缺氧诱导因子1α在实验性大鼠肾间质纤维化过程中的作用

缺氧诱导因子1α在实验性大鼠肾间质纤维化过程中的作用

[11-03-2315:46:00]

编辑：studa20

作者：罗燕萍,李晶,芮金兵,何建强,王晓明【摘要】

目的：观察单侧输尿管梗阻(ulilateralureteralobstruction，UUO)大鼠模型肾组织中缺氧诱导因子1α(HIF1α)的表达，探讨HIF1α表达水平与肾小管间质纤维化的关系。方法：40只雌性SD大鼠随机分为2组，假手术组，UUO组(每组20只)。制备UUO大鼠模型，术后第7天、第14天处死大鼠，肾组织行HE和Masson染色，免疫组织化学和实时荧光定量PCR(RTPCR)检测HIF1α，Ⅰ型胶原(collagenⅠ,ColⅠ)及α平滑肌肌动蛋白(αsmoothmuscleactin,αSMA)在肾组织中的表达。结果：假手术组与UUO组各时间点肾小管间质纤维化评分比较，差异有统计学意义(P<0.01)。术后HIF1αmRNA水平随梗阻时间延长而递增。UUO组HIF1α蛋白表达量随着肾间质损害加重而增加，HIF1α蛋白主要分布在肾小管，其中以近曲小管表达最明显。HIF1α表达水平与肾小管间质纤维化评分，αSMA和ColⅠ的表达水平均存在正相关(R值分别为0.71，0.68，0.82，P均<0.05)。结论：HIF1α在肾小管上皮细胞内高表达可能参与了肾间质纤维化发生和发展的过程。【关键词】

缺氧诱导因子1α;肾间质纤维化;单侧输尿管梗阻[Abstract]Objective:Toinvestigatetheroleofhypoxiainduciblefactor1alpha(HIF1α)inrenaltubulointerstitiallesionsinducedbyunilateralureteralobstruction(UUO).Methods：Randomly,40femaleSDratsweredividedintoshamoperationgroupandUUOgroup,with20ineach.Theleftureterswereexposed,andintheUUOgrouptheywerealsoligated.Onday7and14,someofthekidneyswereharvestedtostudyinthemtheexpressionsofrenaltubularinterstitialfibrosis,theexpressionsofmRNAsofHIF1α,αsmoothmuscleactin(αSMA)andcollagenⅠ(ColⅠ)withRTPCRandtheexpressionsoftheseproteinsimmunohistochemically.Results：Comparedwithshamgroup,thescoresofrenalinterstitialfibrosisinUUOratswerehighersignificantly.HIF1αmRNAsincreasedwithtimeafteroperationinthekidneysintheUUOrats.AndtheproteinexpressionofHIF1αincreasedinthekidneysobtainedonthe14thdayafteroperation.ImmunohistochemicallyHIF1αmainlyexpressedinrenaltubularepithelialcells,especiallyinproximaltubularcells.TherenaltubulointerstitialexpressionofHIF1αwaspositivelyassociatedwiththescoresofrenalinterstitialfibrosisandtheexpressionofαSMAandColⅠ.Conclusion：HIF1αmayplayanimportantroleinmediatingtherenaltubulointerstitialfibrosis.[Keywords]hypoxiainduciblefactor1alpha;renalinterstitialfibrosis;unilateralureteralobstruction肾间质纤维化(renalinterstitialfibrosis,RIF)是慢性肾脏疾病进展为终末期肾衰的共同途径。肾小管上皮细胞转分化(epithelialtomyofibroblasttransition,EMT)在RIF的发生、发展中起着重要作用[1]。慢性缺氧是导致RIF主要因素之一，而缺氧对肾脏损害的作用主要是通过缺氧诱导因子1α(HIF1α)介导的[2]。HIF1α能够调节多种与RIF有关的细胞因子的表达，增加EMT。所以，HIF1α可能是促进RIF的关键因子[3,4]。已知HIF1α在IgA肾病、大部肾切除、慢性马兜铃酸肾病动物模型肾组织中异常表达，但在肾间质纤维化模型单侧输尿管梗阻(ulilateralureteralobstruction,UUO)大鼠模型肾组织中的表达尚未见报道。本研究通过建立大鼠UUO模型，观察HIF1α在肾组织中的表达，探讨HIF1α与肾小管间质纤维化的关系。1材料与方法1.1药品与试剂小鼠抗大鼠HIF1α单克隆抗体，购自Novus公司(美国)，山羊抗大鼠Ⅰ型胶原(ColⅠ)多克隆抗体及小鼠抗大鼠α平滑肌肌动蛋白(αsmoothmuscleactin,αSMA)单克隆抗体购自SantaCruz公司(美国)，大鼠HIF1α，αSMA，ColⅠ，GAPDH引物由上海生工合成。1.2动物分组选择清洁级SD雌性大鼠40只，8周龄，体质量190～210g(江苏大学实验动物中心提供)，按随机数字法分为2组，假手术组，UUO组，每组20只。①UUO组：制作大鼠UUO模型,大鼠予氯胺酮50mg/kg腹腔注射麻醉,仰卧位固定于手术台上,剪毛后常规消毒,行左侧腹切口,分离左侧输尿管,丝线结扎2道,上一道结扎点位于左肾下极水平,然后结扎点间剪断输尿管，逐层缝合肌肉、皮肤层。②假手术组:假手术组开腹后不结扎输尿管，关闭腹腔，作为对照组。1.3标本采集各组大鼠分别于术后7d，14d处死(n=10),取左侧肾组织，一半常规石蜡包埋切片，一半立即存放于80℃冰箱。1.4检测方法1.4.1肾脏常规病理检查大鼠肾组织经4%低聚甲醛固定过夜，浸蜡，石蜡包埋，制成厚度3μm切片，经HE和Masson染色，光镜下观察肾小管间质病变。1.4.2肾脏免疫组织化学检查使用二步法(Envision显色系统)。脱蜡和水化组织切片。抗原热修复，蒸馏水漂洗，置于三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水(TBS)中。3%H2O2阻断内源性过氧化物酶，孵育10min。蒸馏水漂洗，置于TBS中10min。加入第一抗体(稀释度HIF1α1∶500,αSMA1∶500,ColⅠ1∶500)4℃孵育过夜。TBS漂洗10min。色源底物溶液DAB孵育，光镜控制显色。蒸馏水漂洗，复染及封固。PBS代替一抗为阴性对照，已知阳性片为阳性对照。1.4.3实时荧光定量PCR(RTPCR)检查利用TRIzol一步法提取肾组织总RNA，取2μgRNA进行逆转录合成cDNA。取2μlcDNA作模板用HIF1α，αSMA，ColⅠ和GAPDH引物行PCR扩增(终体积20μl)。在德国RocheLightcyclerPCR仪上进行扩增。反应条件：预变性：95℃10s，20℃1s1个循环,PCR反应:95℃10s，20℃1s，60℃20s，20℃1s，40个循环,溶解曲线分析：95℃10s，20℃1s，65℃15s，20℃1s，95℃10s，0.1℃1s。引物序列和扩增片段长度见表1。数据是通过参照基因GAPDH作标准化处理得到的ΔCT值(ΔCT=各组基因CT-各组参照基因GAPDHCT)，然后再选取代表1倍目的基因表达量的样本为对照因子，处理组样本基因相对于对照组样本基因的量通过公式2-(ΔΔCT)计算得到。ΔΔCT=(实验组ΔCT-对照组ΔCT)。表1PCR引物序列1.5图像分析1.5.1Masson染色肾间质纤维化的半定量分析200倍光镜下，随机选取20个连续不重复的视野，根据蓝色着色的肾间质纤维化区域面积占同视野小管间质总面积的百分比，取各组平均值，积分定义如下：0分(无病变);1分(<10%);2分(～25%);3分(～50%);4分(～75%);5分(>75%)。1.5.2免疫组织化学染色评分肾间质HIF1α，αSMA表达按以下方法评估：0分(肾间质无表达);1分(轻度表达，即表达不超过视野30%);2分(中度表达，即上述面积为31%～60%);3分(重度表达，上述面积超过61%);4分(极重度表达，大面积肾小管萎缩，被大面积表达HIF1α，αSMA组织代替)，计算20个肾皮质高倍视野(×400)分值，取其均值。ColⅠ表达的半定量法：根据光镜下染色在肾间质的分布：0分(无染色);1分(局部染色);2分(轻至中度弥漫染色);3分(重度弥漫染色)，计算20个肾皮质高倍视野(×400)分值，取其均值。以上评分均由3人盲法同时进行，取平均值。1.6统计学方法所有计量数据以±s表示，组间比较采用单因素方差分析，各项指标间相关关系采用Spearman等级相关系数表示,P<0.05为差异有统计学意义。数据计算以SPSS13.0统计软件完成。2结果2.1各组大鼠肾脏病理变化Masson染色结果显示，假手术组各时间点肾脏病理未见明显异常。UUO组各时间点肾小球结构均无明显病理改变,UUO术后7d组肾小管明显扩张，并见萎缩肾小管,间质宽度明显增加。UUO术后14d组萎缩肾小管数量明显增加，间质纤维化更加明显(见图1，2)。2.2肾组织HIF1α，αSMA，ColⅠ蛋白的表达免疫组织化学结果显示，假手术组各时间点肾小管上皮细胞仅有少量HIF1α表达。与假手术组同时间点比较，UUO组术后7d肾小管上皮细胞胞质HIF1α表达显著增加，术后14d肾小管上皮细胞胞质HIF1α表达进一步增强，与UUO术后7d组相比差异有统计学意义(P<0.01)，HIF1α蛋白表达以近曲小管上皮细胞最为明显。假手术组各时间点均无αSMA表达，UUO组术后7d部分肾小管上皮细胞胞质及肾间质区域少许细胞胞质表达