流式细胞仪分离奶牛精子性控效果的试验研究

流式细胞仪别离奶牛精子性控效果的试验研究摘要用流式细胞仪别离荷斯坦奶牛的精液，检测在冷冻前和冷冻后别离的精子活力。同时，对不同牛群利用别离得到的性控鲜精和性控冻精进展人工输精，对其人工授精效果和性别控制效果进展观察。结果说明：分选后冻前精子活力到达0.60～0.67，分选后解冻精子活力达0.31～0.39；育成牛群性控鲜精输精的情期受胎率高于使用性控冻精输精，经产母牛群性控鲜精输精的情期受胎率高于使用性控冻精输精，但差异均不显著〔P＞0.05〕；使用性控鲜精、性控冻精进展人工输精，育成牛群情期受胎率高于经产母牛群，且差异显著〔P＜0.05〕；产母犊率差异不显著〔P＞0.05〕；用性控精液人工授精的奶牛早期流产率高于非性控精液，但差异不显著〔P＞0.05〕。关键词精液别离；流式细胞仪；奶牛；受胎率；产犊率奶牛性别控制〔SexControl〕是通过人为干预或操作，使母牛按照实际需要消费所需性别后代的生物技术。通过性别控制，可以进步奶牛的繁殖效率，加快遗传育种的进程，迅速增加良种奶牛的数量，从而到达改善牛群构造、进步牛群质量、促进奶牛由数量型向质量型开展的目的。因此，性别控制对奶牛业开展有非常重要的意义[1]，性别控制必将推动奶牛业跨越式的开展。目前，常见的奶牛性别控制方法有2种，即早期胚胎性别鉴定法和利用流式细胞仪进展X、Y精子别离法。利用流式细胞仪别离X、Y精子是根据细胞大小及DNA、RNA、蛋白质、抗原等物理或化学性质进展细胞的挑选，也是奶牛性别控制的一条新途径，可以别离得到纯度很高的X精子和Y精子群[2]。许多学者在人工授精或显微授精之前就利用别离的X、Y精子控制其性别，因此被许多学者认为是更具有实用价值的方法[3]。该研究主要观察别离后精子的人工授精效果和性别控制效果，以期促进奶牛性别控制方法在奶牛消费中的进一步应用，为完善奶牛性别控制技术提供参考。1材料与方法1.1精液的处理1.2受配母牛选择宿州地区及附近郊县的大型奶牛养殖小区及奶牛养殖大户进展性控精液人工授精试验。一部分为荷斯坦育成母牛，14～17月龄，体重为350～450kg；一部分为荷斯坦成年母牛，3～5岁，一产或二产。首先确定发情母牛，即静立、承受其他牛爬跨者，并确定适宜的输精时间，每天观察发情2次。在母牛发情后8～12h，利用直肠检查确定卵泡发育侧卵巢，然后将处理后的性控精液输到卵泡发育同侧子宫角内或子宫体内[3]。在发情后60d进展妊娠诊断。随机进展配种，在每头母牛的1个发情期只配1次，防止造成过大的损失。1.3调查统计详细查阅每个奶牛场的配种记录，及时登记试验母牛的产犊情况，进展性别登记。2结果与分析2.1精子分选结果流式细胞仪别离精子的分选速度为25000个/s，搜集速度为3000～5000个/s，X精子分选准确率为95%以上。精子自采集后到完成性别别离约需6h[3]。2.2别离效果及其对精子活力的影响使用流式细胞仪别离精子，分选后冻前精子活力到达0.60～0.67，分选后解冻精子活力为0.31～0.39，详细如表1所示。2.3别离精子〔鲜精与冻精〕用于不同牛群的性控结果2.4别离精液人工授精的早期妊娠及流产情况从表2可以看出，对不同牛群用非性控精液和性控精液进展人工输精，使用非性控精液人工授精的早期流产率为5.13%，性控精液人工授精的早期流产率为6.48%，性控精液人工授精的早期流产率高于非性控精液组，但差异不显著〔P＞0.05〕，属于正常繁殖指数范围。3结论与讨论试验结果说明，利用流式细胞别离仪别离的奶牛精液对后代性别比例的影响非常显著。该精液别离技术具有操作简便、思路新颖、方法独特、准确率高、便于推广等特点。相对于其他省份，安徽省奶牛数量少，因此直接导致产奶量很低，原料奶供应严重缺乏。如将性控精液技术推广应用于奶牛消费中，不仅可以促进奶牛业的快速开展，每年可多产母牛几万头，更重要的是将进步对某些性状的选择强度，加快良种奶牛的繁殖速度。迄今为止，利用流式细胞仪制备的性控精液已被广泛应用于多种动物，特别是在牛的消费中，已产生很多后代，在这些后代牛中并没有出现表型异常的报道[4-6]。这种现状说明流式细胞仪在别离精子的过程中，精子的遗传物质并没有受到严重伤害。该试验所产的奶牛未出现表现型异常现象。有学者认为，应用流式细胞仪制备的性控精液，其流产率要高于常规精液的应用[7-8]，这从该研究结果得到了验证，但性控精液与非性控精液对人工授精的早期流产率差异不显著。流式细胞仪别离法也存在优势，如别离精子的速度较慢，在较短时间内很难获得大量别离精子，而且仪器价格昂贵等，但流式细胞仪精子别离法研究已经获得了非常大的成绩，在部分地区已开始应用于人工授精。随着仪器的改进和各项辅助生殖技术的深化研究、开展，性别别离精子必然将在畜牧消费中得到广泛的应用，产生宏大的社会和经济效益。同时，流式细胞仪别离精子假设与体外受精和显微受精技术相结合，将有宏大的开展潜力和广阔的应用前景[9]。4参考文献[2]王子玉，谭景和.流式细胞仪别离精子研究进展[J].中国畜牧杂志，2004，40〔6〕：43-46.[3]覃能斌，袁野，孟凡伟，等.利用流式细胞仪别离奶牛精液的性别控制效果观察[J].黑龙江畜牧兽医，2006〔9〕：52-53.[5]JOHNSONLA，WELCHGR，KEYVANFARK，etal.Genderpresele-ctioninhumans?FlowcytometricseparationofXandYspermatozoaforthepreventionofX-linkeddiseases[J].HumanReproduction，1993，8〔10〕：1733-1739.[7]SEIDELGE，SCHENKJL，HERICKHOFFLA，etal.Inseminationofheiferswithsexedspermatozoa[J].Theriogenology，1999，52〔8〕：1407-1420.[8]BUCHANANBR，SEIDELGE，MCCUEPM，etal.Inseminationofmareswithlownumbersofeitherunsexedorsexedspermatozoa[J].Therioge-nology，2000，53〔6〕：1333-1344.[9]CRANDG，JOHNSONLA，POLGEC.Sexselectionincattlefieldtrial[J].