现代分子诊断技术详述课件

第七章现代分子诊断技术酶联免疫吸附测定DNA诊断系统DNA指纹遗传性疾病的分子诊断技术

第七章现代分子诊断技术酶联免疫吸附测定1基因诊断基因蛋白质性状生化诊断基因诊断临床诊断基因诊断基因蛋白质性状生化诊断基因诊断临床诊断2传统的诊断程序先要对病原物质进行培养，培养后再分析它的生理学特性确定它到底是哪一类的病原物，是病毒、细菌，还是其他物质实践证明:比较有效,检测到病原微生物相对比较特异诊断成本高、速度慢、效率低如砂眼衣原体、朊病毒传统的诊断程序3方法优点缺点显微镜镜检简单易行，可直接观察到寄生虫的形态速度慢，灵敏度低，对经验水平要求高费时费工，无法辨别形态相近的寄生虫体外培养、接种能检测到活的寄生虫，并可检测感染性和感染程度速度慢、花费高，寄生虫可能难以进行体外培养，且必须使用动物材料抗体检测简单、快速、能够实现自动化，可用于检测大量的样品无法区分活的寄生虫与处在潜伏状态的寄生虫。有时会有非特异反应发生DNA杂交及PCR快速灵敏，能够实现自动化，可以分辨不同种的寄生虫，不需要以前有寄生虫感染病史花费高，步骤多，无法区分活的和死的寄生虫，有时会有假阳性或假阴性

检测寄生虫感染的诊断方法的比较方法优点缺点显微镜镜检简单易行，可直接观察到寄生虫的形态速度4现代分子诊断技术主要是指应用免疫学和分子生物学的方法对病原物质进行诊断检测一种有效的诊断方法应具备：1、专一性（specificity）强，诊断只对某一种病原菌分子产生阳性反应2、灵敏度(sensitivity)高3、操作简单(simplicity)现代分子诊断技术主要是指应用免疫学和分子生物学的方法对病原物5基因诊断的特点特异性高检测目标是基因，为原始的致病因素灵敏度高待测标本往往微量，目的基因只需pg水平稳定性高基因的化学组成为核酸，比蛋白质稳定，且不需处于活性状态诊断范围广，适应性强确切的诊断，也能确定与疾病的关联状态临床应用前景好基因诊断的特点特异性高6基因诊断优点从基因水平彻底揭示疾病的病因及发病机制显著提早产前诊断的时间无需对组织、器官或细胞进行选择快捷准确、安全基因诊断优点从基因水平彻底揭示疾病的病因及发病机制7基因诊断常用的技术核酸分子杂交PCR（聚合酶链式反应）限制性酶切分析SSCP（单链构象多态性分析）DNA测序DNA芯片技术基因诊断常用的技术核酸分子杂交8DNASouthernblot,FISH,PCR,Sequencing,micoarray,restrictionanalysis,RFLP，SSCPRNANorthernblot,RT-PCR,micoarraysProteinWesternblot,Immuno-histochemistry,microarrayDNA9SouthernblotNNTTNTTSouthernblotNNTTN10

FISHFISH11PCR技术PCR技术12DNA测序DNA测序13

指在固相支持物上原位合成寡核苷酸或者直接将大量探针以显微打印的方式有序地固化于支持物表面，然后与标记的样品杂交，通过对杂交的检测分析，得出样品的遗传信息（基因序列及表达的信息）

由于在制备过程中运用了计算机芯片的制备技术如显微光蚀刻、显微打印等，且常用硅芯片作为固相支持物，所以称为DNA芯片技术DNA芯片技术的概念指在固相支持物上原位合成寡核苷酸或者直接将大量14DNA芯片技术原理大规模集成的固相杂交

基本原理是核酸分子杂交，即依据DNA双链碱基互补配对、变性和复性的原理

以大量已知序列的寡核苷酸、cDNA或基因片段作探针，检测样品中哪些核酸序列与其互补，然后通过定性、定量分析得出待测样品的基因序列及表达的信息DNA芯片技术原理大规模集成的固相杂交以大量已知序列的寡核15DNA芯片技术流程BiologicalSampleAnalyzedataScannermicroarray“Hybridize”arrayerMicroarrayfabricationSamplepreparationMolecularhybridizationDetectionandanalysisDNA芯片技术流程BiologicalAnalyzedat16现代分子诊断技术详述17基因诊断的原理利用分子生物学和分子遗传学的技术，从DNA或RNA水平检测、分析基因的存在、变异和表达状态，从而对疾病做出诊断的方法策略检测已知的能产生某种特定功能蛋白的基因检测与某种遗传标志连锁的的致病基因检测表型克隆基因基因诊断的原理利用分子生物学和分子遗传学的技术，从DNA或R18基因治疗的机理

基因置换：正常基因取代致病基因基因修正：纠正致病基因的突变碱基序列基因修饰：目的基因表达产物补偿致病基因的功能基因抑制：外源基因干扰、抑制有害基因的表达基因封闭：封闭特定基因的表达“自杀基因”的应用免疫基因的治疗耐药基因的治疗基因治疗的机理基因置换：正常基因取代致病基因19

美国医学家W·F·安德森等人对腺甘脱氨酶缺乏症（ADA缺乏症）的基因治疗，是世界上第一个基因治疗成功的范例

1990年9月14日，安德森对一例患ADA缺乏症的4岁女孩谢德尔进行基因治疗。这个4岁女孩由于遗传基因有缺陷，自身不能生产ADA，先天性免疫功能不全，只能生活在无菌的隔离帐里。他们将含有这个女孩自己的白血球的溶液输入她左臂的一条静脉血管中，这种白血球都已经过改造，有缺陷的基因已经被健康的基因所替代。在以后的10个月内她又接受了7次这样的治疗，同时也接受酶治疗。经治疗后，免疫功能日趋健全，能够走出隔离帐，过上了正常人的生活。

谢德尔，1999美国医学家W·F·安德森等人对腺甘脱氨酶缺乏症（AD20现代分子诊断技术详述21现代分子诊断技术详述22现代分子诊断技术详述23

分子诊断利用PCR技术或PCR与分子杂交标记相结合，可以快速准确地检测出病原性物质。分子诊断利用PCR技术或PCR与分子杂交标记相结合，可以快24

分子诊断遗传性疾病的诊断羊水和胎盘绒毛膜检测分子诊断遗传性疾病的诊断羊水和胎盘绒毛膜检测25第一节酶联免疫吸附测定抗体高度特异地与抗原分子结合通过抗原-抗体的特异识别反应进行检测酶联免疫吸附测定(enzyme-linkedimmunosorbantassay,ELISA)第一节酶联免疫吸附测定抗体高度特异地与抗原分子结合酶联免疫吸26一、酶联免疫吸附测定的原理工作原理：主要是利用了一抗与目标分子的特异性结合假定目标分子是一种蛋白质，那么要得到可用于检测的抗体，则首先需要纯化出这种蛋白质，然后用纯化的蛋白质免疫动物（一般是兔子），在免疫过程中兔子的血清就会产生多克隆抗体一、酶联免疫吸附测定的原理工作原理：27二、检测过程：①将待测样品结合在固相支持物（如96孔的微量滴定板）上②加入可以与目标分子特异反应的抗体，即一抗（primaryantibody）,反应后冲洗，将未结合上的一抗洗去③加入二抗（secondaryantibody），二抗通常只特异地识别一抗，而不识别目标分子（二抗上还连着一种酶，如碱性磷酸酶、过氧化物酶或脲酶等，这些酶都能够催化一种化学反应将无色底物转变成有色物质），一抗与二抗反应完成后，再次冲洗将未与一抗结合的二抗洗去④加入无色底物二、检测过程：28双抗体夹心法检测大分子抗原双抗体夹心法检测大分子抗原29间接法检测抗体间接法检测抗体30竞争法测定小分子抗原或半抗原，也可测定抗体竞争法测定小分子抗原或半抗原，也可测定抗体31双夹心法测定大分子抗原特异性相同，来源不同双夹心法测定大分子抗原特异性相同，来源不同323、使用多克隆抗体的缺点①同一抗体混合物中不同抗体的含量会有差异，而且每次制备的抗体的量之间也会有差异②无法区别相类似的目标分子：如果病原分子与非病原分子之间只相差一个抗原决定簇，这时多克隆抗体就无法区分，因为在ELISA检测中都会发生颜色变化单克隆抗体特异性强

只结合抗原上某一单一位置3、使用多克隆抗体的缺点334、酶联免疫吸附测定的局限性仅凭ELISA结果容易造成误诊，ELISA检测只能作为一种初步的检测手段，要进一步确诊还必须进行western检测要提高ELISA检测的准确度,就必须提高一抗的特异性在使用抗体时，要求其抗原的编码其目标识别位点的基因要表达，而且目标位点不能够以任何方式被覆盖或阻断，否则都将影响抗体与抗原的结合4、酶联免疫吸附测定的局限性34第二节DNA诊断系统DNA诊断的理论基础：任何一个决定生物学特性的DNA序列都应该是独特的，都可以作为专一性的诊断标记第二节DNA诊断系统DNA诊断的理论基础：任何一个决定生物35一、核酸杂交1、工作原理：

◆两条DNA链之间可以通过碱基配对而形成氢键2、3个关键要素：

★探针DNA

★目的DNA

★

信号检测一、核酸杂交1、工作原理：36主要依据：碱基互补、变性和复性

DNA与DNA杂交：

A=T、G≡C;

DNA与RNA杂交:

A=U、G≡C;

变性：

在一定温度下，使核酸双链解开为两条单链；

复性：

随温度逐渐恢复，变性的两条单链重新形成互补双链碱基互补主要依据：碱基互补、变性和复性碱基互补37现代分子诊断技术详述38核酸分子杂交（固相杂交）操作程序制备待测核酸样品分离、变性、转移、固化DNA片段杂交加入标记核酸探针检测杂交信号标记核酸探针预杂交制备核酸探针漂洗去除未参与杂交的标记探针核酸分子杂交（固相杂交）操作程序制备待测核酸样品分离、变性、393、杂交探针必须是高度特异性的DNA片段种级探针：区分两个或多个物种亚种级探针：区分物种内特定的株系DNARNA化学合成或克隆的完整基因基因的一个片段3、杂交探针必须是高度特异性的DNA片段40

利用核酸双链的碱基互补、变性和复性的原理，可以用已知碱基序列的单链核酸片段作为探针，与待测样本中的单链核酸互补配对，以判断有无互补的同源核酸序列的存在

核酸探针

是指带有标记的某一特定DNA或RNA片断，能与待测样本中单链核酸分子互补配对结合，进而检测同源序列

探针标记物有放射性核素或非放射性核素（生物素、地高辛、荧光素等）两大类利用核酸双链的碱基互补、变性和复性的原理，可41分离杂交探针的方法：提取某一病原微生物株系的染色体DNA限制性内切酶进行酶解得到的酶解片段克隆进一质粒载体，构建质粒文库文库中重组质粒的插入片段即可用来分别同病原性微生物和非病原性微生物的核DNA进行杂交、筛选分离杂交探针的方法：42核酸杂交的灵敏度和可靠性极高用探针直接同粪便样品、尿样、血样、喉洗液和组织样品中的目标DNA进行杂交，且无需预先纯化DNA若样品中的目标分子非常少，则需通过PCR将目的序列扩增，再进行杂交检测

从理论上讲，用DNA杂交来诊断疾病可用于对所有的致病微生物的检测核酸杂交的灵敏度和可靠性极高434、非同位素标记探针32P的缺点：⑴半衰期短，仅13天⑵操作起来比较危险⑶必须要有特殊的实验室设备进行操作⑷放射性垃圾的处理繁琐4、非同位素标记探针32P的缺点：44非放射性杂交检测系统：通过酶促反应将某种底物转变成生色物质或化学发光物质而达到放大信号的目的采用将生物素（biotin）标记的核苷酸掺入DNA的方法制备探针生物素标记的DNA在室温下至少可保存一年检测发光和颜色变化可在几小时内完成非放射性杂交检测系统：45BBBBAPBBAP生物素加入链霉素抗生物蛋白加入生物素标记的碱性磷酸酶探针目的DNA加入不同的生色或化学发光底物BBBBAPBBAP生物素加入链霉素抗生物蛋白加入生物素标记46荧光标记的引物直接进行PCR检测DNA引物1引物2荧光染料PCR层析荧光检测游离引物荧光标记的引物直接进行PCR检测DNA引物1引物2荧光染料P47分子夹心探针检测发出荧光分子夹心探针(没有荧光)荧光团猝灭剂目的DNA与目的DNA杂交分子夹心探针检测发出荧光分子夹心探针(没有荧光)荧光团猝灭剂48TaqMan探针技术原理：利用Taq酶的3′5′外切核酸酶活性，切断探针，产生荧光信号，由于探针与模板特异性结合，荧光的强弱就代表了模板的数量TaqMan探针技术原理：493′5′5′3′QR上游引物下游引物5

′3′3′5

′QRTaqMan探针的荧光信号产生机制3′5′5′3′QR上游引物下游引物5′3′3′5′QR50疟疾的分子诊断：检测是否存在疟原虫抽取血样进行镜检免疫诊断:ELISA检测疟原虫蛋白或抗体

无法区分是以前感染还是现在感染DNA杂交诊断例一：疟疾的分子诊断：检测是否存在疟原虫例一：51DNA的杂交探针是一段疟原虫的高度重复的DNA序列具体的分离过程：构建一个疟原虫的核基因文库用标记的疟原虫核DNA作探针去筛选核基因文库选出那些杂交信号最强的克隆用这些选出来的片段作探针，与疟原虫及其同属中不导致疟疾的种的核基因作杂交，以检查该片段作为DNA探针的可靠性DNA的杂交探针是一段疟原虫的高度重复的DNA序列52锥虫的检测

锥虫在人体中可侵入肝、脾、淋巴结、中枢神经系统，在其中大量繁殖并杀死寄主细胞显微镜检新鲜血液取新鲜血液感染未携带锥虫的寄生虫,30-40天后杀死昆虫,镜检昆虫的肠道免疫检测:假阳性高例二：锥虫的检测

锥虫在人体中可侵入肝、脾、淋巴结、中枢神经系统，53PCR检测针对锥虫特有的一段188bp的DNA序列设计引物，特异地从锥虫基因组中扩增得到188bp的条带PCR检测54二、细菌性传染病及病毒性疾病的分子诊断技术抗生素的不合理使用DNA杂交PCR检测噬菌体介导二、细菌性传染病及病毒性疾病的分子诊断技术抗生素的不合理使用55DNA杂交设计16SrRNA为探针16SrRNA在细菌中拷贝数极高，高度的保守性特异性不是很好必须结合PCR技术DNA杂交设计16SrRNA为探针56PCR检测nestedPCR针对目的病原菌的不同保守区段设计多对引物每对引物都能特异的扩增出一段目的片段，病原菌存在的可能性大大增加PCR检测nestedPCR57模板使用外引物，进行第一次PCR扩增使用内引物，进行第二次PCR扩增第一次PCR扩增产物第二次PCR扩增产物巢式PCR原理示意图模板使用外引物，进行第一次PCR扩增使用内引物，进行第二次P58PCR技术也会产生假阳性新扩增的目的DNA特异性不强退火温度过低模板中杂质的污染假阴性存在Taq酶的抑制剂模板量过少模板DNA纯度不够PCR技术也会产生假阳性59原位PCR(insituPCR,ISPCR)在细胞或细胞切片上对待测的低拷贝数基因进行扩增，并通过原位杂交进行检测不仅能检测出病原微生物的存在，且能够在组织细胞中定位原位PCR(insituPCR,ISPCR)60原位杂交（nucleicacidhybridizationinsitu）

将标记探针与细胞或组织切片中的核酸进行杂交，进而检测特异的DNA或RNA序列

细胞原位杂交

组织切片原位杂交

DNA-DNARNA-DNA

三类杂交

RNA-RNA

该法优点：不需提取核酸，故可完整保持组织或细胞的形态，因而更能准确地反映组织细胞的功能状态有原位杂交（nucleicacidhybridizatio61噬菌体介导细菌检测将荧光素酶基因引入到噬菌体的基因组，然后用转基因噬菌体去侵染待测样品噬菌体侵染该宿主菌，大量合成包括荧光素酶在内的由噬菌体基因编码的蛋白，向体系中加入荧光素和ATP，就会有荧光产生结核菌的检测抗药性菌株的检测噬菌体介导细菌检测将荧光素酶基因引入到噬菌体的基因组，然后用62荧光素酶荧光素＋ATP荧光利用宿主细胞转录、翻译噬菌体基因荧光素酶基因宿主细菌噬菌体介导的细菌检测荧光素酶荧光素＋ATP荧光利用宿主细胞转录、翻译噬菌体基因荧63第三节DNA指纹每个人体细胞内都含有23对染色体，每条染色体中部含有一个DNA分子，DNA分子中的核苷酸序列包含着遗传信息，在DNA分子中存在三种类型：单拷贝序列、中等程度重复序列、高度重复序第三节DNA指纹每个人体细胞内都含有23对染色体，每条染色64每个重复序列在300个核苷酸长度之内，由于高度重复，序列经过超离心后以卫星带出现在主要DNA带的附近，所以也称卫星DNA，其中的重复序列单元则称为“小卫星DNA”“小卫星”具有高度的可变性，但在“小卫星DNA“中有一小段序列则在所有个体中都一样，称为“核心序列”。如果把核心序列串联起来作为分子探针与不同个体的DNA进行分子杂交，就会出现各自特有的杂交图谱。它们与人的指纹一样具有专一性和特异性，因此称作“DNA指纹”通过对人类基因组的解析，发现人与人之间99．99％的碱基序列都相同，而剩下的0.01%的碱基特征序列则来自于双亲，据此可用于“亲子鉴定”每个重复序列在300个核苷酸长度之内，由于高度重复，序列经过65所罗门的审判：

大家都听说过所罗门的审判这样一件故事：两位妇人都声称自己是孩子的母亲，于是所罗门就命令一名侍卫把那个孩子带来，要用剑将其辟成两半分给他们两，结果假母亲同意所罗门的判决，而孩子真正的母亲却恳求侍卫饶了孩子的性命，她解释说：“把孩子给了假母亲，总比让孩子惨死好。”当然，真假母亲也就水落石出了。所罗门的审判：大家都听说过所罗门的审判这样一件故事：66滴骨验亲法：

以生者的血滴在尸骨上，观察血能否浸入骨内，浸入的则被认为两者有血缘关系，在各种古籍中有多种记录。三国时代（公园220—280年）谢承著《会稽先贤传》中的《以弟血滴兄骨》可能是记录此法的最早的史料：陈业的哥哥因海难不幸殒命，当时一同遇难的有五六十人，并且尸体都已严重腐败而无法辨认死者的身份。陈业就用刀刺破自己的手臂将血分别滴在尸骨上，发现其血液只能浸入一具尸骨，其余皆不能。陈业就这样确认其兄的尸骨。滴骨验亲法：以生者的血滴在尸骨上，观察血能否浸入骨67合血法：

等到了明代，更是采用了“合血法”来识别亲权。明末清初的检验书籍中都有相同的记载：“亲子兄弟或自幼分离，欲相认识。难辨真伪。命各刺出血，滴一器内，真则共凝为一，否则不凝也。”合血法：等到了明代，更是采用了“合血法”来68方法：DNA指纹是指对待测样品中的DNA进行分析所得到的具有特征性的DNA分子杂交图谱DNA酶解电泳转膜杂交最常用的DNA探针是微卫星序列受害者血样犯罪嫌疑人衣物上血样犯罪嫌疑人血样方法：DNA指纹是指对待测样品中的DNA进行分析所得到的具有69现代分子诊断技术详述70现代分子诊断技术详述71第四节遗传性疾病的分子诊断技术直接诊断点突变间接诊断多态性连锁分析第四节遗传性疾病的分子诊断技术直接诊断72

美国前副总统汉弗莱<Humphrey)在1967年发现膀胱内有一肿物，病理切片未发现癌细胞良性“慢性增生性囊肿”，未进行手术治疗。九年后，他被诊断为患有“膀胧癌”，两年后死于该病。美国前副总统汉弗莱<Humphrey)九年后73

1994年，研究者用灵敏的PCR技术对上述汉弗莱1967年的病理切片进行了P53抑癌基因检查，发现那时的组织细胞虽然在形态上还没有表现出恶性变化，但其P53基因的第227个密码子已经发生了一个核苷酸的突变。就是这个基因的微小变化，使其抑癌功能受损，导致九年后细胞癌变的发生。这说明，在典型症状出现之前的很长时间，细胞癌变的信息已经在基因上表现出来了P53抑癌基因1994年，研究者用灵敏的PCR技术对上述汉弗莱196774遗传性疾病的分子诊断技术PCR－酶解鉴定PCR／OLA鉴定PCR-ELISA检测PCR-DGGE鉴定扩增阻滞突变系统（amplificationrefractorymutationsystem,ARMS）连接酶链反应（LCR）遗传性疾病的分子诊断技术PCR－酶解鉴定75镰刀形细胞贫血症(sickle-cellanemia)典型的单基因遗传性疾病血红蛋白的β链（β珠蛋白）的第六个氨基酸Glu发生突变成Val镰刀形细胞贫血症(sickle-cellanemia)典型76血红蛋白-链上谷氨酸变成缬氨酸血红蛋白-链上谷氨酸变成缬氨酸77

英国女王维多利亚。她带有血友病基因，并将其传给了她的儿女。血友病是一种遗传性凝血障碍疾病，患者可能因很小的伤口而出血不止导致死亡。血友病在女性一般表现为隐性遗传，较少发病，但会传给后代；在男性则表现为显性遗传，显示出病症。维多利亚女王在科堡主持的一次欧洲王室成员集会，与会者有17人是她的后裔，其中有她的孙女亚历山德拉（21），她同俄国沙皇尼古拉二世结婚，导致他们的儿子患有血友病。

血友病基因英国女王维多利亚。她带有血友病基因，并将其传给78一、PCR－酶解鉴定

正常基因为CCTGAGG镰刀形贫血病患者的基因为CCTGTGG限制性内切酶CvnI的识别序列为CCTNAGG一、PCR－酶解鉴定正常基因为CCTGAGG79方法:在CvnI位点的两点设计两个引物;包含CvnI位点区域的DNA片段通过PCR扩增出来;扩增的DNA用CvnI酶处理，酶解产物用凝胶电泳分开，经溴化乙锭染色后就可在紫外灯下检查DNA带型。方法:8038225620118188条带大小(bp)正常纯合子杂合子突变纯合子CvuI处理CvuICvuICvuI256bp201bp181bp88bpCvuICvuI256bp382bp88bp正常情况镰刀形细胞贫血症PCR扩增引物1引物2PCR产物（长726bp）382条带大小(bp)正常纯合子杂合子突变纯合子CvuI处理81二、PCR/OLA鉴定OLA(oligo-nucleotideligationassay),寡聚核苷酸连接分析假定一个正常的基因在一个特定的位置发生了突变，比如说150位的T突变为G

根据150位两边的序列，人工合成两段短的核苷酸链，使这两段寡聚核苷酸链与基因的一条链互补探针X：寡聚核苷酸链的3’端最后一个核苷酸正好与正常基因的150位的的核苷酸配对探针Y：另一段寡聚核苷酸链的5’端第一个核苷酸与151位的核苷酸配对二、PCR/OLA鉴定OLA(oligo-nucleotid82正常基因

探针X3’端最后一个核苷酸就不会与目的基因150位的核苷酸配对由于3’最后一个核苷酸不配对而使两个探针无法实现连接目的基因突变两探针与目的基因的完美配对两个探针就可连接起来加入DNA连接酶正常基因探针X3’端最后一个核苷酸就不会与83B150151DBD150151BXY150151DBD双链目的DNA或PCR产物热变性单链目的DNA或PCR产物加探针退火完全配对模板有突变,不完全配对连接酶连接酶加入链霉抗生物素蛋白加入链霉抗生物素蛋白B150151DBD150151BXY150151DBD双链84BDB加入碱性磷酸酶加入无色底物加入碱性磷酸酶加入无色底物BDAP变色无色底物有色底物B保持无色无色底物PCR/OLA分析程序示意图BDB加入碱性磷酸酶加入碱性磷酸酶BDAP变色无色底物有色底85例：特异性互补寡核苷酸法检测镰状红细胞贫血症（1）提取DNA，热处理成为单链DNA；（2）以单链DNA为模板，仅对可能发生突变的核苷酸区域设计引物进行PCR扩增后转移到滤膜上，热变性成单链；（3）分别用两种特异性互补寡核苷酸分子探针（ASO）杂交。例：特异性互补寡核苷酸法检测镰状红细胞贫血症（1）提取DNA86三、PCR-ELISA检测在PCR反应体系中加入生物素标记的dUTP和其他3种dNTP3’端经DIG标记特异性探针包被有抗生物素抗体的酶标板抗碱性磷酸酶（AP）－DIG抗体如果加入的DIG标记的探针可与扩增片段结合，则酶标板上有颜色反应发生，否则不会有颜色的变化三、PCR-ELISA检测在PCR反应体系中加入生物素标记的87四、PCR-DGGE法原理变性梯度凝胶电泳（DGGE）是一种根据DNA片段的熔解性质而使之分离的凝胶系统Tm值主要取决于DNA分子中GC含量的多少DGGE将凝胶设置在双重变性条件下：温度50~60℃，变性剂0~100%当一双链DNA片段通过一变性剂浓度呈梯度增加的凝胶时，此片段迁移至某一点变性剂浓度恰好相当于此段DNA的低熔点区的Tm值，此区便开始熔解，而高熔点区仍为双链四、PCR-DGGE法原理88原理同样长度但序列不同的DNA片段会在胶中不同位置处达到各自最低解链区域的解链温度，部分解链的DNA片段在胶中的迁移速率急剧降低，形成相互分开的条带图谱不同DNA片段的序列差异发生在最高的解链区域时，这些片段就不能被区分，则人为地加入一个高熔点区——GC夹，即在一侧引物的5′端加上一个30~40bp的GC结构，使相应的感兴趣的序列处于低熔点区而便于分析原理89突变型野生型杂合型突变型野生型杂合型90现代分子诊断技术详述91五、扩增阻滞突变系统等位基因特异性扩增原理

Taq缺乏3’→5’外切酶活性，如果引物的3’端不能与模板DNA严格互补配对，模板DNA就不能有效的扩增五、扩增阻滞突变系统等位基因特异性扩增925’TACATTAGGTT3’3’TAATCCAA5’PCR反应继续5’TACCTTAGGTT3’AATCCAA5’PCR反应终止3’T5’TACATTAGGTT3’AATCCAA5’PCR反应终止3’G5’TACCTTAGGTT3’3’GAATCCAA5’PCR反应继续野生型序列突变序列野生型引物突变引物ARMS原理示意图5’TACATTAGGTT3’3’TAATCCAA593野生型DNAATT3’引物3发红光CGT3’引物3无法扩增没有荧光AARMS检测突变体举例野生型DNAATT3’引物3发红光CGT3’引物3无法扩94纯合突变体DNACGG3’引物3发绿光ATG3’引物3无法扩增没有荧光BARMS检测突变体举例纯合突变体DNACGG3’引物3发绿光ATG3’引物3无法95杂合突变体DNAAGT3’引物3G发黄光CARMS检测突变体举例TC引物1引物2GT杂合突变体DNAAGT3’引物3G发黄光CARMS检测突变96六、连接酶链反应基本原理利用DNA连接酶特异地将双链DNA片段连接，经变性-退火-连接三步骤反复循环，从而使靶基因序列大量扩增设计两对分别互补的引物，引物与之互补的模板DNA结合并留下一缺口，如果与靶序列杂交的相邻的寡核苷酸引物与靶序列完全互补，DNA连接酶即可连接封闭这一缺口，则LCR反应的三步骤(变性-退火-连接)就能反复进行，若连接处的靶序列有点突变，引物不能与靶序列精确结合，缺口附近核苷酸的空间结构发生变化，连接反应不能进行，也就不能形成连接产物六、连接酶链反应基本原理97现代分子诊断技术详述98第五节基因工程疫苗一、疫苗的简介二、基因工程疫苗

1、亚单位疫苗

2、肽基疫苗3、DNA疫苗第五节基因工程疫苗一、疫苗的简介99一、疫苗的简介

DrEdwardJener（1796）：用一种奶牛痘感染人类，感染后不再被天花感染

LouisPasteur（19世纪末）：研制成功狂犬疫苗

VonBehring＆KitasatoShibasaburo：开发研制白喉/破伤风疫苗

一、疫苗的简介DrEdwardJener（100医学上最有潜力的防御物质灭活的和减毒的致病物质不能丧失引起免疫反应的能力麻疹、白喉、百日咳、破伤风、天花、脊髓灰质炎医学上最有潜力的防御物质101传统疫苗的局限性①有些致病物无法在培养基上生长；②动物和人类的病毒需要在动物细胞中培养；③培养的动物和人类病毒其生长速度和产量一般都很低；④需要对实验室以及参加实验的操作人员采取特殊的保护措施；⑤疫苗中的致病物质在疫苗生产过程中又可能没有完全杀死或充分减毒；⑥减毒菌株有可能发生突变；⑦有些疾病（如艾滋病）用传统的疫苗防治收效甚微；⑧绝大多数的现行疫苗的有效期短。传统疫苗的局限性①有些致病物无法在培养基上生长；102衡量疫苗能否投入使用的标准——安全性

删除致病基因，保留抗原性。——有效性尽可能调动机体细胞免疫和体液免疫。衡量疫苗能否投入使用的标准——安全性103免疫系统的工作机制：体液免疫、细胞免疫抗原抗原肽细胞表面复合物活化的B细胞（浆细胞）淋巴因子活化的T细胞抗体杀灭抗原分子抗原显示细胞（如树状细胞）吞噬，分解MHC蛋白质识别、激活杀伤T细胞激活释放激活分泌体液免疫细胞免疫免疫系统的工作机制：体液免疫、细胞免疫抗原抗原肽细胞表面复合104二、基因工程疫苗指用基因工程的方法，表达出病原物的一段基因序列，将表达产物（多数是无毒性、无感染能力，但具有较强的免疫原性）用作疫苗二、基因工程疫苗1051、亚单位疫苗

利用病原物的某一部分制得的疫苗明确编码具有免疫活性的特定抗原的DNA，一般选择病原体表面糖蛋白编码基因对于易变异的病毒(如A型流感病毒)则可选择各亚型共有的核心蛋白的主要保护性抗原基因序列应用重组DNA技术研制亚单位疫苗，还必须有合适的表达系统用来生产基因产物1、亚单位疫苗利用病原物的某一部分制得的疫苗106优点：①避免了直接使用病原物而使接受者可能致病的危险②亚单位疫苗利用纯化的蛋白质作为免疫源，可以避免由于外源蛋白、核酸的混杂等造成的种种副作用③有时单独使用特异蛋白能增加疫苗的效果优点：107局限性：①纯化单一的蛋白质十分昂贵②纯化后的蛋白质的构象与在体内可能不同，从而导致抗原性发生变化③亚单位疫苗一般不具有感染性不能激活MHCI分子，也很难激活杀伤性T细胞，激活的免疫反应一般较弱

制备亚单位疫苗的基本前提是鉴定出病原物中哪些成分能激活机体产生抗体局限性：1082、肽疫苗衣壳蛋白组成的外壳病毒衣壳病毒核酸短肽衔接物2、肽疫苗衣壳蛋白组成的外壳病毒衣壳病毒核酸短肽衔接物109只有位于病毒衣壳外表可以与抗体结合的蛋白质，其结构域才能引起免疫反应类似于抗原决定簇的小肽充当疫苗双肽：两个肽段连接形成一个较长的肽

不用载体蛋白保护，比其他任何一个肽段单独使用更加有效与强免疫原性的载体蛋白－乙肝核心蛋白基因连接只有位于病毒衣壳外表可以与抗体结合的蛋白质，其结构域才能引起110限制因素：①充当抗原抗原决定簇的肽段不能太长，而且要连续②要求肽段的构象必须与完整病毒上的抗原决定簇构象一致③要求选定的单一抗原决定簇必须要有足够强的免疫原性限制因素：111三、DNA免疫基因免疫、核酸免疫Wolf（1993）将流感病毒核蛋白P抗原基因直接注射到小鼠骨骼肌引起免疫反应，产生多种亚型TK细胞。目前已经进行的研究：轮状病毒、单纯疱疹病毒、乙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒、狂犬病毒、结核杆菌亚单位疫苗等三、DNA免疫基因免疫、核酸免疫112“裸”DNA疫苗不含肽、蛋白质或病毒载体，只是由来源于病原体的一个抗原编码基因及作为其载体的质粒DNA组成这段抗原编码基因可在活体细胞中控制合成抗原蛋白，从而引起免疫反应“裸”DNA疫苗113优越性DNA比蛋白质更稳定，DNA在制成干粉后可以保存的时间较长大规模生产比蛋白容易，成本低任何DNA片段都可以插入质粒中制成疫苗，而且在同一质粒上可以同时容纳一个以上的抗原基因DNA疫苗对于目前难以用常规疫苗防治的疾病的预防和治疗有重要的意义用于癌症等疑难疾病治疗优越性DNA比蛋白质更稳定，DNA在制成干粉后可以保存的时间114局限性免疫效力低，剂量越大，所引起的免疫反应越强；接种在体内的DNA的最终下落尚不清楚（有可能最终被细胞内的各种酶所降解，也有可能DNA整合入宿主基因组）局限性免疫效力低，剂量越大，所引起的免疫反应越强；115第七章现代分子诊断技术酶联免疫吸附测定DNA诊断系统DNA指纹遗传性疾病的分子诊断技术

第七章现代分子诊断技术酶联免疫吸附测定116基因诊断基因蛋白质性状生化诊断基因诊断临床诊断基因诊断基因蛋白质性状生化诊断基因诊断临床诊断117传统的诊断程序先要对病原物质进行培养，培养后再分析它的生理学特性确定它到底是哪一类的病原物，是病毒、细菌，还是其他物质实践证明:比较有效,检测到病原微生物相对比较特异诊断成本高、速度慢、效率低如砂眼衣原体、朊病毒传统的诊断程序118方法优点缺点显微镜镜检简单易行，可直接观察到寄生虫的形态速度慢，灵敏度低，对经验水平要求高费时费工，无法辨别形态相近的寄生虫体外培养、接种能检测到活的寄生虫，并可检测感染性和感染程度速度慢、花费高，寄生虫可能难以进行体外培养，且必须使用动物材料抗体检测简单、快速、能够实现自动化，可用于检测大量的样品无法区分活的寄生虫与处在潜伏状态的寄生虫。有时会有非特异反应发生DNA杂交及PCR快速灵敏，能够实现自动化，可以分辨不同种的寄生虫，不需要以前有寄生虫感染病史花费高，步骤多，无法区分活的和死的寄生虫，有时会有假阳性或假阴性

检测寄生虫感染的诊断方法的比较方法优点缺点显微镜镜检简单易行，可直接观察到寄生虫的形态速度119现代分子诊断技术主要是指应用免疫学和分子生物学的方法对病原物质进行诊断检测一种有效的诊断方法应具备：1、专一性（specificity）强，诊断只对某一种病原菌分子产生阳性反应2、灵敏度(sensitivity)高3、操作简单(simplicity)现代分子诊断技术主要是指应用免疫学和分子生物学的方法对病原物120基因诊断的特点特异性高检测目标是基因，为原始的致病因素灵敏度高待测标本往往微量，目的基因只需pg水平稳定性高基因的化学组成为核酸，比蛋白质稳定，且不需处于活性状态诊断范围广，适应性强确切的诊断，也能确定与疾病的关联状态临床应用前景好基因诊断的特点特异性高121基因诊断优点从基因水平彻底揭示疾病的病因及发病机制显著提早产前诊断的时间无需对组织、器官或细胞进行选择快捷准确、安全基因诊断优点从基因水平彻底揭示疾病的病因及发病机制122基因诊断常用的技术核酸分子杂交PCR（聚合酶链式反应）限制性酶切分析SSCP（单链构象多态性分析）DNA测序DNA芯片技术基因诊断常用的技术核酸分子杂交123DNASouthernblot,FISH,PCR,Sequencing,micoarray,restrictionanalysis,RFLP，SSCPRNANorthernblot,RT-PCR,micoarraysProteinWesternblot,Immuno-histochemistry,microarrayDNA124SouthernblotNNTTNTTSouthernblotNNTTN125

FISHFISH126PCR技术PCR技术127DNA测序DNA测序128

指在固相支持物上原位合成寡核苷酸或者直接将大量探针以显微打印的方式有序地固化于支持物表面，然后与标记的样品杂交，通过对杂交的检测分析，得出样品的遗传信息（基因序列及表达的信息）

由于在制备过程中运用了计算机芯片的制备技术如显微光蚀刻、显微打印等，且常用硅芯片作为固相支持物，所以称为DNA芯片技术DNA芯片技术的概念指在固相支持物上原位合成寡核苷酸或者直接将大量129DNA芯片技术原理大规模集成的固相杂交

基本原理是核酸分子杂交，即依据DNA双链碱基互补配对、变性和复性的原理

以大量已知序列的寡核苷酸、cDNA或基因片段作探针，检测样品中哪些核酸序列与其互补，然后通过定性、定量分析得出待测样品的基因序列及表达的信息DNA芯片技术原理大规模集成的固相杂交以大量已知序列的寡核130DNA芯片技术流程BiologicalSampleAnalyzedataScannermicroarray“Hybridize”arrayerMicroarrayfabricationSamplepreparationMolecularhybridizationDetectionandanalysisDNA芯片技术流程BiologicalAnalyzedat131现代分子诊断技术详述132基因诊断的原理利用分子生物学和分子遗传学的技术，从DNA或RNA水平检测、分析基因的存在、变异和表达状态，从而对疾病做出诊断的方法策略检测已知的能产生某种特定功能蛋白的基因检测与某种遗传标志连锁的的致病基因检测表型克隆基因基因诊断的原理利用分子生物学和分子遗传学的技术，从DNA或R133基因治疗的机理

基因置换：正常基因取代致病基因基因修正：纠正致病基因的突变碱基序列基因修饰：目的基因表达产物补偿致病基因的功能基因抑制：外源基因干扰、抑制有害基因的表达基因封闭：封闭特定基因的表达“自杀基因”的应用免疫基因的治疗耐药基因的治疗基因治疗的机理基因置换：正常基因取代致病基因134

美国医学家W·F·安德森等人对腺甘脱氨酶缺乏症（ADA缺乏症）的基因治疗，是世界上第一个基因治疗成功的范例

1990年9月14日，安德森对一例患ADA缺乏症的4岁女孩谢德尔进行基因治疗。这个4岁女孩由于遗传基因有缺陷，自身不能生产ADA，先天性免疫功能不全，只能生活在无菌的隔离帐里。他们将含有这个女孩自己的白血球的溶液输入她左臂的一条静脉血管中，这种白血球都已经过改造，有缺陷的基因已经被健康的基因所替代。在以后的10个月内她又接受了7次这样的治疗，同时也接受酶治疗。经治疗后，免疫功能日趋健全，能够走出隔离帐，过上了正常人的生活。

谢德尔，1999美国医学家W·F·安德森等人对腺甘脱氨酶缺乏症（AD135现代分子诊断技术详述136现代分子诊断技术详述137现代分子诊断技术详述138

分子诊断利用PCR技术或PCR与分子杂交标记相结合，可以快速准确地检测出病原性物质。分子诊断利用PCR技术或PCR与分子杂交标记相结合，可以快139

分子诊断遗传性疾病的诊断羊水和胎盘绒毛膜检测分子诊断遗传性疾病的诊断羊水和胎盘绒毛膜检测140第一节酶联免疫吸附测定抗体高度特异地与抗原分子结合通过抗原-抗体的特异识别反应进行检测酶联免疫吸附测定(enzyme-linkedimmunosorbantassay,ELISA)第一节酶联免疫吸附测定抗体高度特异地与抗原分子结合酶联免疫吸141一、酶联免疫吸附测定的原理工作原理：主要是利用了一抗与目标分子的特异性结合假定目标分子是一种蛋白质，那么要得到可用于检测的抗体，则首先需要纯化出这种蛋白质，然后用纯化的蛋白质免疫动物（一般是兔子），在免疫过程中兔子的血清就会产生多克隆抗体一、酶联免疫吸附测定的原理工作原理：142二、检测过程：①将待测样品结合在固相支持物（如96孔的微量滴定板）上②加入可以与目标分子特异反应的抗体，即一抗（primaryantibody）,反应后冲洗，将未结合上的一抗洗去③加入二抗（secondaryantibody），二抗通常只特异地识别一抗，而不识别目标分子（二抗上还连着一种酶，如碱性磷酸酶、过氧化物酶或脲酶等，这些酶都能够催化一种化学反应将无色底物转变成有色物质），一抗与二抗反应完成后，再次冲洗将未与一抗结合的二抗洗去④加入无色底物二、检测过程：143双抗体夹心法检测大分子抗原双抗体夹心法检测大分子抗原144间接法检测抗体间接法检测抗体145竞争法测定小分子抗原或半抗原，也可测定抗体竞争法测定小分子抗原或半抗原，也可测定抗体146双夹心法测定大分子抗原特异性相同，来源不同双夹心法测定大分子抗原特异性相同，来源不同1473、使用多克隆抗体的缺点①同一抗体混合物中不同抗体的含量会有差异，而且每次制备的抗体的量之间也会有差异②无法区别相类似的目标分子：如果病原分子与非病原分子之间只相差一个抗原决定簇，这时多克隆抗体就无法区分，因为在ELISA检测中都会发生颜色变化单克隆抗体特异性强

只结合抗原上某一单一位置3、使用多克隆抗体的缺点1484、酶联免疫吸附测定的局限性仅凭ELISA结果容易造成误诊，ELISA检测只能作为一种初步的检测手段，要进一步确诊还必须进行western检测要提高ELISA检测的准确度,就必须提高一抗的特异性在使用抗体时，要求其抗原的编码其目标识别位点的基因要表达，而且目标位点不能够以任何方式被覆盖或阻断，否则都将影响抗体与抗原的结合4、酶联免疫吸附测定的局限性149第二节DNA诊断系统DNA诊断的理论基础：任何一个决定生物学特性的DNA序列都应该是独特的，都可以作为专一性的诊断标记第二节DNA诊断系统DNA诊断的理论基础：任何一个决定生物150一、核酸杂交1、工作原理：

◆两条DNA链之间可以通过碱基配对而形成氢键2、3个关键要素：

★探针DNA

★目的DNA

★

信号检测一、核酸杂交1、工作原理：151主要依据：碱基互补、变性和复性

DNA与DNA杂交：

A=T、G≡C;

DNA与RNA杂交:

A=U、G≡C;

变性：

在一定温度下，使核酸双链解开为两条单链；

复性：

随温度逐渐恢复，变性的两条单链重新形成互补双链碱基互补主要依据：碱基互补、变性和复性碱基互补152现代分子诊断技术详述153核酸分子杂交（固相杂交）操作程序制备待测核酸样品分离、变性、转移、固化DNA片段杂交加入标记核酸探针检测杂交信号标记核酸探针预杂交制备核酸探针漂洗去除未参与杂交的标记探针核酸分子杂交（固相杂交）操作程序制备待测核酸样品分离、变性、1543、杂交探针必须是高度特异性的DNA片段种级探针：区分两个或多个物种亚种级探针：区分物种内特定的株系DNARNA化学合成或克隆的完整基因基因的一个片段3、杂交探针必须是高度特异性的DNA片段155

利用核酸双链的碱基互补、变性和复性的原理，可以用已知碱基序列的单链核酸片段作为探针，与待测样本中的单链核酸互补配对，以判断有无互补的同源核酸序列的存在

核酸探针

是指带有标记的某一特定DNA或RNA片断，能与待测样本中单链核酸分子互补配对结合，进而检测同源序列

探针标记物有放射性核素或非放射性核素（生物素、地高辛、荧光素等）两大类利用核酸双链的碱基互补、变性和复性的原理，可156分离杂交探针的方法：提取某一病原微生物株系的染色体DNA限制性内切酶进行酶解得到的酶解片段克隆进一质粒载体，构建质粒文库文库中重组质粒的插入片段即可用来分别同病原性微生物和非病原性微生物的核DNA进行杂交、筛选分离杂交探针的方法：157核酸杂交的灵敏度和可靠性极高用探针直接同粪便样品、尿样、血样、喉洗液和组织样品中的目标DNA进行杂交，且无需预先纯化DNA若样品中的目标分子非常少，则需通过PCR将目的序列扩增，再进行杂交检测

从理论上讲，用DNA杂交来诊断疾病可用于对所有的致病微生物的检测核酸杂交的灵敏度和可靠性极高1584、非同位素标记探针32P的缺点：⑴半衰期短，仅13天⑵操作起来比较危险⑶必须要有特殊的实验室设备进行操作⑷放射性垃圾的处理繁琐4、非同位素标记探针32P的缺点：159非放射性杂交检测系统：通过酶促反应将某种底物转变成生色物质或化学发光物质而达到放大信号的目的采用将生物素（biotin）标记的核苷酸掺入DNA的方法制备探针生物素标记的DNA在室温下至少可保存一年检测发光和颜色变化可在几小时内完成非放射性杂交检测系统：160BBBBAPBBAP生物素加入链霉素抗生物蛋白加入生物素标记的碱性磷酸酶探针目的DNA加入不同的生色或化学发光底物BBBBAPBBAP生物素加入链霉素抗生物蛋白加入生物素标记161荧光标记的引物直接进行PCR检测DNA引物1引物2荧光染料PCR层析荧光检测游离引物荧光标记的引物直接进行PCR检测DNA引物1引物2荧光染料P162分子夹心探针检测发出荧光分子夹心探针(没有荧光)荧光团猝灭剂目的DNA与目的DNA杂交分子夹心探针检测发出荧光分子夹心探针(没有荧光)荧光团猝灭剂163TaqMan探针技术原理：利用Taq酶的3′5′外切核酸酶活性，切断探针，产生荧光信号，由于探针与模板特异性结合，荧光的强弱就代表了模板的数量TaqMan探针技术原理：1643′5′5′3′QR上游引物下游引物5

′3′3′5

′QRTaqMan探针的荧光信号产生机制3′5′5′3′QR上游引物下游引物5′3′3′5′QR165疟疾的分子诊断：检测是否存在疟原虫抽取血样进行镜检免疫诊断:ELISA检测疟原虫蛋白或抗体

无法区分是以前感染还是现在感染DNA杂交诊断例一：疟疾的分子诊断：检测是否存在疟原虫例一：166DNA的杂交探针是一段疟原虫的高度重复的DNA序列具体的分离过程：构建一个疟原虫的核基因文库用标记的疟原虫核DNA作探针去筛选核基因文库选出那些杂交信号最强的克隆用这些选出来的片段作探针，与疟原虫及其同属中不导致疟疾的种的核基因作杂交，以检查该片段作为DNA探针的可靠性DNA的杂交探针是一段疟原虫的高度重复的DNA序列167锥虫的检测

锥虫在人体中可侵入肝、脾、淋巴结、中枢神经系统，在其中大量繁殖并杀死寄主细胞显微镜检新鲜血液取新鲜血液感染未携带锥虫的寄生虫,30-40天后杀死昆虫,镜检昆虫的肠道免疫检测:假阳性高例二：锥虫的检测

锥虫在人体中可侵入肝、脾、淋巴结、中枢神经系统，168PCR检测针对锥虫特有的一段188bp的DNA序列设计引物，特异地从锥虫基因组中扩增得到188bp的条带PCR检测169二、细菌性传染病及病毒性疾病的分子诊断技术抗生素的不合理使用DNA杂交PCR检测噬菌体介导二、细菌性传染病及病毒性疾病的分子诊断技术抗生素的不合理使用170DNA杂交设计16SrRNA为探针16SrRNA在细菌中拷贝数极高，高度的保守性特异性不是很好必须结合PCR技术DNA杂交设计16SrRNA为探针171PCR检测nestedPCR针对目的病原菌的不同保守区段设计多对引物每对引物都能特异的扩增出一段目的片段，病原菌存在的可能性大大增加PCR检测nestedPCR172模板使用外引物，进行第一次PCR扩增使用内引物，进行第二次PCR扩增第一次PCR扩增产物第二次PCR扩增产物巢式PCR原理示意图模板使用外引物，进行第一次PCR扩增使用内引物，进行第二次P173PCR技术也会产生假阳性新扩增的目的DNA特异性不强退火温度过低模板中杂质的污染假阴性存在Taq酶的抑制剂模板量过少模板DNA纯度不够PCR技术也会产生假阳性174原位PCR(insituPCR,ISPCR)在细胞或细胞切片上对待测的低拷贝数基因进行扩增，并通过原位杂交进行检测不仅能检测出病原微生物的存在，且能够在组织细胞中定位原位PCR(insituPCR,ISPCR)175原位杂交（nucleicacidhybridizationinsitu）

将标记探针与细胞或组织切片中的核酸进行杂交，进而检测特异的DNA或RNA序列

细胞原位杂交

组织切片原位杂交

DNA-DNARNA-DNA

三类杂交

RNA-RNA

该法优点：不需提取核酸，故可完整保持组织或细胞的形态，因而更能准确地反映组织细胞的功能状态有原位杂交（nucleicacidhybridizatio176噬菌体介导细菌检测将荧光素酶基因引入到噬菌体的基因组，然后用转基因噬菌体去侵染待测样品噬菌体侵染该宿主菌，大量合成包括荧光素酶在内的由噬菌体基因编码的蛋白，向体系中加入荧光素和ATP，就会有荧光产生结核菌的检测抗药性菌株的检测噬菌体介导细菌检测将荧光素酶基因引入到噬菌体的基因组，然后用177荧光素酶荧光素＋ATP荧光利用宿主细胞转录、翻译噬菌体基因荧光素酶基因宿主细菌噬菌体介导的细菌检测荧光素酶荧光素＋ATP荧光利用宿主细胞转录、翻译噬菌体基因荧178第三节DNA指纹每个人体细胞内都含有23对染色体，每条染色体中部含有一个DNA分子，DNA分子中的核苷酸序列包含着遗传信息，在DNA分子中存在三种类型：单拷贝序列、中等程度重复序列、高度重复序第三节DNA指纹每个人体细胞内都含有23对染色体，每条染色179每个重复序列在300个核苷酸长度之内，由于高度重复，序列经过超离心后以卫星带出现在主要DNA带的附近，所以也称卫星DNA，其中的重复序列单元则称为“小卫星DNA”“小卫星”具有高度的可变性，但在“小卫星DNA“中有一小段序列则在所有个体中都一样，称为“核心序列”。如果把核心序列串联起来作为分子探针与不同个体的DNA进行分子杂交，就会出现各自特有的杂交图谱。它们与人的指纹一样具有专一性和特异性，因此称作“DNA指纹”通过对人类基因组的解析，发现人与人之间99．99％的碱基序列都相同，而剩下的0.01%的碱基特征序列则来自于双亲，据此可用于“亲子鉴定”每个重复序列在300个核苷酸长度之内，由于高度重复，序列经过180所罗门的审判：

大家都听说过所罗门的审判这样一件故事：两位妇人都声称自己是孩子的母亲，于是所罗门就命令一名侍卫把那个孩子带来，要用剑将其辟成两半分给他们两，结果假母亲同意所罗门的判决，而孩子真正的母亲却恳求侍卫饶了孩子的性命，她解释说：“把孩子给了假母亲，总比让孩子惨死好。”当然，真假母亲也就水落石出了。所罗门的审判：大家都听说过所罗门的审判这样一件故事：181滴骨验亲法：

以生者的血滴在尸骨上，观察血能否浸入骨内，浸入的则被认为两者有血缘关系，在各种古籍中有多种记录。三国时代（公园220—280年）谢承著《会稽先贤传》中的《以弟血滴兄骨》可能是记录此法的最早的史料：陈业的哥哥因海难不幸殒命，当时一同遇难的有五六十人，并且尸体都已严重腐败而无法辨认死者的身份。陈业就用刀刺破自己的手臂将血分别滴在尸骨上，发现其血液只能浸入一具尸骨，其余皆不能。陈业就这样确认其兄的尸骨。滴骨验亲法：以生者的血滴在尸骨上，观察血能否浸入骨182合血法：

等到了明代，更是采用了“合血法”来识别亲权。明末清初的检验书籍中都有相同的记载：“亲子兄弟或自幼分离，欲相认识。难辨真伪。命各刺出血，滴一器内，真则共凝为一，否则不凝也。”合血法：等到了明代，更是采用了“合血法”来183方法：DNA指纹是指对待测样品中的DNA进行分析所得到的具有特征性的DNA分子杂交图谱DNA酶解电泳转膜杂交最常用的DNA探针是微卫星序列受害者血样犯罪嫌疑人衣物上血样犯罪嫌疑人血样方法：DNA指纹是指对待测样品中的DNA进行分析所得到的具有184现代分子诊断技术详述185现代分子诊断技术详述186第四节遗传性疾病的分子诊断技术直接诊断点突变间接诊断多态性连锁分析第四节遗传性疾病的分子诊断技术直接诊断187

美国前副总统汉弗莱<Humphrey)在1967年发现膀胱内有一肿物，病理切片未发现癌细胞良性“慢性增生性囊肿”，未进行手术治疗。九年后，他被诊断为患有“膀胧癌”，两年后死于该病。美国前副总统汉弗莱<Humphrey)九年后188

1994年，研究者用灵敏的PCR技术对上述汉弗莱1967年的病理切片进行了P53抑癌基因检查，发现那时的组织细胞虽然在形态上还没有表现出恶性变化，但其P53基因的第227个密码子已经发生了一个核苷酸的突变。就是这个基因的微小变化，使其抑癌功能受损，导致九年后细胞癌变的发生。这说明，在典型症状出现之前的很长时间，细胞癌变的信息已经在基因上表现出来了P53抑癌基因1994年，研究者用灵敏的PCR技术对上述汉弗莱1967189遗传性疾病的分子诊断技术PCR－酶解鉴定PCR／OLA鉴定PCR-ELISA检测PCR-DGGE鉴定扩增阻滞突变系统（amplificationrefractorymutationsystem,ARMS）连接酶链反应（LCR）遗传性疾病的分子诊断技术PCR－酶解鉴定190镰刀形细胞贫血症(sickle-cellanemia)典型的单基因遗传性疾病血红蛋白的β链（β珠蛋白）的第六个氨基酸Glu发生突变成Val镰刀形细胞贫血症(sickle-cellanemia)典型191血红蛋白-链上谷氨酸变成缬氨酸血红蛋白-链上谷氨酸变成缬氨酸192

英国女王维多利亚。她带有血友病基因，并将其传给了她的儿女。血友病是一种遗传性凝血障碍疾病，患者可能因很小的伤口而出血不止导致死亡。血友病在女性一般表现为隐性遗传，较少发病，但会传给后代；在男性则表现为显性遗传，显示出病症。维多利亚女王在科堡主持的一次欧洲王室成员集会，与会者有17人是她的后裔，其中有她的孙女亚历山德拉（21），她同俄国沙皇尼古拉二世结婚，导致他们的儿子患有血友病。

血友病基因英国女王维多利亚。她带有血友病基因，并将其传给193一、PCR－酶解鉴定

正常基因为CCTGAGG镰刀形贫血病患者的基因为CCTGTGG限制性内切酶CvnI的识别序列为CCTNAGG一、PCR－酶解鉴定正常基因为CCTGAGG194方法:在CvnI位点的两点设计两个引物;包含CvnI位点区域的DNA片段通过PCR扩增出来;扩增的DNA用CvnI酶处理，酶解产物用凝胶电泳分开，经溴化乙锭染色后就可在紫外灯下检查DNA带型。方法:19538225620118188条带大小(bp)正常纯合子杂合子突变纯合子CvuI处理CvuICvuICvuI256bp201bp181bp88bpCvuICvuI256bp382bp88bp正常情况镰刀形细胞贫血症PCR扩增引物1引物2PCR产物（长726bp）382条带大小(bp)正常纯合子杂合子突变纯合子CvuI处理196二、PCR/OLA鉴定OLA(oligo-nucleotideligationassay),寡聚核苷酸连接分析假定一个正常的基因在一个特定的位置发生了突变，比如说150位的T突变为G

根据150位两边的序列，人工合成两段短的核苷酸链，使这两段寡聚核苷酸链与基因的一条链互补探针X：寡聚核苷酸链的3’端最后一个核苷酸正好与正常基因的150位的的核苷酸配对探针Y：另一段寡聚核苷酸链的5’端第一个核苷酸与151位的核苷酸配对二、PCR/OLA鉴定OLA(oligo-nucleotid197正常基因

探针X3’端最后一个核苷酸就不会与目的基因150位的核苷酸配对由于3’最后一个核苷酸不配对而使两个探针无法实现连接目的基因突变两探针与目的基因的完美配对两个探针就可连接起来加入DNA连接酶正常基因探针X3’端最后一个核苷酸就不会与198B150151DBD150151BXY150151DBD双链目的DNA或PCR产物热变性单链目的DNA或PCR产物加探针退火完全配对模板有突变,不完全配对连接酶连接酶加入链霉抗生物素蛋白加入链霉抗生物素蛋白B150151DBD150151BXY150151DBD双链199BDB加入碱性磷酸酶加入无色底物加入碱性磷酸酶加入无色底物BDAP变色无色底物有色底物B保持无色无色底物PCR/OLA分析程序示意图BDB加入碱性磷酸酶加入碱性磷酸酶BDAP变色无色底物有色底200例：特异性互补寡核苷酸法检测镰状红细胞贫血症（1）提取DNA，热处理成为单链DNA；（2）以单链DNA为模板，仅对可能发生突变的核苷酸区域设