细胞贴片免疫组化染色步骤课件整理

亲和免疫组化技术(Affinitycytochemistryhistochemistrytechnique)亲和免疫组化技术1亲和的概念物质之间具有的高度结合力,包括抗原与抗体生物素与抗生物素(又称亲和素)、葡萄球菌A蛋白与lgG、植物凝集素与糖类、阳离子与阴离子、激素与受体之间的结合反应等亲和的概念2第“节生物素一亲和素免疫细胞化学技术基本原理(一)生物素(Biotin)与亲和素卵白素抗生物素(Avidin/anti-Botn)之间有很强的亲和力二)生物素和亲和素具有与其它示踪物质如荧光素和过氧化物酶等相结合的能力第“节生物素一亲和素免疫细胞化学技术3种经典的抗生物素一生物素染色法)ABc(AvidinBiotin-peroxidaseComplex)技术(二)LAB(LabelledAvidin-Biotin)技术(=)LSAB(labeledstreptavidinbiotinmethod):SP(streptavidin-peroxidase)技术SABc(streptavidin-biotincomplex)技术(四)BRAB(BridgedAvidin-Biotin)技术(五)cSA(Catalyzedsignalamplification)法(六)Envision技术种经典的抗生物素一生物素染色法4C亲和素生物素过氧化物酶(AvidinBiotin-peroxidaseComplex,ABC)技术1.基本原理标生物紫多生物素化二抗一抗ABC法示意圈C亲和素生物素过氧化物酶52、操作步骤(1)石蜡切片常规脱蜡至水,冰冻切片经冷丙酮固定,用PBS洗;(2)用3%H202甲醇液室温作用20min后,充分水洗(3)PBS洗,加牛血清白蛋白或二抗动物种属正常血清15min(4)加第一抗体(即用型或浓缩型)4℃过夜或37℃1h;(5)PBs洗,加生物素化第二抗体37℃30min;(6)PBS洗,加ABC复合物(1:100,使用前30mn将等量的亲和素和酶标生物素混合,稀释配制成ABC复合物),37℃20mn(7)PBS洗,经DABH22显色(8)常规脱水,透明,中性树胶封固。2、操作步骤63、ABC法的优点(1)敏感性高:结合力强,分子量小(2)特异性强,背景染色淡;(3)方法简便,节约时间(4)由于生物素与抗生物素具有与多种标记物结合的能力,可用于双重或多重免疫染色。3、ABC法的优点7标泡生物素抗生物素技术(LabelledAvidin-BiotinTechnique,LAB技术)基本原理以生物素标记抗体作第一抗体,酶标记抗生物素作为第二抗体,同SP技术Figure11:IntheLABorLSABtchnology,theenzymeLabelledstreptavidinreactswitnthebiounyatedsecondaryandbodyLAB法示意图标泡生物素抗生物素技术82、操作步骤(1)①④步骤与ABC法相同;(5)PBS洗后加生物素标记第一抗体37℃3min(6)PBS洗后加酶标亲和素(如HRP-Avidin)37℃30min:(7)以下步骤同ABC法。2、操作步骤9三LsAB(labeledstreptavidinbiotin)技术:SP(streptavidin-peroxidase)技术SABC(streptavidin-biotincomplex)技术、基本原理AgAgP方法示意图SABC示意图三LsAB(labeledstreptavidinbi10细胞贴片免疫组化染色步骤课件整理11细胞贴片免疫组化染色步骤课件整理12细胞贴片免疫组化染色步骤课件整理13细胞贴片免疫组化染色步骤课件整理14细胞贴片免疫组化染色步骤课件整理15细胞贴片免疫组化染色步骤课件整理16细胞贴片免疫组化染色步骤课件整理17细胞贴片免疫组化染色步骤课件整理18细胞贴片免疫组化染色步骤课件整理19细胞贴片免疫组化染色步骤课件整理20细胞贴片免疫组化染色步骤课件整理21细胞贴片免疫组化染色步骤课件整理22细胞贴片免疫组化染色步骤课件整理23细胞贴片免疫组化染色步骤课件整理24细胞贴片免疫组化染色步骤课件整理25细胞贴片免疫组化染色步骤课件整理26细胞贴片免疫组化染色步骤课件整理27细胞贴片免疫组化染色步骤课件整理28细胞贴片免疫组化染色步骤课件整理29细胞贴片免疫组化染色步骤课件整理30细胞贴片免疫组化染色步骤课件整理31细胞贴片免疫组化染色步骤课件整理32细胞贴片免疫组化染色步骤课件整理33细胞贴片免疫组化染色步骤课件整理34细胞贴片免疫组化染色步骤课件整理35细胞贴片免疫组化染色步骤课件整理36细胞贴片免疫组化染色步骤课件整理37细胞贴片免疫组化染色步骤课件整理38细胞贴片免疫组化染色步骤课件整理39亲和免疫组化技术(Affinitycytochemistryhistochemistrytechnique)亲和免疫组化技术40亲和的概念物质之间具有的高度结合力,包括抗原与抗体生物素与抗生物素(又称亲和素)、葡萄球菌A蛋白与lgG、植物凝集素与糖类、阳离子与阴离子、激素与受体之间的结合反应等亲和的概念41第“节生物素一亲和素免疫细胞化学技术基本原理(一)生物素(Biotin)与亲和素卵白素抗生物素(Avidin/anti-Botn)之间有很强的亲和力二)生物素和亲和素具有与其它示踪物质如荧光素和过氧化物酶等相结合的能力第“节生物素一亲和素免疫细胞化学技术42种经典的抗生物素一生物素染色法)ABc(AvidinBiotin-peroxidaseComplex)技术(二)LAB(LabelledAvidin-Biotin)技术(=)LSAB(labeledstreptavidinbiotinmethod):SP(streptavidin-peroxidase)技术SABc(streptavidin-biotincomplex)技术(四)BRAB(BridgedAvidin-Biotin)技术(五)cSA(Catalyzedsignalamplification)法(六)Envision技术种经典的抗生物素一生物素染色法43C亲和素生物素过氧化物酶(AvidinBiotin-peroxidaseComplex,ABC)技术1.基本原理标生物紫多生物素化二抗一抗ABC法示意圈C亲和素生物素过氧化物酶442、操作步骤(1)石蜡切片常规脱蜡至水,冰冻切片经冷丙酮固定,用PBS洗;(2)用3%H202甲醇液室温作用20min后,充分水洗(3)PBS洗,加牛血清白蛋白或二抗动物种属正常血清15min(4)加第一抗体(即用型或浓缩型)4℃过夜或37℃1h;(5)PBs洗,加生物素化第二抗体37℃30min;(6)PBS洗,加ABC复合物(1:100,使用前30mn将等量的亲和素和酶标生物素混合,稀释配制成ABC复合物),37℃20mn(7)PBS洗,经DABH22显色(8)常规脱水,透明,中性树胶封固。2、操作步骤453、ABC法的优点(1)敏感性高:结合力强,分子量小(2)特异性强,背景染色淡;(3)方法简便,节约时间(4)由于生物素与抗生物素具有与多种标记物结合的能力,可用于双重或多重免疫染色。3、ABC法的优点46标泡生物素抗生物素技术(LabelledAvidin-BiotinTechnique,LAB技术)基本原理以生物素标记抗体作第一抗体,酶标记抗生物素作为第二抗体,同SP技术Figure11:IntheLABorLSABtchnology,theenzymeLabelledstreptavidinreactswitnthebiounyatedsecondaryandbodyLAB法示意图标泡生物素抗生物素技术472、操作步骤(1)①④步骤与ABC法相同;(5)PBS洗后加生物素标记第一抗体37℃3min(6)PBS洗后加酶标亲和素(如HRP-Avidin)37℃30min:(7)以下步骤同ABC法。2、操作步骤48三LsAB(labeledstreptavidinbiotin)技术:SP(streptavidin-peroxidase)技术SABC(streptavidin-biotincomplex)技术、基本原理AgAgP方法示意图SABC示意图三LsAB(labeledstreptavidinbi49细胞贴片免疫组化染色步骤课件整理50细胞贴片免疫组化染色步骤课件整理51细胞贴片免疫组化染色步骤课件整理52细胞贴片免疫组化染色步骤课件整理53细胞贴片免疫组化染色步骤课件整理54细胞贴片免疫组化染色步骤课件整理55细胞贴片免疫组化染色步骤课件整理56细胞贴片免疫组化染色步骤课件整理57细胞贴片免疫组化染色步骤课件整理58细胞贴片免疫组化染色步骤课件整理59细胞贴片免疫组化染色步骤课件整理60细胞贴片免疫组化染色步骤课件整理61细胞贴片免疫组化染色步骤课件整理62细胞贴片免疫组化染色步骤课件整理63细胞贴片免疫组化染色步骤课件整理64细胞贴片免疫组化染色步骤课件整理65细胞贴片免疫组化染色步骤课件整理66细胞贴片免疫组化染色步骤课件整理67