的刚性与主要刚性节点的刚性大小、分布及数量密切相关。•，•，去除产物的反。是指由节点流向某一分支或某些分，这是由产物用所致。是指介于前两者之间，由该节点流，其，且无反馈物的产率。柔性及弱刚性节点是代谢设计的主要对象••••，即对产物的产量•，即对产物的产量，则这类代谢网络称为依赖型代谢带来很大的困难。，则可以通过对代谢，这类网络为独立型网络。响着产品得率。•••是代谢控制分析研究的两个主要指标•是代谢控制分析研究的两个主要指标。。，用来衡量某一步酶反应对整个反应体系的控制程度。••这两个系数相互关联，可直接或间接测定。37（二）（二）代谢工程要解决的问题要解决的问题就是改变代谢质流在不同途径中的流量分布。（三）（三）代谢工程的研究对象、目标与依据研究对象：代谢网络；——将代谢物质流导，以获得产物的最大转化率；主要依据：对代谢节点的判断。（四）（四）代谢工程的实质对物质代谢的方向、流量及控制进行定量分析，并在此基础上进行代谢过程改造，最大限度的提高目的代谢产物的产率。与传、、生物化学等多门学科。（五）代谢工程理论涉及的内容涉及细胞物质代谢规律及途径组合的生物化学原理（五）代谢工程理论涉及的内容涉及细胞物质代谢规律及途径组合的生物化学原理；它提供了生物体基本的代谢图谱和生化反应的机理。涉及细胞代谢流及其控制分析的化学计量学、反应动力学、热力学和控制学原理；这是代谢途径修饰的理论依据。四、四、代谢工程的研究技术与工具代谢工程的多学科性质决定了它的发展优势，同时也暗示了它在研究方法和技术方面的综合性，主要可归为三类：第二，分析技术。第三，操作技术。检测技术常规的化学和生物化学检测都可用于代谢工程的研究，如同位素示踪检测技术常规的化学和生物化学检测都可用于代谢工程的研究，如同位素示踪——确定代谢流的物料平衡；还有表征酶反应进程的酶动力学分析方法；测定同位素富集和关键代谢物相对质量的光谱学方法，如核磁共振。根据这些测量信息可以判断和描述体内代谢流的基本状态，并为细胞代谢流及其控制分析提供翔实可靠的原始数据。分析技术在获得大量生化反应基本数据基础上，采用化学计量学、反应动力学和化学工程学的研究方法，并结和计算机技术可以进一步阐明细胞代谢途径和代谢网络的动态特征与控制机理，同时确定途分析技术在获得大量生化反应基本数据基础上，采用化学计量学、反应动力学和化学工程学的研究方法，并结和计算机技术可以进一步阐明细胞代谢途径和代谢网络的动态特征与控制机理，同时确定途径改造的关键靶点。这些包括测定细胞内代谢流的稳态法、展示代谢流控制过程的扰动法、简化复杂网络分析的组合法，即时生化反应甚至达调控定量化的计量法等。表操作技术代谢工程中，代谢途径和代谢网络的操作实质上可以归纳为传学专门试验技术，如水平上的操作。这生物学和遗操作技术代谢工程中，代谢途径和代谢网络的操作实质上可以归纳为传学专门试验技术，如水平上的操作。这生物学和遗和簇的克隆、表达、调控；DNA的杂交检测与序列分析等。四、代谢工程的研究技术与工具研究工具生物学工具：几乎所有四、代谢工程的研究技术与工具研究工具生物学工具：几乎所有工程工具和技术都是代谢工程所必需的；分析化学和测量工具：经典研究代谢途径的技术，如质量平衡、阻断突变株分析等是必需的，无损伤即时分析（核磁共振）、流式细胞计量署等越来越重要；四、四、代谢工程的研究技术与工具研究工具数学和计算机工具：现有的数学和计算机信息，DNA数据库和计算机分析程序现已可获得。五、五、代谢工程的研究策略目前，代谢工程战略思想主要有以下几方面：（一）在现存途径中提高目标产物的代谢流；（二）在现存途径中改变物质流的性质；（三）利用已有途经构建新的代谢旁路。（一）在现存途径中提高目标产物的代谢流12增加代谢途径中限速步骤酶编码的拷贝数；改造以启动子为主的关键的表达系统，强化其表达；345（一）在现存途径中提高目标产物的代谢流12增加代谢途径中限速步骤酶编码的拷贝数；改造以启动子为主的关键的表达系统，强化其表达；345提高目标途径激活因子的速率；灭活目标途径抑制因子的编码；阻断与目标途径相竞争的代谢途径。（二）在现存途径中改变物质流的性质1利用某些代谢途径中酶对底物的相对专一性，投入非理想型初始底物（如结构类似物）参与代谢转化反应，进而化合物（二）在现存途径中改变物质流的性质1利用某些代谢途径中酶对底物的相对专一性，投入非理想型初始底物（如结构类似物）参与代谢转化反应，进而化合物；细胞内原本不存在的2在酶对底物专一性较强的情况下，通过蛋白质工程技术修饰酶的结构域或功能域，以扩大酶对底物的识别和催化范围。（三）利用已有途经构建新的代谢旁路1或修补完善细胞内部分途径，以利用新的底物新的产物。2转移多步途径以构建杂和代谢网络（三）利用已有途经构建新的代谢旁路1或修补完善细胞内部分途径，以利用新的底物新的产物。2转移多步途径以构建杂和代谢网络。将编码某一完整生物途径的转移到受体细胞中，可以构建具有何大经济价值的生产菌株。六、代谢工程的重要应用和发展前景（一）代谢工程的主要应用领域：1六、代谢工程的重要应用和发展前景（一）代谢工程的主要应用领域：1234提高细胞已有的化学物质产量；产生宿主细胞本身不能的新物质；扩展细胞的底物使用范围；形成降解毒性物质的新催化活性；提高细胞已有的化学物质产量提高细胞已有的化学物质产量表5-2产生宿主细胞本身不能合成的新物质表5-2产生宿主细胞本身不能合成的新物质表5-3扩展细胞的底物使用范围表5-3扩展细胞的底物使用范围表5-4形成降解毒性物质的新催化活性表5-4形成降解毒性物质的新催化活性•最成功的一个例子是头孢霉素C•最成功的一个例子是头孢霉素C的代谢工程菌的构建，头孢霉素C的合成途径。N的积累，这表明下一步酶反应是头孢霉素合成代谢中的限速步骤。因此克隆了编码脱乙酰氧基头孢霉素C合成酶基因cefEF，并导入顶C产量提高了25％，而青霉素N的积累量减少至原来的1/16。•C产量提高了25％，而青霉素N的积累量减少至原来的1/16。头孢霉素C限速步骤青霉素NC产量提高了25％，而青霉素N的积累量减少至原来的1/16。头孢霉素C限速步骤青霉素N头孢霉素CcefEF中间产物α-氨基己二酸•产量。•产量。如：赖氨酸合成，选育解除反馈抑制和缺失高丝氨酸脱氢酶的突变株，提高了赖氨酸的产量。而为了获得苏氨酸的高产菌株，以解除了反馈抑制的赖氨酸产生菌棒状杆菌为宿主，转入高丝氨酸脱氢酶基因，结果使原来不产生苏氨酸的赖氨酸产生菌的赖65g/L下降至4g/L，而苏氨酸产量增加到52g/L，使赖氨酸产生菌转变成苏氨酸产生菌。•高丝氨酸脱氢酶赖氨酸产生菌棒状杆菌产生菌的赖氨酸产量由65g/L下降至4g/L，苏氨酸产量增加到52g/L，赖氨酸产生菌转变成苏氨酸产生菌。高丝氨酸脱氢酶赖氨酸产生菌棒状杆菌产生菌的赖氨酸产量由65g/L下降至4g/L，苏氨酸产量增加到52g/L，赖氨酸产生菌转变成苏氨酸产生菌。第二节逆代谢工程第二节逆代谢工程一、逆代谢工程的兴起定义：从限制生物活性的主要因素入手，在相关生物种类中鉴别一、逆代谢工程的兴起定义：从限制生物活性的主要因素入手，在相关生物种类中鉴别所希望得到的表型，并确定该表型的决定，然后利用重组技术将该克隆到宿主菌中，并使之表达，使宿主菌得到所希望的表型的技术。一、一、逆代谢工程的兴起代谢工程的研究现已在生物科学的各个领域得到广泛应用。目前，代谢工程的推理涉及的对象已不再是单一的简单网络，而是复杂的亚网络、整体，常由于以下认识上的局限导致失败：一、一、逆代谢工程的兴起首先，对于复杂网络，网络研究不局限于单细胞，可能牵涉到交互作用的多细胞群体。催化天然底物结构类似物的可能性有关。另外，一些异源蛋白质需要辅助因子或组装常由于错误折叠、聚合或选择性降解导致蛋白质活性丧失。一、逆代谢工程的兴起传统代谢工程的直线思维模式在改造复杂代谢网络在遇到上述时已为力。许多研究者打破传统，采用逆向思维模式创建了逆代谢工程思路：一、逆代谢工程的兴起传统代谢工程的直线思维模式在改造复杂代谢网络在遇到上述时已为力。许多研究者打破传统，采用逆向思维模式创建了逆代谢工程思路：首先，在异源生物或相关模型系统中确定、推理或计算希望的表型；然后，确定导致这一表型的遗传或特定的环境因子；最后，通过遗传