Takara-实验技能讲座之Western-blot课件

蛋白相关产品介绍--WesternBlot上海皓嘉科技发展有限公司蛋白相关产品介绍--WesternBlot上海皓嘉科技发展什么是Westernblot？2

免疫印迹（immunoblotting）又称蛋白质印迹（westernblot），它是根据抗原抗体的特异性结合，检测复杂样品中的某种蛋白质的方法。westernblot是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种新的免疫生化技术。由于免疫印迹具有SDS的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性，现已成为蛋白分析的一种常规技术。用途：常用于鉴定某种蛋白，并能对蛋白的丰度进行定性和半定量分析。HRP标记的二抗HRP底物(Luminol)化学发光

信号什么是Westernblot？2免疫印迹（immunoWesternblot步骤3

Westernblot步骤3样品制备4

细胞裂解蛋白纯化蛋白定量样品制备4细胞蛋白蛋白细胞裂解5

xTractorBuffer635656xTractorBufferKit635623裂解细胞种类：Bacterialcells、MammaliancellsYeastcells、Baculovirus-infectedcellsYeastProteinExtractionReagent9780酵母总蛋白质提取试剂简捷、快速的提取酵母菌总蛋白质的试剂蛋白酶抑制剂ProteoGuard™EDTA-FreeProteaseInhibitorCocktail635672Calpastatin7316细胞裂解液Calpain竞争性抑制剂细胞裂解：比较常用超声波破碎法和酶溶破碎法。细胞裂解5xTractorBuffer635656xTr6

蛋白纯化高特异性的Co2+树脂：TALON系列高产量的Ni2+树脂：His60Ni系列6

组氨酸标签融合蛋白质的纯化6蛋白纯化高特异性的Co2+树脂：TALON系列6组氨酸蛋白定量方法灵敏度时间原理干扰物质说明产品紫外吸收法20-100mg/ml快速

5-10分钟蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基在280nm处的光吸收各种嘌呤和嘧啶；各种核苷酸干扰物质较多Bradford法1-1000μg/ml快速

5分钟考马斯染料与蛋白质结合后，溶液的颜色发生变化。这种颜色的变化与溶液中的蛋白质浓度成正比。表面活性剂：TritonX-100；SDS操作简便；可对含有还原剂的样品进行测定；颜色稳定；颜色深浅随不同蛋白质变化。TaKaRaBradfordProteinAssayKit（T9310A）BCA法0.02-2mg/ml较快速

30分钟内二价铜离子(Cu+2)在碱性条件下被蛋白质的肽键还原成一价铜离子(Cu+)，两个分子的BCA络合一个一价铜离子(Cu+)，形成一种在562nm处有强吸收值的紫色复合物。螯合剂、还原剂：EDTA、EGTA、β-巯基乙醇不受蛋白质种类的影响；对表面活性剂的干扰影响小。TaKaRaBCAProteinAssayKit（T9300A）7

蛋白定量方法灵敏度时间原理干扰物质说明产品紫外吸收法20-18

相关产品方法名称Code包装量价格（元）特点BCA法TaKaRaBCAProteinAssayKitT9300A500次700不受蛋白质种类的影响，在0.02～2mg/ml浓度范围内蛋白质浓度与吸光度值成线性关系；对表面活性剂的干扰影响小；2种操作方法（标准操作方法；低浓度测定操作方法）Bradford法TaKaRaBradfordProteinAssayKitT9310A500次500操作简便，可快速地对浓度范围在1～1,000μg/ml的蛋白质溶液进行定量。可对含有还原剂的样品进行测定；2种操作方法（标准操作方法；低浓度测定操作方法）8

8相关产品方法名称Code包装量价格（元）特点BCA法Ta9

Westernblot步骤9

电泳9Westernblot步骤9电泳电泳(SDS)10

蛋白分子量胶浓度

40kDa～80kDa12.5%小于40kDa15%大于80kDa10%凝胶的选择样品制备还原处理的样品和非还原处理的样品同时电泳分子量Marker的选择预染蛋白marker普通蛋白marker设立对照样品设立比对样品空质粒对照样品、整个菌液、上清、沉淀对比样品与检测样品同时电泳SDS电泳中蛋白质分子所带的电荷差异对电泳的影响是微乎其微的，可以忽略不计。SDS电泳中白质的迁移速度与其分子量大小成反比，分子量越小，迁移速度越快。电泳(SDS)10蛋白分子量胶浓度40kDa11

相关产品11

CLEARLYStainedProteinLadder3454ACLEARLYProteinLadder(Unstained)3453ATris-Glycine-SDSBuffer(TG-SDS)Powder,pH8.3T9101Tris-GlycineBuffer(TG)Powder,pH8.3T9102TaKaRaCBBProteinSafeStainT9320A以CBB为主要成分制备的蛋白质高灵敏度染色液迅速（染色5分钟后可确认蛋白质片段）使用安全不含有害物质甲醇和乙酸可使用去离子水进行脱色2×ProteinSDSPAGELoadingBuffer91724×ProteinSDSPAGELoadingBuffer9173上样loading预染Marker与非预染Marker电泳缓冲液染色液11相关产品11CLEARLYStainedProt12

电泳仪12

垂直电泳系列产品详情请见：/genepro/depshow.asp?id=1437双向电泳系列产品详情请见：/genepro/depshow.asp?id=143812电泳仪12垂直电泳系列产品详情请见：http://wWesternblot步骤13

转膜Westernblot步骤13转膜转膜14

膜的选择常用的转移膜主要有PVDF膜（Polyvinylidene-Fluoride）和硝酸纤维素膜。PVDF膜与目的蛋白的结合能力高，灵敏度高，不易破碎，同时也适用于再次标记(Reprobing)（为了增加PVD膜的亲水性，膜使用前需浸泡在甲醇中）。而硝酸纤维素膜虽不需要浸泡但极易破碎。☆膜标记好正反面转膜缓冲液Tris-GlycineBuffer(TG)Powder,pH8.3T9102转膜：蛋白质从SDS聚丙烯酰胺凝胶转移到膜上。转膜14膜的选择☆膜标记好正反面转膜缓冲液Tris-Gly15

转膜仪（转印仪）15

水平半干转印系列产品详情请见：/genepro/depshow.asp?id=1440转膜仪的选择分为半干转膜仪和湿电转膜仪。湿法转膜转膜效率高且转膜均匀，但使用的电转液液量多，需边冷却边转膜，转膜时间长（过夜）。而半干转膜法转膜时间短，只需要少量的电转液。15转膜仪（转印仪）15水平半干转印系列产品详情请见：hWesternblot步骤16

封闭Westernblot步骤16封闭封闭封闭剂的选择有时特定的封闭剂达不到预期的封闭效果。另外封闭时间过长会抑制抗原抗体反应及标记抗体的酶活性，应准备几种封闭剂进行点杂交预研讨实验选择合适的封闭剂。17

☆注意避免让膜变干封闭的作用：为了防止蛋白检测用抗体非特异性与膜结合，对未结合蛋白的膜区域进行封闭很重要。封闭封闭剂的选择17☆注意避免让膜变干封闭的作用：为了防止18

相关产品18

WesternBLoTBlockingBuffer(FishGelatin)T7131AWesternBLoTBlockingBuffer(ProteinFree）T7132A在TBS-TBuffer含有鱼源明胶的封闭缓冲液。同哺乳动物来源的奶粉和BSA相比，不会与哺乳动物来源抗体出现非特异性交叉反应。可抑制背景，能够明确地检测出抗原。不含蛋白质（ProteinFree）的化学成分封闭缓冲液。同一般的脱脂奶粉相比，可提高检测灵敏度。有效地用于检测磷酸化蛋白质。18相关产品18WesternBLoTBlockin19

洗涤洗涤液的选择一般使用PBS或TBS缓冲液。根据目的蛋白和检测试剂选择洗涤液。选择不含抑制HRP的叠氮化钠的洗涤液比较好。磷酸化蛋白质适合使用TBS缓冲液或含Tween20的TBS缓冲液。19

TrisBufferedSalinewithTween®20(TBS-T)Tablets,pH7.6T9142

ELISA、WesternBlotting的清洗Buffer或封闭Buffer。

抗体稀释。TrisBufferedSaline(TBS)Tablets,pH7.6T9141

ELISA、WesternBlotting、免疫组织染色用的清洗Buffer。

样品稀释。PhosphateBufferedSalinewithTween®20(PBS-T)Tablets,pH7.4T9183

ELISA、WesternBlotting的清洗Buffer或封闭Buffer。

抗体稀释。PhosphateBufferedSaline(PBS)Tablets,pH7.4T9181

ELISA、WesternBlotting、免疫组织染色用的清洗Buffer。

清洗细胞。

样品稀释。WesternBlotting操作过程中需洗膜，洗膜可除去未反应的试剂，抑制背景。19洗涤洗涤液的选择19TrisBufferedSa20

Westernblot步骤20

一抗孵育二抗孵育20Westernblot步骤20一抗孵育二抗孵育一抗孵育一抗的选择抗体有识别1个抗原决定簇的单克隆抗体和识别多个抗原决定簇的多克隆抗体。另外有的抗体识别一级结构，有的抗体识别立体结构，后者不能与变性或还原的蛋白质结合。制备抗体时，如果免疫原是变性蛋白，那么制备的抗体只能与变性蛋白结合，不能与天然蛋白质结合。用于WesternBlotting的一抗一般都有销售。购买抗体时要考虑以上几点，选择抗体时，对同一个抗原的不同类型抗体在产品数据上进行详细调查后再购买，尽量使用特异性高的单克隆抗体。反应方法减少失败的最好方法是将高度稀释的低浓度抗体溶液添加到托盘中，放入膜后，4℃缓慢摇动过夜孵育。如果抗体使用量有限制，建议使用杂交袋，使用杂交袋时要确保不能有气泡。21

使用一抗进行目的蛋白的检测。一抗孵育一抗的选择21使用一抗进行目的蛋白的检测。抗体查询22

http://www.takara-bio.co.jp/antibody_search/antibody_search.php抗体种类细胞间连接、钙粘着蛋白抗体细胞外基质关联骨代谢关联血小板关联信号传导关联等疾病相关抗体（IBL）His标签抗体抗体查询22http://www.takara-bio.c二抗孵育二抗的选择可从不同宿主获得的二抗，如果背景较高，使用另一种宿主的二抗可减少背景。还销售宿主以外的对动物种属来源血清蛋白进行吸收操作的抗体。确认动物种属后根据检测方法选择合适的抗体。一般使用HRP（辣根过氧化物酶）标记的二抗进行化学发光检测的方法。其它还有使用AP（碱性磷酸酶）标记抗体（对发光物质进行检测）、荧光物质及放射性同位素标记的二抗。23

使用二抗进行一抗的检测。二抗孵育前应进行点杂交预实验，研讨二抗的正确使用量。二抗孵育二抗的选择23使用二抗进行一抗的检测。二抗孵育前应Westernblot快速检出试剂（二抗替代物）

--WesternBLoTRapidDetectv2.024

短时间内有效的进行抗体反应，可以使用Rapid操作方法提高检出感度，

IgGDetector标

记50个HRP分子

增加信号强度。动物种HRP标记二抗替代物（检测MouseIgG时需要使用Enhancer，不能替代goatIgG、humanIgG3二抗）WesternBLoTRapidDetectv2.0T7122A50次3170元Westernblot快速检出试剂（二抗替代物）

Westernblot步骤25

检测化学发光

检测Westernblot步骤25检测化学发光

检测检测(化学发光・显色)按照各试剂的操作流程进行重复操作，研讨最佳实验条件。将转膜后的膜放置在保鲜膜上，将检测试剂滴加在膜上，确保试剂均匀覆盖在膜上。因目的蛋白的浓度和使用的抗体浓度不同，胶片曝光条件也不同，因此要进行预研讨实验。在发光持续时间内可改变胶片曝光条件进行多次检测。26

检测方法有化学发光法和显色法。显色法操作简便，但化学发光检测法检测灵敏度高，一般经常使用化学发光检测法。化学发光检测法是利用基质被二抗的HRP分解时生成的有色物对目的蛋白的有无及蛋白量进行检测。检测(化学发光・显色)按照各试剂的操作流程进行重复操作，研讨相关产品—化学发光27

产品名称Code包装量价格（元）检出灵敏度概要检测方法WesternBLoTChemiluminescenceHRPSubstrateT7101A250ml1,600pg级其他公司同等产品发光强度比较XfilmWesternBLoTQuantHRPSubstrateT7102A100ml2,050低pg级发光持续而稳定CCD成像、XfilmWesternBLoTHyperHRPSubstrateT7103A100ml2,500中fg级检出灵敏度的比较CCD成像、XfilmWesternBLoTUltra

SensitiveHRPSubstrateT7104A100ml4,130低fg级检出灵敏度和抗体用量CCD成像、Xfilm相关产品—化学发光27产品名称Code包装量价格检出灵敏度28

发光强度比较28

WesternBLoTChemiluminescentHRPSubstrate（Code：T7101A）同其他公司同等HRP反应基质制品比较，利用HRP标记二抗（39~5,000pg）进行slotblot检测发光信号。抗体：GoatAnti-MouseIgG(H+L)Peroxidaseconjugated膜：nitrocellulose使用WesternBLoTChemiluminescentHRPSubstrate可高灵敏度地检测出清晰的信号（曝光时间：5秒、Xfilm。本公司数据）明亮的发光信号28发光强度比较28WesternBLoTChemi29

发光持续而稳定29

稳定发光持续时间长使用WesternBLoTQuantHRPSubstrate（制品Code：T7102A）利用slotblot方法可以确认发光的持续性sample：人Transferrin，200ng起始2倍梯度稀释一抗：Goatanti-HumanTransferrinAffinityPurified二抗：AffinityPurifiedAntibody-Anti-GoatIgG(H+L)Peroxidaselabeled从反应开始90min，发光还持续稳定，一次反应也可重复进行曝光检测。本公司数据29发光持续而稳定29稳定发光持续时间长使用Wester30

检出灵敏度比较30

使用少量抗体，可进行高灵敏度检出HeLa细胞裂解液梯度稀释后作为样品，改变抗体使用量，western

blot检测出GAPDH。sample：HeLa细胞裂解液总蛋白，从10μg起始2倍梯度稀释一抗：Anti-Glyceraldehyde-3-PhosphateDehydrogenase,clone6C5（1mg/ml）二抗：PierceGoatAnti-MouseIgG(H+L)Peroxidaseconjugated（0.8mg/ml）<抗体的稀释倍数>使用WesternBLoTHyper

Substrate（T7103A）更少的抗体量也可以检出本公司数据30检出灵敏度比较30使用少量抗体，可进行高灵敏度检出H31

检出灵敏度和抗体使用量Hela细胞裂解液梯度稀释的样品，SDS电泳后，根据制品的灵敏度调整抗体稀释倍数，Westernblot检出GAPDH。31

Sample：HeLa细胞裂解液总蛋白，从10μg起始2倍梯度稀释一抗：Anti-Glyceraldehyde-3-PhosphateDehydrogenase,clone6C5（1mg/ml）（MerckMillipore）二抗：PierceGoatAnti-MouseIgG(H+L)Peroxidaseconjugated（0.8mg/ml）使用WesternBLoTUltraSensitive即使减少抗体使用量也可进行高灵敏度检测本公司数据31检出灵敏度和抗体使用量Hela细胞裂解液梯度稀释的样品32

检测增强剂32

适用于包括Western印迹和ELISA在内的各种免疫检测可提高最终的检测灵敏度(从数倍到数十倍)不影响辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶(AP)活性兼容于交联二抗的酶和使用任何一种检测方法(如：比色检测法或发光检测法)检测HumanTransferrin（各种抗体稀释液使用情况比较）1TBS-T2WesternBLoTImmunoBooster（code：T7111A）3A社反応促進試薬4WesternBLoTImmunoBoosterPF（code：T7115A）抗体稀释：抗体稀释溶液情况如下：

ImmunoBooster本公司数据32检测增强剂32适用于包括Western印迹和ELIS33

检测系统33

生物发光检测(冷光仪)系统详情请见：/genepro/depshow.asp?id=145033检测系统33生物发光检测(冷光仪)系统详情请见：洗膜·重新标记34

Western进行了膜上的一抗及二抗的消除试剂相对温和的条件下（室温，30分）的反应WesternBLoTStrippingBuffer

T7135A1HeLaCellLysate10μg2HeLaCellLysate5μg3HeLaCellLysate2μg4HeLaCellLysate1.25μg5HeLaCellLysate0.625μg1．β-actinの検出（第一次抗原・抗体反应）Stripping（条件:室温、30分、0.25ml/cm2membrane）2．GAPDHの検出（第二次抗原・抗体反应）Stripping（条件:室温、30分、0.25ml/cm2membrane）3．α-Tubulinの検出（第三次抗原・抗体反应）4．残存抗体の検出Stripping（条件:室温、30分、0.25ml/cm2membrane）本公司数据洗膜·重新标记34Western进行了膜上的一抗及二抗的消35

常见技术问答有污渍或斑点，整体背景普遍偏高出现白色条带出现非特异性条带信号弱或无信号膜上部分无信号条带扩散35

35常见技术问答有污渍或斑点，整体背景普遍偏高3536

洗膜不充分使用的膜有问题封闭不充分使用的封闭剂不适合封闭剂与一抗或二抗有交叉反应实验器具有污染缓冲液有污染曝光时间过长抗体浓度过高HRP标记抗体发生

凝集使用杂交袋进行抗体孵育时，杂交袋内有残留气泡转膜抗体封闭其他有污渍或斑点，整体背景普遍偏高36洗膜不充分封闭不充分实验器具有污染抗体浓度过高转膜抗体37

20132015201401抗原、抗体检测0203蛋白抗体量不充分标记抗体失活膜上的抗原分解发光底物孵育时间过短曝光时间过短发光底物劣化蛋白质转膜不成功目的蛋白质量较差蛋白制备过程中降解膜上保存的蛋白质分解目的蛋白blocking后被屏蔽洗膜、重新标记洗膜、重新标记信号弱或无信号WesternBLoTImmunoBooster（codeT7111A）WesternBLoTRapidDetectv2.0（codeT7122A）3720132015201401抗原、抗体检测0203其他常见问题38

膜上部分无信号转膜不完全出现白色条带抗体浓度过高出现非特异性条带抗体浓度过高SDS对蛋白质的非特异性吸附条带扩散抗体浓度过高电泳用的蛋白量过高其他问题其他常见问题38膜上部分无信号转膜不完全出现白色条带抗体浓相关产品方法名称Code包装量价格（元）特点BCA法TaKaRaBCAProteinAssayKitT9300A500次700不受蛋白质种类的影响，在0.02～2mg/ml浓度范围内蛋白质浓度与吸光度值成线性关系；对表面活性剂的干扰影响小；2种操作方法（标准操作方法；低浓度测定操作方法）Bradford法TaKaRaBradfordProteinAssayKitT9310A500次500操作简便，可快速地对浓度范围在1～1,000μg/ml的蛋白质溶液进行定量。可对含有还原剂的样品进行测定；2种操作方法（标准操作方法；低浓度测定操作方法）39

相关产品方法名称Code包装量价格（元）特点BCA法TaKa特别推荐蛋白定量名称Code包装量价格（元）优惠价（元）TaKaRaBCAProteinAssayKitT9300A500次（1ml）2500次（0.2ml）700560TaKaRaBradfordProteinAssayKitT9310A500次（1ml）2500次（0.2ml）500400最佳拍档WesternBLoTBlockingBuffer(ProteinFree） T7132A+WesternBLoTImmunoBoosterPF（code：T7115A）特别推荐蛋白定量名称Code包装量价格（元）优惠价（元）Ta特别推荐TaKaRaCBBProteinSafeStainT9320A安全：水脱色，不需配置脱色液快速：常规操作，1小时脱色SDS染色液抗体剥离剂WesternBLoTStrippingBuffer

T7135A特别推荐TaKaRaCBBProteinSafeSt特别推荐产品名称Code包装量价格（元）检出灵敏度概要检测方法WesternBLoTChemiluminescenceHRPSubstrateT7101A250ml1,600pg级其他公司同等产品发光强度比较XfilmWesternBLoTQuantHRPSubstrateT7102A100ml2,050低pg级发光持续而稳定CCD成像、XfilmWesternBLoTHyperHRPSubstrateT7103A100ml2,500中fg级检出灵敏度的比较CCD成像、XfilmWesternBLoTUltra

SensitiveHRPSubstrateT7104A100ml4,130低fg级检出灵敏度和抗体用量CCD成像、Xfilm特别推荐产品名称Code包装量价格检出灵敏度概要检测方法WeTakara-实验技能讲座之Western-blot课件蛋白相关产品介绍--WesternBlot上海皓嘉科技发展有限公司蛋白相关产品介绍--WesternBlot上海皓嘉科技发展什么是Westernblot？45

免疫印迹（immunoblotting）又称蛋白质印迹（westernblot），它是根据抗原抗体的特异性结合，检测复杂样品中的某种蛋白质的方法。westernblot是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种新的免疫生化技术。由于免疫印迹具有SDS的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性，现已成为蛋白分析的一种常规技术。用途：常用于鉴定某种蛋白，并能对蛋白的丰度进行定性和半定量分析。HRP标记的二抗HRP底物(Luminol)化学发光

信号什么是Westernblot？2免疫印迹（immunoWesternblot步骤46

Westernblot步骤3样品制备47

细胞裂解蛋白纯化蛋白定量样品制备4细胞蛋白蛋白细胞裂解48

xTractorBuffer635656xTractorBufferKit635623裂解细胞种类：Bacterialcells、MammaliancellsYeastcells、Baculovirus-infectedcellsYeastProteinExtractionReagent9780酵母总蛋白质提取试剂简捷、快速的提取酵母菌总蛋白质的试剂蛋白酶抑制剂ProteoGuard™EDTA-FreeProteaseInhibitorCocktail635672Calpastatin7316细胞裂解液Calpain竞争性抑制剂细胞裂解：比较常用超声波破碎法和酶溶破碎法。细胞裂解5xTractorBuffer635656xTr49

蛋白纯化高特异性的Co2+树脂：TALON系列高产量的Ni2+树脂：His60Ni系列49

组氨酸标签融合蛋白质的纯化6蛋白纯化高特异性的Co2+树脂：TALON系列6组氨酸蛋白定量方法灵敏度时间原理干扰物质说明产品紫外吸收法20-100mg/ml快速

5-10分钟蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基在280nm处的光吸收各种嘌呤和嘧啶；各种核苷酸干扰物质较多Bradford法1-1000μg/ml快速

5分钟考马斯染料与蛋白质结合后，溶液的颜色发生变化。这种颜色的变化与溶液中的蛋白质浓度成正比。表面活性剂：TritonX-100；SDS操作简便；可对含有还原剂的样品进行测定；颜色稳定；颜色深浅随不同蛋白质变化。TaKaRaBradfordProteinAssayKit（T9310A）BCA法0.02-2mg/ml较快速

30分钟内二价铜离子(Cu+2)在碱性条件下被蛋白质的肽键还原成一价铜离子(Cu+)，两个分子的BCA络合一个一价铜离子(Cu+)，形成一种在562nm处有强吸收值的紫色复合物。螯合剂、还原剂：EDTA、EGTA、β-巯基乙醇不受蛋白质种类的影响；对表面活性剂的干扰影响小。TaKaRaBCAProteinAssayKit（T9300A）50

蛋白定量方法灵敏度时间原理干扰物质说明产品紫外吸收法20-151

相关产品方法名称Code包装量价格（元）特点BCA法TaKaRaBCAProteinAssayKitT9300A500次700不受蛋白质种类的影响，在0.02～2mg/ml浓度范围内蛋白质浓度与吸光度值成线性关系；对表面活性剂的干扰影响小；2种操作方法（标准操作方法；低浓度测定操作方法）Bradford法TaKaRaBradfordProteinAssayKitT9310A500次500操作简便，可快速地对浓度范围在1～1,000μg/ml的蛋白质溶液进行定量。可对含有还原剂的样品进行测定；2种操作方法（标准操作方法；低浓度测定操作方法）51

8相关产品方法名称Code包装量价格（元）特点BCA法Ta52

Westernblot步骤52

电泳9Westernblot步骤9电泳电泳(SDS)53

蛋白分子量胶浓度

40kDa～80kDa12.5%小于40kDa15%大于80kDa10%凝胶的选择样品制备还原处理的样品和非还原处理的样品同时电泳分子量Marker的选择预染蛋白marker普通蛋白marker设立对照样品设立比对样品空质粒对照样品、整个菌液、上清、沉淀对比样品与检测样品同时电泳SDS电泳中蛋白质分子所带的电荷差异对电泳的影响是微乎其微的，可以忽略不计。SDS电泳中白质的迁移速度与其分子量大小成反比，分子量越小，迁移速度越快。电泳(SDS)10蛋白分子量胶浓度40kDa54

相关产品54

CLEARLYStainedProteinLadder3454ACLEARLYProteinLadder(Unstained)3453ATris-Glycine-SDSBuffer(TG-SDS)Powder,pH8.3T9101Tris-GlycineBuffer(TG)Powder,pH8.3T9102TaKaRaCBBProteinSafeStainT9320A以CBB为主要成分制备的蛋白质高灵敏度染色液迅速（染色5分钟后可确认蛋白质片段）使用安全不含有害物质甲醇和乙酸可使用去离子水进行脱色2×ProteinSDSPAGELoadingBuffer91724×ProteinSDSPAGELoadingBuffer9173上样loading预染Marker与非预染Marker电泳缓冲液染色液11相关产品11CLEARLYStainedProt55

电泳仪55

垂直电泳系列产品详情请见：/genepro/depshow.asp?id=1437双向电泳系列产品详情请见：/genepro/depshow.asp?id=143812电泳仪12垂直电泳系列产品详情请见：http://wWesternblot步骤56

转膜Westernblot步骤13转膜转膜57

膜的选择常用的转移膜主要有PVDF膜（Polyvinylidene-Fluoride）和硝酸纤维素膜。PVDF膜与目的蛋白的结合能力高，灵敏度高，不易破碎，同时也适用于再次标记(Reprobing)（为了增加PVD膜的亲水性，膜使用前需浸泡在甲醇中）。而硝酸纤维素膜虽不需要浸泡但极易破碎。☆膜标记好正反面转膜缓冲液Tris-GlycineBuffer(TG)Powder,pH8.3T9102转膜：蛋白质从SDS聚丙烯酰胺凝胶转移到膜上。转膜14膜的选择☆膜标记好正反面转膜缓冲液Tris-Gly58

转膜仪（转印仪）58

水平半干转印系列产品详情请见：/genepro/depshow.asp?id=1440转膜仪的选择分为半干转膜仪和湿电转膜仪。湿法转膜转膜效率高且转膜均匀，但使用的电转液液量多，需边冷却边转膜，转膜时间长（过夜）。而半干转膜法转膜时间短，只需要少量的电转液。15转膜仪（转印仪）15水平半干转印系列产品详情请见：hWesternblot步骤59

封闭Westernblot步骤16封闭封闭封闭剂的选择有时特定的封闭剂达不到预期的封闭效果。另外封闭时间过长会抑制抗原抗体反应及标记抗体的酶活性，应准备几种封闭剂进行点杂交预研讨实验选择合适的封闭剂。60

☆注意避免让膜变干封闭的作用：为了防止蛋白检测用抗体非特异性与膜结合，对未结合蛋白的膜区域进行封闭很重要。封闭封闭剂的选择17☆注意避免让膜变干封闭的作用：为了防止61

相关产品61

WesternBLoTBlockingBuffer(FishGelatin)T7131AWesternBLoTBlockingBuffer(ProteinFree）T7132A在TBS-TBuffer含有鱼源明胶的封闭缓冲液。同哺乳动物来源的奶粉和BSA相比，不会与哺乳动物来源抗体出现非特异性交叉反应。可抑制背景，能够明确地检测出抗原。不含蛋白质（ProteinFree）的化学成分封闭缓冲液。同一般的脱脂奶粉相比，可提高检测灵敏度。有效地用于检测磷酸化蛋白质。18相关产品18WesternBLoTBlockin62

洗涤洗涤液的选择一般使用PBS或TBS缓冲液。根据目的蛋白和检测试剂选择洗涤液。选择不含抑制HRP的叠氮化钠的洗涤液比较好。磷酸化蛋白质适合使用TBS缓冲液或含Tween20的TBS缓冲液。62

TrisBufferedSalinewithTween®20(TBS-T)Tablets,pH7.6T9142

ELISA、WesternBlotting的清洗Buffer或封闭Buffer。

抗体稀释。TrisBufferedSaline(TBS)Tablets,pH7.6T9141

ELISA、WesternBlotting、免疫组织染色用的清洗Buffer。

样品稀释。PhosphateBufferedSalinewithTween®20(PBS-T)Tablets,pH7.4T9183

ELISA、WesternBlotting的清洗Buffer或封闭Buffer。

抗体稀释。PhosphateBufferedSaline(PBS)Tablets,pH7.4T9181

ELISA、WesternBlotting、免疫组织染色用的清洗Buffer。

清洗细胞。

样品稀释。WesternBlotting操作过程中需洗膜，洗膜可除去未反应的试剂，抑制背景。19洗涤洗涤液的选择19TrisBufferedSa63

Westernblot步骤63

一抗孵育二抗孵育20Westernblot步骤20一抗孵育二抗孵育一抗孵育一抗的选择抗体有识别1个抗原决定簇的单克隆抗体和识别多个抗原决定簇的多克隆抗体。另外有的抗体识别一级结构，有的抗体识别立体结构，后者不能与变性或还原的蛋白质结合。制备抗体时，如果免疫原是变性蛋白，那么制备的抗体只能与变性蛋白结合，不能与天然蛋白质结合。用于WesternBlotting的一抗一般都有销售。购买抗体时要考虑以上几点，选择抗体时，对同一个抗原的不同类型抗体在产品数据上进行详细调查后再购买，尽量使用特异性高的单克隆抗体。反应方法减少失败的最好方法是将高度稀释的低浓度抗体溶液添加到托盘中，放入膜后，4℃缓慢摇动过夜孵育。如果抗体使用量有限制，建议使用杂交袋，使用杂交袋时要确保不能有气泡。64

使用一抗进行目的蛋白的检测。一抗孵育一抗的选择21使用一抗进行目的蛋白的检测。抗体查询65

http://www.takara-bio.co.jp/antibody_search/antibody_search.php抗体种类细胞间连接、钙粘着蛋白抗体细胞外基质关联骨代谢关联血小板关联信号传导关联等疾病相关抗体（IBL）His标签抗体抗体查询22http://www.takara-bio.c二抗孵育二抗的选择可从不同宿主获得的二抗，如果背景较高，使用另一种宿主的二抗可减少背景。还销售宿主以外的对动物种属来源血清蛋白进行吸收操作的抗体。确认动物种属后根据检测方法选择合适的抗体。一般使用HRP（辣根过氧化物酶）标记的二抗进行化学发光检测的方法。其它还有使用AP（碱性磷酸酶）标记抗体（对发光物质进行检测）、荧光物质及放射性同位素标记的二抗。66

使用二抗进行一抗的检测。二抗孵育前应进行点杂交预实验，研讨二抗的正确使用量。二抗孵育二抗的选择23使用二抗进行一抗的检测。二抗孵育前应Westernblot快速检出试剂（二抗替代物）

--WesternBLoTRapidDetectv2.067

短时间内有效的进行抗体反应，可以使用Rapid操作方法提高检出感度，

IgGDetector标

记50个HRP分子

增加信号强度。动物种HRP标记二抗替代物（检测MouseIgG时需要使用Enhancer，不能替代goatIgG、humanIgG3二抗）WesternBLoTRapidDetectv2.0T7122A50次3170元Westernblot快速检出试剂（二抗替代物）

Westernblot步骤68

检测化学发光

检测Westernblot步骤25检测化学发光

检测检测(化学发光・显色)按照各试剂的操作流程进行重复操作，研讨最佳实验条件。将转膜后的膜放置在保鲜膜上，将检测试剂滴加在膜上，确保试剂均匀覆盖在膜上。因目的蛋白的浓度和使用的抗体浓度不同，胶片曝光条件也不同，因此要进行预研讨实验。在发光持续时间内可改变胶片曝光条件进行多次检测。69

检测方法有化学发光法和显色法。显色法操作简便，但化学发光检测法检测灵敏度高，一般经常使用化学发光检测法。化学发光检测法是利用基质被二抗的HRP分解时生成的有色物对目的蛋白的有无及蛋白量进行检测。检测(化学发光・显色)按照各试剂的操作流程进行重复操作，研讨相关产品—化学发光70

产品名称Code包装量价格（元）检出灵敏度概要检测方法WesternBLoTChemiluminescenceHRPSubstrateT7101A250ml1,600pg级其他公司同等产品发光强度比较XfilmWesternBLoTQuantHRPSubstrateT7102A100ml2,050低pg级发光持续而稳定CCD成像、XfilmWesternBLoTHyperHRPSubstrateT7103A100ml2,500中fg级检出灵敏度的比较CCD成像、XfilmWesternBLoTUltra

SensitiveHRPSubstrateT7104A100ml4,130低fg级检出灵敏度和抗体用量CCD成像、Xfilm相关产品—化学发光27产品名称Code包装量价格检出灵敏度71

发光强度比较71

WesternBLoTChemiluminescentHRPSubstrate（Code：T7101A）同其他公司同等HRP反应基质制品比较，利用HRP标记二抗（39~5,000pg）进行slotblot检测发光信号。抗体：GoatAnti-MouseIgG(H+L)Peroxidaseconjugated膜：nitrocellulose使用WesternBLoTChemiluminescentHRPSubstrate可高灵敏度地检测出清晰的信号（曝光时间：5秒、Xfilm。本公司数据）明亮的发光信号28发光强度比较28WesternBLoTChemi72

发光持续而稳定72

稳定发光持续时间长使用WesternBLoTQuantHRPSubstrate（制品Code：T7102A）利用slotblot方法可以确认发光的持续性sample：人Transferrin，200ng起始2倍梯度稀释一抗：Goatanti-HumanTransferrinAffinityPurified二抗：AffinityPurifiedAntibody-Anti-GoatIgG(H+L)Peroxidaselabeled从反应开始90min，发光还持续稳定，一次反应也可重复进行曝光检测。本公司数据29发光持续而稳定29稳定发光持续时间长使用Wester73

检出灵敏度比较73

使用少量抗体，可进行高灵敏度检出HeLa细胞裂解液梯度稀释后作为样品，改变抗体使用量，western

blot检测出GAPDH。sample：HeLa细胞裂解液总蛋白，从10μg起始2倍梯度稀释一抗：Anti-Glyceraldehyde-3-PhosphateDehydrogenase,clone6C5（1mg/ml）二抗：PierceGoatAnti-MouseIgG(H+L)Peroxidaseconjugated（0.8mg/ml）<抗体的稀释倍数>使用WesternBLoTHyper

Substrate（T7103A）更少的抗体量也可以检出本公司数据30检出灵敏度比较30使用少量抗体，可进行高灵敏度检出H74

检出灵敏度和抗体使用量Hela细胞裂解液梯度稀释的样品，SDS电泳后，根据制品的灵敏度调整抗体稀释倍数，Westernblot检出GAPDH。74

Sample：HeLa细胞裂解液总蛋白，从10μg起始2倍梯度稀释一抗：Anti-Glyceraldehyde-3-PhosphateDehydrogenase,clone6C5（1mg/ml）（MerckMillipore）二抗：PierceGoatAnti-MouseIgG(H+L)Peroxidaseconjugated（0.8mg/ml）使用WesternBLoTUltraSensitive即使减少抗体使用量也可进行高灵敏度检测本公司数据31检出灵敏度和抗体使用量Hela细胞裂解液梯度稀释的样品75

检测增强剂75

适用于包括Western印迹和ELISA在内的各种免疫检测可提高最终的检测灵敏度(从数倍到数十倍)不影响辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶(AP)活性兼容于交联二抗的酶和使用任何一种检测方法(如：比色检测法或发光检测法)检测HumanTransferrin（各种抗体稀释液使用情况比较）1TBS-T2WesternBLoTImmunoBooster（code：T7111A）3A社反応促進試薬4WesternBLoTImmunoBoosterPF（code：T7115A）抗体稀释：抗体稀释溶液情况如下：

ImmunoBooster本公司数据32检测增强剂32适用于包括Western印迹和ELIS76

检测系统76

生物发光检测(冷光仪)系统详情请见：/genepro/depshow.asp?id=145033检测系统33生物发光检测(冷光仪)系统详情请见：洗膜·重新标记77

Western进行了膜上的一抗及二抗的消除试剂相对温和的条件下（室温，30分）的反应WesternBLoTStrippingBuffer

T7135A1HeLaCellLysate10μg2HeLaCellLysate5μg3HeLaCellLysate2μg4HeLaCellLysate1.25μg5HeLaCellLysate0.625μg1．β-actinの検出（第一次抗原・抗体反应）Stripping（条件:室温、30分、0.25ml/cm2membrane）2．GAPDHの検出（第二次抗原・抗体反应）Stripping（