生命科学中的分析化学课件

生命科学中的分析化学2103级生物取向—王钰珅※主要内容简介

伏安分析发光分析<1>电化学分析<2>光化学分析电化学传感器荧光分析反应质谱法(RMS)电子喷雾质谱法(ESMS)<3>质谱分析──→快原子轰击质谱(FABMS)离子喷雾质谱法(ISMS)等离子体解吸质谱(PIMS)高效液相色谱(HPLC)<4>色谱分析毛细管区带电泳(CZE)※电化学分析在生命科学中的应用☆★伏安分析伏安分析法可用于测定生物大分子[2-6],利用胆红素、卟啉等与金属离子的配合物极谱波可测定胆红素、卟啉等。利用线性扫描伏安法可同时测定次黄嘌呤、黄嘌呤、尿酸等,利用循环伏安法可快速测定肾上腺素、去肾上腺素等,利用差示脉冲伏安法可快速测定细胞色素C。对于无电活性的氨基酸,可将其与醛反应产生电活性物进行测定。刀豆球蛋白在α,α—联吡啶溶液中可产生极谱波,加入葡萄糖与刀豆球蛋白发生免疫反应,可用示波极谱法进行测定。采用亚硝化反应吸附溶出伏安法测定衍生化后的雌二醇、雌三醇、黄体酮等激素,灵敏度可达10-10mol·L-1。单扫描示波极谱法与免疫反应结合可测定乙型肝炎表面抗原,灵敏度为0.5ug.L-1。※电化学分析在生命科学中的应用▲▼酶传感器~微生物传感器~免疫传感器

酶传感器是利用酶在生物化学反应中特殊的催化作用,使糖类、尿素、有机酸甚至磷酸三腺苷(ATP)等生物分子在常温下分解、氧化,从而检测反应过程中消耗或产生的化学物质,以测定生物分子。例如,将胆固醇脂酶固定在牛血清蛋白上制成光纤胆固醇传感器,可测定血清中胆固醇含量〔8〕。酶传感器主要有GPT(谷氨酸丙酮酸转氨酶)传感器、胆固醇传感器、胆甾醇传感器、腺苷传感器、尿素传感器等。

微生物传感器是将微生物膜修饰在氧电极或其它电极上组成的传感器,可用于测定各种微生物。如BOD(生物耗氧量)传感器,变异原传感器。

免疫传感器是利用抗原与抗体间的专属性反应制备出的高选择性、高灵敏度的传感器。如HCG(绒毛膜促性腺激素)传感器可方便地用于怀孕与否的检查,AFP(α—甲胎蛋白酶)传感器可用于肝癌诊断。※电化学分析在生命科学中的应用▲▼微电极~化学修饰电极

微电极用作电化学探针,可检测动物脑神经传递物质的扩散过程。在电化学免疫分析中,用20uL样品可测定10-18mol.L-1免疫球蛋白-G,采用微电极可将样品量降低至nL级,可测量10-19—10-20mol.L-1的物质。用微电极还可测定单个细胞中的神经递质

化学修饰电极的方法可将生物大分子牢固地固定在单晶基体上,再采用STM(扫描隧道显微镜)和AFM(原子力显微镜)技术,可以在生命的天然或准天然条件下对生物样品的构型进行不同视野的观察,分别获得接近分子水平、超分子水平、亚分子水平及原子水平的图像,对研究生物大分子的形貌及变性、失活过程,对揭示生命过程的本质具有重要意义。※光化学分析在生命科学中的应用☆★发光分析生命活动过程中具有弱发光现象,发光强度与生物体内的某些生化反应具有内在联系,和环境有相关联系,利用发光分析可研究生命过程,测定生命物质。五十年代起人们建立了以化学—生物发光为基础的发光分析,并用于微量成份的测定。八十年代起,人们将发光分析与免疫反应相结合产生了发光生物传感技术,使生物体内的信息在体外获取成为可能[9-10]。九十年代起发光分析开始应用于分子生物学研究,运用发光标记技术制备基因探针,在基因工程、遗传工程中发挥了重要作用。发光分析的具体应用有:ATP(三磷酸腺苷)的测定,酶活力的测定,吞噬发光与机体免疫功能的测定,血清发光诊断炎症及肿瘤。发光免疫分析与流动注射结合是测定乙肝病毒表面抗原的有效方法〔11〕。※光化学分析在生命科学中的应用☆★荧光分析荧光分析具有很高的灵敏度和选择性,激光荧光分析可以接近或达到检测灵敏度的极限—单原子或单分子[12]。利用荧光探针可测定RNA和DNA,还可以区分不同构象的核酸,如区分线状DNA,环状DNA及超级线团DNA。荧光分析还是研究DNA碱基损伤修复以及与有关药物的化学反应活性部位的理想工具[13]。1987年美国应用生物化学系统公司推出了以荧光分析为基础的DNA序列测定仪,采用电泳分离,荧光标记,实现了对DNA的自动分析。采用时间分辩荧光免疫法可鉴定微量血痕种属,灵敏度高,适用于法医常规检测〔14〕。※光化学分析在生命科学中的应用

用阿达玛变换分子荧光法可同时测定单细胞中微量组份的精确含量、分布及三维图像,可测定单细胞中ng级的DNA、RNA、蛋白质细胞钙。可进行癌细胞病理研究,对单细胞核DNA倍体和形态精确测定,可以预测癌变,确诊癌症并监测治疗效果。

激光诱导荧光光谱在活细胞、活体体液、DNA碱基序列和细菌病原体的鉴定中发挥了重要作用,在恶性肿瘤的早期诊断和治疗中已取得了可喜的进展。七十年代发展起来的流式细胞计就是利用激光诱导荧光光谱法原理设计的细胞定量分析仪器,它可提供生物细胞的基本信息,从而了解生物物质内在本质变化,在肝细胞倍体以及混合细胞群中各亚群细胞的DNA含量的测定、癌细胞动力学研究和化疗癌病患者治疗的监测等方面已获得了广泛应用。※质谱分析在生命科学中的应用☆★快原子轰击质谱(FABMS)

1981年Barber创立的FABMS是分析低分子量肽的有效方法。Barber研究了蜂毒素、胰高血糖素、胰岛素B链、牛胰岛素、人胰岛素原等多肽和蛋白质。若将蛋白质酶解后进行质谱分析,测定各组份的分子量,再根据酶解选择性确定蛋白质序列结构,最终可得“肽图”。聚糖、糖苷和糖蛋白的分析比肽的分析难度更大,不仅要求分子量测定和糖基序列分析,而且还要进行苷键联接点测定和立体化学分析。用FABMS可分析聚糖的连接方式,用FABMS/MS可测定糖苷的结构,对于糖蛋白的分析,一般是先将蛋白和糖基分开,再进行FABMS分析。目前,利用反应质谱法已进行了糖的立体化学分析。※质谱分析在生命科学中的应用☆★离子喷雾质谱法(ISMS)

ISMS可方便地用来测定一种可阻止器官移植后组织排斥的环状肽(cyclosporine)的序列,这是用普通仪器很难做到的。ISMS法还可分析质量非常接近的类蛋白,测定马体中肌红蛋白(分子量16950.5dalton)时,分子量可准确到0.2dalton,而且由于灵敏度高,只需3×10-15mol肌红蛋白样品。有关酶和抑制因子体系的共价键、立体专一性以及化学计量学的确定,用传统方法需要进行同位素标记合成,费时费力,用ISMS可在几分钟内解决问题。类牛胰岛素一I具有刺激癌细胞生长的功效,ISMS法为识别癌细胞调节中心的肽段提供了一种有用的方法。现在的许多新药都是多肽或蛋白,对这些药物的质量检验是一项较困难的任务,ISMS法可解决这一难题。※色谱分析在生命科学中的应用☆★高效液相色谱(HPLC)

色谱分析在生命科学中占有突出地位,HPLC法分析、分离和纯化生物大分子物质是目前极为活跃的研究领域[16-23]。借助于新的取样技术—微透析,用HPLC法可直接测定病人血清中肌肝含量,利用微型柱HPLC可测定肾上腺素、去肾上腺素,利用非多孔填料的HPLC可对各种蛋白质进行分离,利用反相HPLC可分离核苷酸、核苷、脱氧核苷酸、脱氧核苷和碱,可测定重组人肿瘤坏死因子衍生物,利用HPLC法及HPLC—MS联用技术用于人体体液中代谢产物的测定也多见报道。HPLC引入生物技术领域,对生物工程已产生深远的影响,其描绘生物大分子的分离机理和手性分子分离中的三点作用一直受到很大重视,单克隆及多克隆抗体配基和各种基质键合得到的亲和色谱固定相的研究已广泛开展,目前已出现以蛋白质为对象的专用色谱柱。※色谱分析在生命科学中的应用☆★毛细管区带电泳(CZE)

CZE由于柱效高(可达到106板/m)、灵敏度高、易自动化,又由于载体可容纳分子量极大的生物样品(如细菌和病毒颗粒),因此在生命科学中有重要应用[24-28]。CZE可分离人体血清蛋白,可分析人体血红蛋白、同工酶,可分析重组人胰岛素原,可分离血红蛋白变异株,CZE与免疫消去法结合还可分析免疫球蛋白。Kim[29]用CZE分析了患有肝硬化,肾病综合症、多克隆g病患者的血清,Matsubara〔30〕在CZE中使用非离子表面活性剂,分离了24种丹磺酰氨基酸。目前已可根据电荷和分子形状的差别分离生物聚合物,测定DNA顺序和DNA合成中产物的纯度,甚至可进行单个细胞的研究。加入含金属离子的手性缓冲液,还可进行多肽的手性分离。